机体受到电离辐射照射后, 可以使很多生物活性物质特别是生物大分子受到损伤, 其中最重要的是细胞核中的DNA, 损伤的DNA如不能完全修复则可能引起相关的基因突变。单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis, SCGE)技术是一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法, 能够灵敏地检测DNA断裂。本实验采用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术, 检测大鼠经不同累积剂量和不同剂量率的晚期混合裂变产物内照射后外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的DNA损伤情况, 为SCGE作为低剂量核辐射的生物剂量计提供实验基础。

1 材料与方法 1.1 放射性核素

晚期混合裂变产物原液放射性比活度为1.82×10⁷ Bq/ml, 其主要组分及放射性活度比例分别为⁹⁰Sr 26.82%;¹³⁷Cs 73.15%;¹⁴⁴Ce-¹⁴⁴Pr 0.002%;¹⁰⁶Ru-¹⁰⁶Rh 0.02%;⁹⁵Zr-⁹⁵Nb极微量。

1.2 实验动物分组及处理

实验动物为健康雄性Wistar大鼠, 体重(141.5±12.99)g, 共48只。随机分成1个对照组, 4个不同累积剂量实验组和4个不同剂量率组(其中1个剂量率组与累积剂量组重叠), 每组6只。①对照组:大鼠尾静脉注入生理盐水(pH3.0), 注射量为0.5ml/100 g体重。注入后1 d断尾取血。②不同累积剂量实验组:大鼠尾静脉注入放射性活度浓度为3.402 3×10⁵ Bq/ml的晚期混合裂变产物, 注射量同①, 注入后3, 9, 15, 21 d断尾取血。③不同剂量率组:4组大鼠尾静脉分别注入放射性活度浓度为13.609 0×10⁵ Bq/ml, 6.804 5×10⁵ Bq/ml, 3.402 3×10⁵ Bq/ml, 1.701 7×10⁵ Bq/ml的晚期混合裂变产物, 注射量同①, 当达到相似的累积剂量后, 即注入后2, 4.3, 9, 21.9 d断尾取血。

1.3 SCGE检测 1.3.1 单细胞悬液制备

取肝素抗凝的外周血100 μl作为SCGE检测的PBMC(包括淋巴细胞和单核细胞)。

1.3.2 制片

采用“三明治”凝胶法, 先将铺在磨砂载玻片上的0.5%正常熔点凝胶85 μl刮掉, 再在玻片上铺第1层即5%正常熔点凝胶85 μl, 然后将75 μl 0.7%低熔点凝胶与等体积细胞悬液混匀铺第2层, 最后用0.7%低熔点凝胶85 μl铺第3层。

1.3.3 细胞裂解

将玻片浸于新鲜配制的碱性裂解液(含10%DMSO, 1%Triton X-100等)中, 4 ℃裂解2 h。

1.3.4 电泳

将玻片取出放入电泳槽平板上, 先置于新配制的电泳液(含1mmol/L Na₃-EDTA, 0.3mmol/l NaOH)中解螺旋20 min, 然后在300 mA, 25 V条件下电泳20 min。

1.3.5 中性化

用Tris-HCl缓冲液(pH=7.5)中性化3次, 每次间隔5 min。

1.3.6 染色

每张片子用2 μg/ml的EB染液100 μL染色, 封片后立即阅片。

1.3.7 图像分析

在Olympus荧光显微镜下, 观察单细胞电泳图像。每张片子至少观察40个细胞, 用目镜测微尺测量核DNA的长度(精确度为0.1 μm)。

1.4 统计分析

用SAS6.12软件对各不同累积剂量组和各不同剂量率组之间的差异进行分析。

2 结果 2.1 不同累积剂量晚期混合裂变产物对大鼠PBMC细胞DNA的损伤效应

大鼠经不同累积剂量晚期混合裂变产物作用后, PBMCDNA链断裂的迁移情况见表 1和图 1。结果可见, PBMCDNA的迁移距离在各个累积剂量组均高于对照组(P＜0.05), 且随着累积剂量的增加, 迁移长度也增加, 显示良好的剂量效应关系。进行相关分析, 相关系数r为0.987(P＜0.05), 拟合的剂量效应模型符合直线方程为y=0.367x+21.533, R²=0.974(见图 2)。

2.2 晚期混合裂变产物不同剂量率对大鼠PBMC细胞DNA的损伤效应

不同剂量率的晚期混合裂变产物作用于大鼠后, 检测到的PBMCDNA的损伤情况见表 2和图 1。除8.176 4 mGy/d剂量率组, 其余各剂量率组PBMC DNA的迁移距离均高于对照组(P＜0.05), 且随着剂量率的增加, 迁移长度也增加, 有良好的剂量率效应关系。进行相关分析, 相关系数r为0.932(P＜0.05), 直线拟合后, 求得回归方程为y=0.138x+22.07, R²=0.870(见图 3)。

3 讨论

单细胞凝胶电泳(SCGE)即彗星试验是近几十年发展起来的一种灵敏、快速、高效的检测DNA断裂的技术, 已广泛的应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面^[1]。如果细胞未受损伤, 电泳时, 核DNA因其分子量大停留在核基质中, 荧光染色后呈现圆形的荧光团, 无拖尾现象。若细胞受损, 在碱性电泳液中, DNA双链解螺旋且碱变性为单链, 由于单链断裂的碎片分子量小, 电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移, 形成拖尾, 即彗星图像。细胞DNA受损愈重, 产生的断链或断片就愈多, 其断链或断片也就愈小, 在相同电泳条件下DNA迁移的距离就愈长。因此, 通过测定DNA迁移长度可定量的测定DNA损伤程度, 确定电离辐射剂量或剂量率与DNA损伤效应之间的关系。

Kent^[2]等用SCGE检测了CHO-K1细胞的DNA损伤情况, 发现彗星长度与照射剂量间有良好的线性关系。另有研究表明, 0.05Gy~5.0Gy离体照射条件下, 淋巴细胞彗星长度随照射剂量增加而增大, 符合线性平方模型^{[3, 4]}。在本实验中, 可见到典型的彗星图象, 如图 1(b), 但大部分是呈球形膨胀的图象, 如图 1(c)、(d), 故测量的是核DNA长度而不是核DNA拖尾的距离。出现这种情况可能与内照射的复杂性及持续性有关。本研究发现不同累积剂量组和不同剂量率组PBMC的DNA迁移长度增加, 且随累积剂量或剂量率的增大而增加, 显示良好的剂量效应关系和剂量率效应关系, 符合直线模型。在探讨SCGE检测PBMC的DNA损伤作为早期生物学效应的分子生物标志物时, 由于内照射的特殊性, 研究较少, 本实验在放射性核素内照射条件下, 得出了良好的剂量效应关系和剂量率效应关系, 为SCGE作为低剂量辐射的生物剂量计提供了实验基础。