白细胞介素-6 (Interleukin - 6, IL - 6)是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，它对骨髄造血干细胞的增殖分化有极强的促进作用，尤其是刺激巨核细胞成熟分化为血小板的功能更加引人注目，是促进血小板再生的细胞因子之一^{[1, 2]}。机体在接受放疗化疗后会导致血小板低下造成严重出血等并发症，应用IL-6后有望恢复和强化体内造血功能，刺激体内血小板的产生。本文对重组人白细胞介素-6工程菌E.coli DH5α/ PBV₂₂₀IL-6表达产物进行了纯化，获得高纯度的IL-6, 并利用IL-6对豚鼠辐射损伤的保护进行了探索。

1 材料和方法 1.1 仪器和试剂

重组IL-6高效表达工程菌E.coli DH5α/ PBV₂₂₀IL-6, 由本实验室构建^[3]。IL-6依赖细胞株MH60-BSF2 (T₂₄膀胱癌细胞)由日本大阪大学细胞工学中心惠赠，本实验室传代保存。美国NBS公司5L发酵罐。Waters650E高效液相色谱仪。

1.2 IL-6的纯度测定及分子量的测定

采用SDS-PAGE法^[4]，分离胶浓度15%，浓缩胶浓度4.5%。考马斯亮蓝R-250染色。

1.3 工程菌的发酵与包涵体的制备

将工程菌接种于LB培养基中，在30℃水浴摇床中过夜培养后，转入发酵罐中30℃扩增，然后42℃热诱导表达4h，于4℃ 4 000rpm/min离心20min，收集菌体。菌体悬浮于TE (50 mmol/L Tris - lmmol/L EDTA -lmmol/LDTT-pH8.0)中，在冰浴中超声波粉碎，离心，用含4 mol/L尿素的TE缓冲液充分洗涤沉淀二次，离心弃上清。沉淀用含8mol/L尿素的TE液充分溶解后即IL-6粗品。

1.4 IL-6复性

将IL-6粗品稀释于复性液(50mmol/L Tris -2 mol/L尿素-2 mmol/L GSH - 0.2 mmol/L GSSG - pH8.5)中，调蛋白浓度至100μg/ml，置4℃过夜复性。

1.5 反相色谱应用于rhIL-6的纯化

采用Waters 650E高级蛋白纯化系统对IL-6复性液进行纯化，色谱柱为Waters公司的μBondapakC18柱(8.0 ×300 mm)，检测器为Waters 484, 检测波长280 nm，灵敏度0.2 AUFS。洗脱液A: 0.1%三氟醋酸；洗脱液：乙腈(含0.1%三氟醋酸)。梯度为：100%A-100%B，60 min。洗脱速度为1 ml/min。收集各峰进行电泳。将IL-6峰收集、冻干，用生理盐水溶解后做IL-6生物活性测定^[5]。

1.6 rhIL-6对豚鼠辐射损伤模型的保护作用

取320~380 g的豚鼠经7.5Gy ⁶⁰Co射线一次性照射后随机分为3组，每组8只。两治疗组中，低剂量组采用rhIL-6 20 μg/kg·d)，高剂量组米用rhIL- 6 60μg/ kg·d)。两治疗组在照射后肌注给予rhIL -6, 每天二次，共注射8d；对照组仅注射等量生理盐水。分别于照射后5、15、25、35, 45 4取血进行血小板计数。45 4时全部处死。

2 结果 2.1 rhIL-6经反相色谱分离的结果

rhIL-6包含涵体经4 mol/L尿素洗涤后其纯度较全菌发酵产物有了明显提高。将稀释复性后的样品再经反相色谱分离，在梯度洗脱后37min出现rhIL-6活性峰，色谱图见图 1。收集活性峰进行电泳后显示单一条带，经凝胶扫描示其纯度达到95%，分子量约17 000。电泳结果见图 2。利用IL-6依赖细胞株MH60·BSF2测定，IL-6比活达2.0×10⁸u/mg。

2.2 rhIL-6对血小板生成的影响

辐射豚鼠血小板数于照射5d后均急剧下降。两IL-6应用组存活豚鼠于照射后25 d外周血血小板己达照射前正常血小板水平。结果见表 1。

2.3 IL-6对辐射豚鼠生存期的影响

辐射豚鼠于8d出现死亡。对照组于12 d全部死亡；IL-6低剂量组在12 d后生存率37.58；IL-6高剂量组在11 d后生存率50%。两实验组与对照组相比差异显著。提示IL-6可明显提高辐射豚鼠生存率。见图 3。

3 讨论

白细胞介素-6是一种具有多种生物学效应的细胞因子。获得高纯度和高活性的IL-6是进行相关研究的基础。本文所建立的rhIL-6制备方法在4 mol/L尿素洗涤并复性后直接进行反相色谱分离，不仅操作简便，而且纯化效果好，所获得的rhIL-6具有很高的纯度和比活性。在对辐射豚鼠的实验性治疗中，可减轻血小板的降低程度，促进血小板的再生，提高豚鼠外周血血小板的水平，减少因血小板急剧下降造成的死亡，从而提高了生存率，延长了生存期，显示了rhIL-6对辐射豚鼠的保护作用。提示rhIL-6可用于治疗放疗化疗后导致的血小板低下，减轻出血等并发症。