Gen是大豆异黄酮的主要成分之一, 化学名称为5, 7, 4'-三羟异黄酮。Gen具有广泛的生物学作用, 如抑制肿瘤、抗骨质疏松、抗心血管疾病等, 因此受到普遍关注。最近的研究文献表明, Gen对紫外线损伤有防护作用, 可以使紫外线诱发的皮肤炎症反应减轻[1], DNA 8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)形成减少[2]。Gen是良好的自由基清除剂, 对·OH自由基的清除能力比较强[3]。而电离辐射对机体损伤的主要途径之一也是产生过量自由基, 因此Gen可能对电离辐射损伤具有保护作用。我们根据抗辐射功能食品评价程序和检验方法的要求, 用致死剂量(7.5 Gy)γ射线照射小鼠, 观察补充Gen对照射小鼠损伤的保护作用; 用中等剂量(4.0 Gy)γ射线照射小鼠, 探讨其作用机制, 为今后抗辐射功能食品的开发提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物清洁级雄性昆明小鼠, 体重18 ~ 22 g, 由军事医学科学院实验动物中心提供, 许可证号: SCXK-(军)2002-001。
1.2 Gen西安奥塞斯生物有限公司, 纯度≥95 %。
1.3 照射条件中国医学科学院放射医学研究所137Cs射线源, 一次性全身照射, 吸收剂量率为0.775 ~ 0.760 Gy/分。
1.4 实验方法实验分两部分。
1.4.1 实验一实验小鼠适应性喂养后, 按体重随机分五组:照射对照组, 喂正常合成饲料(饲料配方参照AIN-96), 四个实验组, 即Gen1、Gen2、Gen3和Gen4组, 分别在正常饲料的基础上补充0.2 ‰, 0.4 ‰, 0.8 ‰, 1.2 ‰的Gen。喂养14 d, 7.5Gy γ射线照射, 观察记录小鼠30 d活存数量, 计算活存率和死亡小鼠平均活存时间及保护系数k[4]。
1.4.2 实验二实验小鼠适应性喂养后, 按体重随机分四组, 每组8只:正常对照组、照射对照组和两个实验组, 正常对照组和照射对照组喂正常饲料, 两个实验组在正常饲料中添加0.4 ‰和0.8 ‰的Gen。喂养14 d, 4.0 Gy γ射线照射, 照射后7 d, 小鼠尾静脉取血, 常规计数白细胞、淋巴细胞、血小板; 处死小鼠, 取出小鼠脾脏, 置于bouin's液24 h后, 清水冲洗, 肉眼计数表面结节, 即内源性脾结节; 取左侧股骨, 用1 ml 3 %醋酸溶液冲洗骨髓腔, 计数BMC; 取右侧股骨, 按文献[5]介绍的方法测定骨髓嗜多染红细胞微核率。
1.5 统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示, 组间差异显著性采用t检验或卡方检验, 微核率采用Poission分布直接计算概率。
2 结果 2.4 Gen对小鼠存活的影响小鼠受到照射后食欲下降, 活动减少, 但皮肤毛发未见粪便和分泌物等污秽的表现, 耳廓及尾部苍白, 部分小鼠耳廓出现出血斑。受照射小鼠多在7 ~ 14 d死亡; 补充Gen可以提高照射小鼠的活存率, Gen的剂量从0.2 ‰到0.8 ‰时保护系数均超过1.2, 并有剂量效应关系。说明Gen对辐射损伤有明显的保护作用。Gen对小鼠存活的影响详见表 1。
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表 1 染料木黄酮对照射小鼠存活的影响 |
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表 2 Gen对照射小鼠血液系统的影响(x±s) |
小鼠受到照射后血细胞计数、骨髓有核细胞计数均明显降低, 补充Gen可使其比对照组明显升高, 有统计学意义; 并且脾结节数较照射对照组也有明显提高, 差异有显著性, P＜0.05。
2.6 Gen对照射小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响(表 3)|
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表 3 Gen对照射小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响 |
小鼠受到照射后有微核的骨髓嗜多染红细胞数较正常组明显增加, 微核率升高; 补充Gen后可显著降低微核的形成, 使其更接近正常组水平。
3 讨论我们观察到饲料中补充Gen, 可增加受到7.5 Gy γ射线照射小鼠30 d存活率和延长死亡小鼠的存活时间, 与照射对照组相比, 提高存活率可达20.6 %, 差异有非常显著性, 保护系数达1.44。存活率和存活时间是反映抗辐射作用的最基本最客观的指标, 因为抗辐射的最终目的就是为了提高存活率和延长存活时间。我们的实验结果表明Gen对γ射线照射小鼠有保护作用。
中等剂量射线作用后, 主要遭受严重损伤的是以骨髓为代表的造血器官。照射使造血功能受抑, 出现造血系统的早期辐射效应:造血干细胞减少, 增殖不力, 造血微环境调控失调, 造血因子网络调节紊乱, 导致全血细胞减少[6]。小鼠受到照射后第7 d, 我们检测血液系统相关的指标, 包括白细胞、淋巴细胞、血小板、骨髓有核细胞计数等, 结果均明显减少, 补充Gen后上述指标都有回升, 提示Gen对小鼠辐射损伤的作用可能与保护造血机能有关。
脾脏也是小鼠的造血组织, 受到照射后, 存活的造血干细胞代偿性增殖, 形成细胞团(colony forming units - spleen, CFU-S), 在脾脏表面出现肉眼可见的颗粒状突起, 即脾结节。脾结节细胞不仅有重建骨髓系细胞能力, 而且具有生成T、B淋巴细胞的能力, 为目前唯一能被测试的一类造血干细胞, 它具备了多能干细胞的基本特征, 如多向分化及自我更新[7]。照射后脾结节计数增加, 说明Gen可以促进照射后造血功能的恢复。可能是Gen通过清除自由基等途径减少了辐射后骨髓造血细胞的坏死凋亡, 尤其是造血干、祖细胞, 而且不明显损害其增殖能力。Gen是否诱导造血因子释放或者改善造血微环境从而促进受照射小鼠造血功能恢复有待进一步研究。
增殖细胞受到射线或化学物质作用后, 染色体和染色质受损。染色体片段或无着丝粒环在细胞分裂后期不能定向移动而留在细胞质中形成微核, 微核率的高低可反应细胞DNA的受损程度[5]。小鼠受到照射后, 骨髓嗜多染红细胞微核率明显升高, 补充Gen可以降低微核率, 说明Gen对DNA损伤有一定的保护作用。其作用途径可能与直接清除自由基有关, 也有人认为Gen的结构适合插入DNA, 稳定其结构, 增强对自由基的抵抗能力[8]。Gen抗辐射作用的机制还有待进一步的研究。
| [1] |
Widyarini S, Spinks N, Husband AJ. Isoflavonoid compounds from red clover (Trifolium pratense) protect from inflammation and immune suppression induced by UV radiation[J]. Photochem Photobiol, 2001, 74(3): 465-470. |
| [2] |
Wei H, Zhang X, Wang Y, et al. Inhibition of UV light -induced oxidative events in the skin and internal organs of hairless mice by isoflavone Genistein[J]. Cancer Lett, 2002, 185(1): 21-29. DOI:10.1016/S0304-3835(02)00240-9 |
| [3] |
Zielonka J, Gebicki J, Grynkiewicz G. Radical scavenging properties of genistein[J]. Free Radic Biol Med, 2003, 35(8): 958-965. DOI:10.1016/S0891-5849(03)00472-6 |
| [4] |
全宏勋, 张钦宪. 黄芪抗辐射作用的实验研究[J]. 中草药, 1993, 24(8): 423-425. DOI:10.3321/j.issn:0253-2670.1993.08.017 |
| [5] |
曹佳, 林 真(日本), 余争平. 微核实验———原理、方法及其在人群监测和毒性评价中的应用[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 2000: 1-64.
|
| [6] |
吴德昌. 放射医学[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 2001: 70-76.
|
| [7] |
黄波田, 李书杰, 岳保红. 血细胞学检查[M]. 郑州: 河南医科大学出版社, 1998: 4-6.
|
| [8] |
Wei H, Ca Q, Rahn R, et al. DNA structural integrity and base composition affect ultraviolet light -induced oxidative DNA damage[J]. Biochemistry, 1998, 37(18): 6485-6490. DOI:10.1021/bi972702f |