DNA聚合酶(polyimerase, 简称DNA-P)是DNA合成中的关键酶, 它与细胞的生长、繁殖及分化密切相关^[1]。我们用γ -射线诱发Wistar大鼠肺细胞转化过程中, 检测了DNA-P的活性变化, 以研究DNA-P与细胞转化的关系。

1 材料与方法 1.1

¹²⁵I标记检测DNA-P药盒(上海海军医学研究所提供)。

1.2 实验分组 1.2.1

对照组:正常Wistar大鼠肺成纤维细胞

1.2.2

照射组:Wistar大鼠肺成纤维细胞经⁶⁰Co-γ射线照射, 剂量为4.0 Gy (剂量率为1.819 Gy/min)

1.2.3

肿瘤细胞组:Wistar大鼠肝癌细胞(HTC), 作为阳性对照组。

1.3 方法 1.3.1

选用原代Wistar大鼠肺细胞, ⁶⁰Co-γ射线一次照射4 Gy, 细胞常规传代培养至10、20、30代时, 按DNA-P药盒检测程序制备DNA-P粗酶(DNA-P的混合物), 用FT-625¹²⁵I放免测量仪测定沉淀物放射性(检测条件的控制按药盒说明)。

1.3.2

各组细胞DNA-P活性以沉淀物中¹²⁵I放射性测量计数(CPM)表示。DNA-P相对活性等于各组沉淀物中¹²⁵I放射性测量结果(CPM)除以0.1 μl工作液中¹²⁵I放射性测量结果(CPM)。

1.3.3

半固体琼脂培养:底层琼脂浓度为0.5%, 顶层琼脂浓度为0.3%, 每组5皿, 每皿接种细胞1 000个。37℃, 0.5% CO2恒温培养20d观察结果, 计数集落形成率。

2 结果 2.1 DNA-活性的变化

从表 1的结果可以看到, 照后第10代, 照射组细胞DNAP活性与对照组比较没有明显的增加; 而肿瘤细胞组DNA-P活性明显高于对照组和照射组, 经t检验差异有非常显著性(P < 0.01);照后第20代, 照射组细胞DNA-P活性增高, 与对照组比较差异有非常显著性(P < 0.01), 但仍明显低于肿瘤细胞阳性对照组, 为肿瘤细胞组的30.4%;照后第30代, 照射组细胞DNA-P活性进一步增高(P < 0.01), 为肿瘤细胞组的64.8%。

分析照射后不同时间各组细胞DNA-P的相对活性计算结果可以看到, 照射后的第10、20和30代的Wistar大鼠对照组细胞和肿瘤细胞组DNA-P相对活性没有明显改变, 而照射组细胞DNA-P相对活性则随着照后时间的延长呈现逐渐增加的变化趋势^[2]。

2.2 集落形成率

半固体琼脂培养是当前检测转化细胞最为常用和较可靠的方法, 我们在此与DNA-P量的变化进行了比较, 结果见表 2。在照后第20代, 照射组细胞集落形成率与对照组相似, 缺乏形成集落能力, 而肿瘤细胞阳性对照组则高达181%;照后第30代, 照射组细胞集落形成率为1.5%, 与对照组比较差异有非常显著性(P < 0.01);照后第40代, 照射组细胞集落形成率进一步增高为18.3%(P < 0.01), 表明照射组细胞具有恶性转化特征。

3 讨论

DNA-P是DNA合成的关键酶^[3], DNA-P的活性变化反映细胞的增殖能力, 其活性随着细胞生长速度的增加而升高。本实验观察到, 接受4 Gy γ射线照射的Wistar大鼠肺细胞, 随着照射后时间的延长, DNA-P活性不断增加, 表明细胞的增殖能力不断增加, 而肿瘤细胞组DNA-P活性明显高于正常Wistar大鼠肺细胞, 且经过一定时间传代处置后, HTC细胞DNA-P相对活性基本保持不变, 说明DNA-P活性测定可以用于良、恶性细胞的对比分析, 且本实验方法稳定性较好。

我们在实验中观察了受4 Gy γ射线照射后的Wistar大鼠肺成纤维细胞形态学转化和非锚着依赖性生长能力的获得结果表明, 4 Gy γ射线照射后的第10代和20代, Wistar大鼠肺细胞形态无明显改变, 半固体琼脂集落形成能力没有明显增高; 照后第30代细胞形态发生改变, 细胞排列紊乱, 复层生长, 形成克隆; 照后第40代克隆形成率进一步增高, 表明细胞获得非锚着依赖性生长能力, 说明正常细胞发生了向恶性细胞的转化。而DNA-P活性在细胞发生形态学转化和获得非锚着依赖性生长能力之前的第20代即已出现升高, 这一实验说明, 细胞转化与DNA-P活性密切相关, 提示DNA-P活性的测定可被用于细胞转化的早期观察指标。