异基因骨髓移植(Allo-BMT)是目前可能治愈白血病的唯一方法。但由于主要组织相容性抗原复合物(MHC)的屏障作用, 移植物抗宿主病(GVHD)仍然存在, 并成为移植相关死亡的主要原因。而一些选择性或非选择性去除T细胞的方法, 虽然能够减轻GVHD, 但白血病复发率或移植失败显著增加, 主要是移植物抗白血病(GVL)作用下降所致。所以深入探讨既减少GVHD又保留GVL的移植方案势在必行。本研究为此进行了具体探讨, 并取得了较大进展。现总结报告如下。

① BALB/C小鼠:18~20 g, ♂, 10只, 中国科学院动物实验中心提供。②C₅₇BL/6小鼠:18~20 g, ♀, 20只, 中国科学院动物实验中心提供。③BALB/C×C₅₇BL/6杂交鼠:18~20 g, ♂, 10只, 本室自行杂交。

C₅₇BL/6小鼠均为雌性, 于照射前3天接受庆大霉素饮水, 直到移植后2周。移植前6 h, 以⁶⁰Co全身照射8 Gy, 剂量率为12.0 cGy/min, 无菌条件下取供鼠股骨骨髓及脾脏, 经研磨后制为单细胞悬液。以RPMI 1640洗涤后, 以适量生理盐水制成单个核细胞悬液, 经尾静脉注入受鼠中。同基因BMT:同基因髓细胞(1.5×10⁷个)+脾细胞(0.7×10⁷个)。异基因BMT:同法给予BALB/C小鼠髓细胞(1.5×10⁷个)+脾细胞(0.7×10⁷个)。半相合RMT:同法给予杂交鼠髓细胞(1.5×10⁷个)+脾细胞(0.7×10⁷个)。混合半相合BMT; 以杂交鼠与C₅₇BL/6小鼠混合髓细胞(1:1)1.5×10⁷个及混合脾细胞(1:1)0.7×10⁷个移植。移植后置超净台中饲养, 观察全身表现。记录死亡。并做病理检查(肺、肝、小肠、皮肤)。

移植后13 d处死取脾, Bouin氏液固定30 min, 解剖镜下计隔面脾结节数。

移植后不同时间取髓细胞进行染色体G显带染色。计数30个分裂相。记录Y染色体比例。

移植后第6天, 经腹腔注入¹²⁵I -尿嘧啶核苷(¹²⁵I-UdR)7.4×10⁴ Bq(2 μCi)(北京原子能研究所)。8 h后拉颈处死小鼠, 取脾脏, 70 %乙醇中浸泡3 d, 液闪计数仪测定。脾脏¹²⁵I-UdR摄取率(%)=(脾脏细胞计数-本底)/(标准计数-本底)计算。

GM-CFU以半固体琼脂法测定, 外周血WBC按常规进行。

t检验, χ检验, 以P < 0.05为有统计学意义。

同基因BMT 30 d内无死亡, 存活率达100%, 异基因组8 d后既有明显GVHD反应, 如弓背体位, 脱毛, 腹泻等。10 d后发生死亡, 16~18天死亡达高峰。病理检查符合GVHD反应。半相合BMT组10 d后有轻度GVHD反应, 以弓背体位为主。但病理示轻度GVHD反应。30天死亡率为25 %。混合半相合BMT组无明显GVHD反应, 30 d生存率为100%。

移植13 d后的脾结节数分别为:同基因组为14.5%±2.2%, 异基因组为8.6%±1.4 %, 半相合混合BMT组12.6 %±2.1 %, 半相合组为10.2 %±1.9 %。经统计学分析, 异基因组和半相合组移植后的脾结节数均低于同基因组(P < 0.05)。混合半相合BMT组与同基因BMT组无差异(P > 0.05)。

第18天时混合半相合BMT组嵌合体细胞占42.5 %±9.5%, 半相合BMT组为39.6 %±7.4%, 异基因组为12.7%±6.4%。第30 d时, 半相合BMT组未查出供体细胞, 混合半相合BMT组为10.2%±5.7%, 异基因组为0。

按脾脏¹²⁵I-UdR摄取率(%)=(脾脏细胞计数-本底)/(标准数-本底)计算。移植6 d后同基因组¹²⁵I-UdR摄取率为0.057%±0.009%, 异基因组为0.54%±0.061%, 半相合组为0.22%±0.036 %, 混合半相合组为0.17 %±0.038%。经统计学分析, 异基因组组明显高于其他三组, 而同基因组低于半相合组或混合半相合组(P < 0.05)。半相合组高于混合半相合组(P < 0.05)。

表 1 Table 1

表 1 BMT后GM-CFUc及外周血白细胞测定(x ± s)

表 1 BMT后GM-CFUc及外周血白细胞测定(x ± s)

经统计学处理, 第6天时, 各实验组WBC或GM-CFUc无明显差别(P >0.05), 但均低于正常对照。移植后第12天时, 实验组中异基因组WBC偏低, 但与同基因组、半相合组或混合半相合组比较, 其差别无统计学意义(P >0.05)。第18天时, 各组WBC均明显升高, 但各组之间差异无明显统计学意义。异基因组GM-CFUc低于其他各组(P < 0.05)。

造血干细胞移植是迄今为止各种恶性血液病、某些实体肿瘤及遗传性疾病等最有效疗法。但仍存在着某些尚未克服的问题, Allo-BMT时的移植物抗宿主病(GVHD)既是其中之一, 并成为移植相关死亡的主要原因^{[1, 2]}。以往选择性或非选择性去除供体T细胞等方法, 虽然不同程度地减少GVHD反应, 却导致移植后的高复发率, 影响受者长期存活, 其主要原因是同时降低了移植物抗白血病(GVL)作用^{[3, 4]}。鉴于此, 国内外学者在深入研究GVHD或GVL发生机制和影响因素的基础上, 对减少GVHD反应又保留GVL作用的方法进行了探讨^[5], 但尚未取得行之有效的固定模式。本研究利用供受体相合程度的改变(如半相合)及供受体骨髓或脾细胞混合的方法, 首先对GVHD反应做了探讨, 以期取得满意效果。研究结果表明, C₅₇BL/6小鼠同基因BMT, 30 d存活率可达100%。异基因组(C₅₇BL/6)小鼠为受体, BALB/C小鼠为供体)于移植后8 d即发生明显的GVHD反应, 10 d后开始相继死亡, 16~18 d达死亡高峰。而BALB/C×C₅₇BL/6杂交鼠为供体的半相合BMT组, 于移植后10 d发生轻度GVHD反应(病理证实为GVHD反应), 30 d死亡率为25 %。将半相合供体与受体骨髓或脾细胞对倍混合后的混合半相合BMT未发生明显的GVHD反应, 30 d生存率达100%。进一步经体内混合淋巴细胞培养证实其脾脏¹²⁵I-UdR摄取率以异基因组最高, 其次为半相合组, 而混合半相合组最低, 一定程度上反映了各组的GVHD反应程度的高低。经脾结节计数, 发现混合半相合或半相合BMT与异基因组相比, 脾结节计数较高。18 d时混合半相合或半相合BMT骨髓GM-CFUc计数均高于异基因组。因此, 上述结果初步说明混合半相合或半相合骨髓移植方式可以减轻GVHD反应。虽然半相合或混合半相合骨髓移植可以一定程度上减少GVHD反应, 增加了长期存活率, 但对GVL作用的影响需要进一步研究。