辐射可引起多种染色体畸变, 伴有断片产生而形成微核, 微核测定具有方法简便, 观察迅速, 鉴别比较容易等特点, 特别是在Fenech建立了淋巴细胞胞浆分裂阻滞微核法(Cytokinesis -block Micronuleus Test, CB-MNT), 将计数微核的细胞局限于双核细胞后, 提高了微核测定的灵敏度和检测效率^[1~3], 在辐射损伤的诊断, 辐射防护药的筛选, 辐射的细胞遗传学效应研究等工作中的应用正日趋普遍。本文采用CB微核法做了以下研究, 对进行放疗的恶性肿瘤患者的外周血淋巴细胞微核率进行动态观察, 评估其剂量效应关系, 并对细胞松驰素B的加入浓度进行了讨论。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试剂

RPMI 1640培养基(苏格兰Irvine KA), 小牛血清(天津生化研究所), 植物血凝素PHA(广州医药工业研究所), 细胞松驰素B(Cytochalasin-B Cyt-B, 美国Aldrich Chem Co.)。

1.1.2 Cyt-B配制

Cyt-B用二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为2 mg/ml的贮存液贮于-40℃低温冰箱, 用时以培养液稀释, 加入培养基中的终浓度为4.0 μg/ml。

1.1.3 病例选择及照射条件

患者选用河南医科大学第一附属医院放疗科恶性肿瘤患者30例, 其中食管癌10例, 鼻咽癌4例, 肺癌3例, 乳腺癌3例, 皮肤癌3例, 其它7例。男20例, 女10例, 年龄24~ 60岁, 均经病理确诊, 未经化疗。照射用日产岛津⁶⁰Co治疗机, 源皮距80 cm, 患者每周照射5次, 一周剂量约10 Gy, 本文中剂量均按空气剂量计算。正常人选用健康献血员30名, 男15例, 女15例。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养及制片

每例患者分别在放疗前, 放疗中期, 放疗结束时采集静脉血3次, 每次2 ml(肝素抗凝), 放入37℃恒温箱中静置2 h, 待血自然分层后, 吸取界面细胞层约0.1 ml, 接种于2 ml RPMI 1640培养基中(含15%小牛血清, PHA适量, 青链霉素各100 IU/ml, pH 7.0~ 7.2), 37 ±0.5℃培养, 至44 h, 加入Cyt-B 4.0μg/ml, 继续培养至72 h终止。培养物经离心后弃上清, 加入37 ℃预温的0.075 mol KCl 3 ml混匀, 再加入1 ml新配制的甲醇、冰乙酸(3:1)固定液, 混匀离心, 弃上清, 再固定一次后制片, HE染色, 制备完整淋巴细胞微核片。

1.2.2 观察计数及统计方法

油镜下计数500 ~ 1 000个CB双核细胞, 其中所含微核数为微核率(MNF), 以千分率(‰)表示; 微核细胞率(MNCF)是计数500 ~ 1 000个双核细胞中含有微核的双核细胞数, 亦以千分率(‰)表示。MNF与剂量间关系采用直线回归与相关, 两两对比用t检验。

2 结果

(1) 由于患者肿瘤类型及临床分期不同, 所受剂量也不同, 因此选取了0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 Gy八个剂量点来观察MNF及MNCF与剂量间的关系, 如表 1, 经用最小二乘法处理, MNF及MNCF均与射线剂量成正比, 其直线回归方程如下: Y_MNF=39.27 +0.71 X r =0.9720 P < 0.01 Y_MNCF =34.05+0.58 X r =0.9782 P < 0.01, 经变量分析, 回归是高度显著的, 回归方程拟合良好。

(2) 食管癌患者放疗后的微核率改变, 表 2显示疗效优者的MNF明显高于疗效差者(P < 0.01)。

(3) 肿瘤患者的自发微核率明显高于正常人(P < 0.01), 见表 3。

3 讨论

各种致癌因子及电离辐射对人体的毒害作用, 已使人们重视到对细胞基因改变的检测。微核分析是一简便快速的检测染色体损伤的方法, 有可能代替原有的染色体分析而成为生物剂量计^[4]。

本文应用CB微核法观察了30例肿瘤患者放疗前后MNF的变化, 得到了MNF与MNCF随剂量升高而增大的线性正比关系, 这可能是由于患者采用局部分次照射, 第一次照射时只影响到体内一部分淋巴细胞, 第二次照射时受到影响的有未曾照过的, 也有已受到一次照射的淋巴细胞, 随着照射次数的增加, 体内受到照射的淋巴细胞比例以及受过多次照射的淋巴细胞相应增强, 说明在分次照射条件下, 每次照射诱发微核的效应是累加的。另外我们发现患者放疗后MNF升高的幅度不同, 说明机体对放疗的反应不同, 即放射敏感性有差异, 遂选取10例食管癌来做一比较, 有6例的MNF较高, 而他们的临床疗效也较好, 另外4例MNF较低, 临床疗效较差, 说明疗效好的患者, 机体对射线的敏感性高, 外周血淋巴细胞MNF的改变与放疗的疗效有一定的关系, 但因例数较少, 有待于进一步确证。

细胞在恶性转化过程中, 存在着各种染色体畸变, 就更易形成微核, 本文中肿瘤患者的自发MNF明显高于正常人, 这与报道一致^[5]。但个别患者的MNF并不高于正常人, 其中两人分别为23.2‰, 24.3 ‰, 均在正常值范围(24.88±0.77)‰。因此, 检测MNF对肿瘤的诊断灵敏性尚需进一步提高。

关于培养基中Cyt-B的加入浓度, Fenech采用3.0 μg/ml, 蒋本荣^[6]用6.0 μg/ml, 而本实验用4.0 μg/ml, 都达到满意效果, 究其原因, Fenech培养的是经过分离的淋巴细胞, 细胞能和Cyt-B充分接触, 蒋本荣采用的是全血培养, 淋巴细胞间杂有较多的红细胞, 粒细胞等, 减少了与Cyt-B的接触, 所以浓度要适量增加, 本实验采用的是很少量的界面白细胞层, 其间掺杂的红细胞较少, 淋巴细胞与Cyt-B的接触机会虽比Fenech少, 但比蒋本荣的要多, 所以4.0 μg/ml的浓度, 即能达到满意效果。

总之, CB微核法的实用价值有待进一步明确, 使其成为代替染色体分析的方法来对人群的放射敏感性进行评价。