非稳定性和稳定性染色体畸变在照射后若干年甚至几十年都可存在于人外周血淋巴细胞之中, 但前者将会随照后时间的延长而逐渐丢失, 而后者则基本上能保持恒定。通过离体实验以及对原爆幸存者、事故受照者的研究表明, 稳定性畸变(主要是易位)与辐射剂量也存在一定的剂量效应关系。因此, 对于早先若干年的照射, 可利用稳定性畸变估算剂量。荧光原位杂交技术在检测染色体重排, 特别是染色体易位方面有其独特的优点, 如直观、准确、快速等。本文应用双色荧光原位杂交技术检测4例¹⁹²Ir源事故受照者照后8个月外周血淋巴细胞的染色体易位并估算生物剂量。

1 材料和方法 1.1 人员受照情况

1998年11月8日, 广东省茂名市某检测科技总公司一名工人发现该公司探伤机少了一台(该机内装¹⁹²Ir放射源, 出厂前活度为3.49 ×10¹² Bq, 丢失前活度为5.55×10¹¹ Bq), 25日, 在某废品收购站发现该探伤机, 并于当天下午回收。这次事故中主要有6名群众受到意外照射, 但均属低剂量率、小剂量照射, 未发现急性放射病员。照后8个月, 选择4个主要受照人员“燕”(男, 30岁)、“容”(男, 40岁)、“润”(女, 21岁)和“伟”(男, 4岁)进行追踪研究。

1.2 方法 1.2.1 培养与制片

RPMI 1 640 (含20 %小牛血清, 庆大霉素100 U/ml及适量PHA) 4.5 ml加抗凝血0.5 ml, 37 ℃恒温培养52 h。在培养的同时加秋水仙素, 终浓度为0.05 μ g/ml。收获细胞时, 0.075 mol/L KCl低渗处理20 min, 用新鲜固定液(甲醇:冰乙酸=3: 1)预固定一次后, 再固定3次。将细胞悬液放置冰箱-20 ℃保存。

1.2.2 荧光原位杂交 1.2.2.1 探针及检测试剂

生物素(biotin)标记的1号、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的4号全染色体探针及双色荧光检测试剂盒均购于英国Cambio公司。

1.2.2.2 原位杂交

原位杂交方法按试剂生产商提供的操作程序略加修改。取出储存于-20 ℃的细胞悬液滴片, 气干过夜。染色体标本经RNase(100ug/ ml)处理后在变性液(70 %甲酰胺/ 2×ssc, pH7.0)中65 ℃变性2 min, 然后置70%冰乙醇中2 min, 乙醇系列脱水, 气干。分别吸取7.5 μl l号和4号全染色体探针, 混合后65 ℃水浴中变性10 min, 再放37 ℃水浴中60 ~ 90 min, 将15 μl探针混合液加到杂交区, 42 ℃杂交过夜。

1.2.2.3 检测

杂交后标本洗脱后, 依次进行信号检测和扩增: (1)加60 μl Texas Red标记的Avidin, 37 ℃温育, 洗脱; (2)加60 μl Biotin标记的抗Avidin抗体和兔抗FITC抗体混合液, 37 ℃温育, 洗脱; (3)加60 μl Texas Red标记的Avidin和FITC标记的抗兔IgG抗体混合液, 37 ℃温育, 洗脱。乙醇系列脱水后, DAPI复染。用01ympus BX 60荧光显微镜, 选择Texas Red/ FITC/ DAPI三色虑光片进行观察, 可同时看到红(Texas Red)、绿(FITC)、蓝(DAPI) 3种颜色。

1.3 畸变的识别

正常分裂相含一对红色(1号)和一对绿色(4号)荧光的染色体; 双色(红/绿、红/蓝、绿/蓝)染色体带一个着丝粒者为完全易位、不完全易位或插入。

1.4 统计处理

FISH法测出的部分基因组易位率或双着丝粒体率(F_p)可通过下式转换为基因组易位率或双着丝粒体率(F_G): F_G =F_P/ 2.05f_P(1-f_P), 式中f_P为全染色体探针所覆盖的染色体在全基因组中所占份额^[1]。

2 结果与讨论

表 1列出了用FISH技术检测的4例事故受照者外周血淋巴细胞的易位率以及根据Straume等^[2]推荐的方程: H =[(YK) /α] Q所估算的剂量。式中H为生物剂量(Gy), Y为事故受照者的易位率, K为易位的自发畸变率, α为辐射诱发易位的线性平方剂量效应方程中的线性项系数, Q为辐射品质因子。这里K、α分别采用本室测定的自发畸变率0.32 %及用FISH方法建立的剂量效应方程中的线性项系数0.041 9。4例事故受照者的平均易位率为0.94%, 显著高于自发畸变率(P < 0.01), 用易位率估算的生物剂量与物理剂量基本一致。

Lucas等^[1]应用FISH技术检测了20名原爆幸存者外周血淋巴细胞的易位率, 发现易位率与DS 86估算的剂量之间有良好的剂效关系, 并且与离体照射的剂效关系相近。Straume等^[3]应用1, 2, 4号和1, 3, 4号两套全染色体探针分别对巴西Goiania的3名事故受照者进行易位分析并估算受照剂量。结果表明, 事故后1年用FISH方法估算的生物剂量与照后立即用常规法(检测双着丝粒体率)估算的生物剂量基本一致。Snigiryova等^[4]用FISH技术检测到切尔诺贝利核事故后, 34名从事核电站去污、重建等工作的人员在受照后数年的平均易位率为(1.1±0.13)%, 据此估算的平均生物剂量为0.25 Gy, 与记载的平均剂量当量0.26 Sv非常吻合。此外, Lindholm等人^[5]对一起¹³⁷Cs源辐射事故中18例事故受照者照后同时用FISH方法与常规法估算剂量, 发现, 两种方法估算的结果相一致。所有这些表明, 用FISH方法估算早先受照者的受照剂量是可行的, 结果也是可靠的。

表 2是在照后8个月与照后数天内, 用常规方法分析的非稳定性染色体畸变结果。照后8个月, 4例事故受照者的双十环、无着丝粒断片及总畸变率分别为0.13 %, 0.40 %和0.53 %, 均明显低于照后数天内的分析结果。

本研究和以往的研究都表明, 作为传统生物剂量计的双着丝粒体畸变会随照后时间的延长而丢失, 到目前为止, 还未发现这种丢失与照后时间之间有某种规律可循。易位则不同, 它们能在照后稳定存在于个体内若干年甚至几十年。FISH方法能准确、快速地检测易位, 因此, 对早先受照者的剂量估算或重建比常规法更为敏感、更为准确。