放射自显影技术是实验核医学中研究微剂量分布的较好方法, 其原因就在于它可以提供分辨率小于1 μm的放射性药物的分布信息, 其分辨率的好坏主要是由核素的衰变特性决定的。^99mTc-MIBI作为较好的心肌显像剂, 在临床上已广泛应用, 并逐渐应用到肿瘤显像。^99mTc-MIBI的SPECT扫描发现, 在正常人肝脏有较高浓度的^99mTc-MIBI聚集, 这势必会对肝脏带来较高的内照射剂量。另一方面^99mTc标记的放射性药物其放射自显影的分辨率较高。因而我们在用放射自显影技术进行微剂量分布研究中, 首选^99mTc- MIBI这类药物, 并首选肝脏为研究对象, 我们企图通过这一研究建立一种通用的微剂量分布研究方法。利用放射自显影技术, 将已注射放射性药物的小鼠肝脏标本制成所需的切片是完成此项研究的关键, 在自显影技术应用过程中, 凡是影响药物分布、银颗粒计数准确性的因素都能影响剂量估算的准确度。因此在应用放射自显影技术进行微剂量研究时需严格控制这些影响因素。

1 材料与方法 1.1 核乳胶响应线性关系曲线的建立 1.1.1 乳胶干板的制作

用10%重铬酸钾硫酸水溶液浸洗及去离子水冲洗过的载玻片插入经42℃水浴熔化的核4型液体核乳胶(中国原子能科学研究院物理研究所产)中, 缓慢提起倒置, 室温下晾干, 1 h后于4℃条件下储存备用。使用前先在-20℃冰箱内预冷3~4 h。

1.1.2 小鼠肝脏匀浆物自显影冰冻切片的制作

将剪碎的小鼠肝脏放入匀浆器内, 再加入10倍体积0.9%的NaCl溶液, 混合后研磨成细糊状, 在4℃、10 000 ×g离心10 min, 吸出沉降物, 滴加少量0.9%的NaCl溶液后混匀制成匀浆物^[1]。假设其密度等同于正常小鼠肝脏的密度, 取6份1 ml混匀的匀浆物与一定体积不同比活度的^99mTc洗脱液混合, 混匀后取样称重, 用标定过的γ计数器测定活度, 经液氮冷冻后, 迅速进行冰冻切片, 切片厚度为5 μm。从此步骤始到定影止须在暗室的安全红灯下进行。切出的组织切片用预冷过的乳胶干板贴附, 放入暗盒内曝光24 h。显影2~4 min后, 在Kodak F-5定影液中定影8~10 min^{[2, 3]}, 再经过蒸馏水冲洗、干燥等步骤制成自显影切片, 此种切片无需染色。取无放射性的匀浆物同时制成切片, 贴附乳胶干板, 在同样条件下制成自显影切片作为对照。

1.1.3 自显影本底、乳胶线性响应关系的确定

随机选取自显影切片, 并在镜下随机选取观察视野, 对此有无放射性的两种自显影切片周围银颗粒密度变化, 以扣除本底。在衰变校正后, 分析由不同比活度匀浆物制成的自显影切片的银颗粒密度(Y)与施入比活度(X)的关系, 一般来说满足下面的线性方程:

公式中b代表自显影切片的本底银颗粒密度, b和Y的单位为(个/μm²), X单位为(MBq/g), a为单位比活度引起的单位面积上的银颗粒数, 单位为(个/ μm²)/(MBq/g)。

1.2 小鼠肝脏放射自显影冰冻切片的制作

本实验之所以采取体重(38~42 g)较大的小鼠、注射较大体积(0.5 ml左右)的药物, 是为了在保证不改变动物正常生理血容量的情况下, 减小由注药体积不准确带来的误差; 而选择在注药后2 h取样, 是因为此时肝脏内的比活度趋于稳定, 以减少由取样造成的误差, 另外, 为了增加样本的代表性, 动物的分组、肝组织的切取、以及乳胶干板的选择都是随机的。

30只昆明鼠(放射医学研究所二级实验动物房提供)体重在38~42 g之间, 尾静脉注射0.5 ml生理盐水或比活度在30~90 MBq/ml之间的^99mTc-MIBI溶液, 注药2 h时后断颈处死, 切取肝组织, 随机取一小块称重, 测其活度以便把握切片制作时间。随后的切片、曝光、显影、定影等过程同于小鼠肝脏匀浆物自显影冰冻切片的制备。定影后的切片用4%甲醛溶液(0.1 M, pH7.4 PBS)固定15 min, 用苏木精.伊红染液(H&E)染色, 使细胞核与细胞质的蓝红反差鲜明^[4], 经过脱水透明封片等步骤后, 于显微镜下观察分析银颗粒的空间分布情况。

2 结果与讨论 2.1 自显影实验条件的确定

虽然通过自显影可以观察放射性药物在细胞内外的分布情况, 但是若要对分布进行定量的测定, 必须建立一条刻度曲线。为了确定自显影的最佳实验条件, 用优化实验方法进行预实验, 结果表明, 切片时匀浆物比活度在1.0~2.0 MBq/g (比活度范围包括注药小鼠肝脏中的放射性比活度值)之间曝光时间为24 h的条件下, 获得的自显影切片, 不仅可以避免乳胶过度曝光, 而且本底较低, 在这种试验条件下, 可以得到较好的自显影分辨率。用显微镜分析不同自显影切片上单位面积的银颗粒数目, 在考虑衰变修正的情况下, 计算出相应的比活度, 用线性回归分析方法进行分析后, 建立起如下线性方程:

其曲线关系见附图。线性回归相关系数r= 0. 92。附图乳胶响应的线性关系

2.2 小鼠肝脏自显影切片

经过H&E染色的小鼠肝脏组织自显影切片, 细胞核呈现蓝色, 细胞质为鲜明的粉红色, 二者对比清晰, 银颗粒也较清晰地呈现为黑色, (彩色图片略, 如读者有兴趣, 可向作者索取)。

2.3 小鼠肝脏内的^99mTc-MIBI分布

在本实验中, 切片厚度为5 μm, 乳胶为厚度2 μm左右的条件下, 乳胶银颗粒主要由^99mTc衰变能谱中产率相对较大、乳胶内射程较短(0.2~2 μm)、能量分别在0.409~2.053 keV、15.35~17.77 keV之间的俄歇电子形成^[5], 因此, 可以认为观察到的银颗粒位置代表核素点源的真实位置, 这是放射自显影应用于微剂量估算的理论基础^[6]。由此, 通过观察自显影切片中银颗粒密度的变化情况, 就能够推测肝脏组织内细胞水平^99mTc-MIBI分布的变化情况。通过观察自显影切片中银颗粒密度的变化可见^99mTc-MIBI放射性药物在细胞核内的分布是极不均匀的, 而在细胞质中的分布呈现正态分布。

2.4 自显影制作过程中影响剂量估算的主要因素

在自显影制作过程中, 凡是影响药物分布、银颗粒计数准确性的因素都能影响剂量估算的准确度。下面按照自显影的制作过程、银颗粒计数、剂量估算等顺序, 讨论它们对剂量估算的影响。

2.4.1 自显影操作方法的选择

首先, 自显影操作方法的选择具有十分重要的意义。由于MIBI是一种亲脂性的阳离子化合物, 传统的石蜡固定、包埋等切片制作过程, 易导致此药的实际分布情况的改变, 且此过程费时^[7], 这对短半衰期的^99mTc (6.02 h)是不适用的, 针对此药, 较好方法是冰冻切片光镜放射自显影技术, 此技术的关键在于, 需要较快组织冷冻过程、较低的冷冻温度, 以及于低温下切片与曝光, 以减少操作中MIBI重新分布的可能性。为较好的贯彻此原则, 我们在Lam等人^{[8, 9]}的方法基础上进行了改进, 组织冷冻采用在液氮中直接冷冻的方法。尽管, 由于温差的关系, 当组织向冰箱内转移时, 组织可能会破裂, 但是, 如果当组织在液氮表面升温5 min后, 再移到切片机上进行切片, 就可避免组织破裂, 当然也就不会改变细胞结构与药物分子的空间分布关系。由于曝光时组织内冰晶的重新形成, 会破坏细胞结构, 为了防止此现象的发生, 宜在低温下曝光, 本实验采用的曝光温度为-60℃。

2.4.2 切片与乳胶粘附方式的选择

对小鼠肝脏内^99mTc-MIBI分布状态的影响是较大的。Puncher认为, 若采用先制成切片再浸胶的方式, 会使易扩散性的药物转移到液体乳胶中去, 为避免此现象的发生, 本实验采用先制成干板再贴取切片的方法。采用此法, 还应注意保持连续较快地切片制作速度, 否则因为曝光开始时间的不同, 会导致同一批切片存在曝光时间的差异, 尤其当组织内的比活度较高时, 这种差异会更大, 对结果准确性的影响就更明显。为此, 实验中必须随时记录同一组切片的起止时间, 以作为物理衰变纠正的依据。至于显影液、定影液的温度与效力、显影定影的时间等因素, 在保持一致实验条件的情况下, 它们对切片中药物分布的影响是较小的。

2.4.3 自显影的分辨率对计数准确性的影响

为使细胞内银颗粒密度的变化能够反映^99mTc-MIBI的比活度的变化, 必须获得较好的自显影分辨率。其影响因素之一是所应用乳胶的灵敏度, 在这里, 对乳胶灵敏度的选择主要由^99mTc的衰变特性决定的。在^99mTc的衰变能谱中, 能量为140 keV左右的γ射线与能量在18.37~20.62 keV之间的X射线穿透能力较强, 不会在乳胶中留下潜影; 对于能量在119.4~142.2 keV的电子, 当它在乳胶中形成潜影时, 会降低自显影分辨率, 为了防止此现象的发生, 必须制作较薄的切片与乳胶, 使那些从切片深层点源发射的此类电子, 也较容易地穿过乳胶。因此, 按这种方式考虑的实验条件, 只有能量分别在15.35~17.77 keV与0.409~ 2.053 keV之间的俄歇电子是乳胶中潜影的主要贡献者, 为了保证银颗粒的清晰, 当记录高能电子时, 宜采用高敏感度的乳胶。当记录低能的电子时, 选用乳胶的敏感性不必太高。这就是本实验之所以采用核-4型液体乳胶的原因。

2.4.4 自显影的效率

在恒定的实验条件下, 自显影的效率对计算结果无直接的影响, 但要保证它的恒定性, 有必要考虑几个方面的因素。

切片与乳胶的厚度会影响自显影的效率, 它们的厚薄是可变的, 其影响也是可变的。由于形成银颗粒的电子, 主要为能量分别在15.35~17.77 keV与0.409~2.053 keV之间的俄歇电子, 在乳胶中的射程小于2 μm, 假设切片的厚度恒定不变, 在乳胶层厚度增加到2 μm时, 这两类电子形成的单位面积银颗粒数增加较快; 当厚度大于2 μm时乳胶层内的银颗粒密度的增加主要由长射程电子造成的。尽管其产生几率较小, 形成的银颗粒密度增加速度不会很快, 但会降低自显影分辨率, 是应该避免的。

另一方面, 假设乳胶层的厚度恒定且较薄, 由于能量在15.35~17.77 keV电子在组织内的射程不大于5.3 μm, 当切片厚度增加到5.3 μm时, 处于深层能量较高的电子也较易穿透乳胶层, 因而, 银颗粒密度的增加主要由此种能量电子造成的; 当切片厚度大于此范围时, 。较高能量的电子对银颗粒增加的贡献也就越来越大, 这样也会对分辨率带来不利的影响, 这种情况也应避免。避免这一情况的方法是制备较薄的组织切片与乳胶, 这就是本实验之所以保持切片与乳胶厚度分别为5 μm、2 μm的原因。

2.4.5 本底对剂量估算的影响及其扣除方法

本底的存在同样会导致自显影切片中银颗粒分布的疏密变化不明显, 计数不精确, 不能反应药物的真实分布情况, 这就必须增加施入放射性药物的量及比活度来提高信息与本底的比例, 而这又有可能造成乳胶内银颗粒的饱和以及不必要的药物浪费, 因此在实验中应设置对照组, 以排除此因素的影响。本底的扣除方法, 除利用实验中的对照组外, 还可用切片自身周围乳胶中的银颗粒作为对照。因为, 在自显影制作的整个过程, 在每一张自显影切片上的组织与其周围的乳胶, 都处于相同的曝光、显影、定影条件下, 以及它们由切片刀造成交叉污染的机会也是相同的, 所以, 组织切片周围的银颗粒密度可以作为同一切片的本底密度而予以扣除。这种本底扣除法既方便又准确, 而且, 即使在本底稍微高的情况下, 也不会影响银颗粒计数的准确度。当然, 本实验中的本底都较低, 可以忽略。

2.4.6 染色质量对剂量估算的影响

Puncher等认为, 组织细胞染色的质量直接影响银颗粒计数的准确度, 也就会影响剂量估算的正确性。本实验采用H&E染色法, 细胞核与细胞质染色对比清晰。(彩色图片略, 如读者有兴趣, 可向作者索取)。

2.4.7 肉眼分析对剂量估算的影响

肉眼分析、计数银颗粒过程中, 对银颗粒的判断标准, 观察对象的选择都受主观因素影响。为此必须制定分析的原则, 如:观察视野的选择是随机的, 在进行细胞内银颗粒的计数时, 也只能选择那些细胞染色清晰、细胞核直径均匀的细胞为观察对象, 而不应以细胞(核)内的银颗粒数目的多少为选择标准, 否则, 所得数据缺乏代表性。另外, 要注意, 由于小鼠肝脏内^99mTc-MIBI分布的非均匀性, 样本的统计量宜适当大一些, 否则小样本会造成较大的抽样误差。

2.5 自显影技术缺点和改进

虽然光镜放射自显影是一种能够对器官内放射性药物进行准确地定位(可在1 μm以下范围内)的方法, 但存在的一个缺陷是不能同时获得组织内药物的时间、空间分布信息, 在运用到剂量估算时, 只能获得某一时点的剂量率。因此, 要把剂量率分布转变成吸收剂量分布, 必须掌握药物的时间-活度分布曲线, 有人试图把热释光剂量计(TLD)植入组织, 以获得随时间变化的累积剂量^[10]。但由于TLD元件尺寸一般都较大, 不能反映核素点源与细胞结构的空间分布关系及细胞水平的剂量分布信息, 此过程本身又是一种破坏性过程而影响药物的实际分布情况。以及TLD性能易受组织生理环境(如温度、pH)、植入时间、总剂量等因素影响, 其校正过程较为复杂。也就是说, 尽管TLD是自显影的一种互补技术, 也难弥补光镜自显影在微剂量学研究中的这种不足。因而, 需探索新的方法解决这一问题。另外, 光镜下银颗粒肉眼分析过程不仅耗时, 而且准确度受主观因素的影响, 这需要自动的分析处理过程。

目前, 关于肿瘤治疗的报道较多, 所欠缺的是无准确的剂量数据作指导。至于自显影进行剂量估算的重要用途就在于, 为肿瘤的放时药物治疗提供准确的剂量数据, 应在尽量杀伤肿瘤细胞的同时, 减少对瘤组织周围正常细胞的辐射损伤。当然, 自显影本身又可用于药物定位机制等方面的研究。