造血和免疫功能损伤是照射后的主要病理变化, 促进造血和免疫功能的恢复是目前急待解决的问题。IL-6在造血和免疫方面的作用已得到证明, 但对其机理了解的不多。我们以照射小鼠为模型, 探讨IL-6促进血小板生成和提高免疫功能的作用并对机理进行了初步探讨。

1 材料和方法 1.1 动物

AMMS/5纯系雄性小鼠（军事医学科学院动物中心繁殖），合格证号013032, 体重18~22克, 8 ~ 12周龄。IL-6于照后1-2 h内首次给药，皮下注射，1d两次，每天200μg/kg, 连续4 d，对照组给生理盐水连续4 d, 动态观察23 d外周血象变化。每组各10只小鼠。

1.2 照射条件

本所⁶⁰Co γ源, 实验小鼠一次全身照射，照射剂量率为88.9~ 94.0 cGy/min。剂量为6.5 ~ 8.0 Gy。

1.3 药物及配制

实验中所用IL-6为军事医学科学院生产，制剂标示量为1.85 mg/ml，生物活性为2.3 ×l0⁷U/ml。给药前用生理盐水稀释至所需浓度。

1.4 外周血细胞测定

小鼠经6.5 Gy照射后，尾静脉取血20 μl，稀释后用F-800血细胞自动计数仪计数红细胞、白细胞、血小板和血红蛋白等指标。

1.5 存活率

⁶⁰Co γ射线一次全身照射8.0 Gy小鼠，观察30 d存活率。

1.6 淋巴细胞转化率

小鼠经6.5 Gy照射后，在第14, 第28 d分别脱臼处死待测小鼠，取出脾脏，研碎后用Hanks液洗2遍，用小鼠淋巴细胞分层液分出单个核细胞，显微镜下计数有核细胞，调细胞数为5× 10⁶/ ml。将此细胞悬液100 μl加人96孔板，每孔再加人100 μl含ConA 2.5 μg/ml 1 640液, 5%CO₂, 37 ℃培养3 d。细胞终止培养前3 h取出，轻吸弃上清100 μl, 加MTT 20μl，置孵箱内继续培养3 h后加0.01 mol/L酸化异丙醇100 μl, 振荡3~5 min后，用酶联仪（滤光片波长为570 nm)检测OD值。

1.7 细胞程序性死亡检测

经8 Gy照射后脱曰处死待测小鼠，从股骨中冲出骨髓细胞，加HL缓冲液1 ml混匀，室温放置5 min, 2 000 min^-1离心5 min, 倾去上层液，沉淀重复上面步骤1次后，加生理盐水液洗2次，沉淀加细胞裂解液250 μl，混匀, 37 ℃孵育3 h，加人酚/氯仿/异戍醇(25:24:1)300 μl，振荡20 s混匀后, 10 000 min^-1离心10 min, 取上清加氯仿/异戍醇(24:1)300 μl, 振荡10 ~ 20 s混匀，10 000min^-1, 离心10 min，小心取出上层水相于另管中，用酚/氯仿/异戍醇重复处理一次后，加1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇混匀，-20℃过夜，12 000 min^-1离心10 min, 倾去上层液，沉淀加70%乙醇，翻转混匀，12 000 min^-1离心10 min, 倾去上层液，真空干燥，贮于-20 ℃备用，用前加注射用水或100 μlTE缓缓冲液，置50 ℃ 1 h，使DNA溶解。

1.8 琼脂糖电泳

DNA样品与上样缓冲液5:1(V/ V)混匀，将此混合液10 μl置1.8%琼脂糖凝胶孔中(含溴化乙锭0.5μg/ml)中，电泳1.5 h(电压60V)，紫外灯下观察并照相。

1.9 统计学方法

采用SAS软件包，在PC上进行D应用相关的统计分析方法。

2 实验结果 2.1 IL -6对受照射小鼠外周血细胞和免疫功能的影响 2.1.1 对外周血的影响

小鼠受照射后1个月内，外周血血小板的变化规律为:照后第10 d血小板降至最低值，随时间的延长缓慢恢复，至照后第23 d血小板恢复为照前的水平。使用IL-6可以提高不同时间点的血小板数。照后第14d、17 dlL-6组高于对照组（P < 0.05)。表明IL -6可以促进照射小鼠血小板的恢复（图 1)。

小鼠受照射后1个月内，外周血红细胞的变化规律为：照后第14 d红细胞降至最低值，随时间的延长缓慢恢复，至照后第23 d红细胞恢复为照前的水平。使用IL-6可以提髙不同时间点的红细胞数。照后第14-21 d给药组外周血红细胞数髙于对照组，有明显差异（P < 0.01)。说明IL-6可以促进照射小鼠外周血红细胞的恢复（图 2)。

小鼠受照射后1个月内，外周血血红蛋白的变化规律为：照后第14 d血红蛋白降至最低值，随时间的延长缓慢恢复，至照后第23 d血红蛋白恢复为照前的水平。使用IL-6可以提高不同时间点的血红蛋白水平。照后第14 d、21 d给药组比对照组高（P < 0.05)。说明IL-6可以促进照射小鼠血红蛋白的恢复(图 3)。

小鼠受照射后1个月内，外周血白细胞的变化规律为:照后第7 d白细胞降至最低值，随时间的延长缓慢恢复，至照后第28 d白细胞恢复为照前的50%左右。使用细胞因子可提高不同时间点的白细胞数。照射后第14 d、17 d给药组白细胞比对照组高，但无统计学的差别。

综合以上实验结果，表明IL-6可以有促进照后外周血血小板、红细胞、血红蛋白恢复的作用。

2.1.2 IL-6对照射小鼠免疫功能的影响

照后第14 d实验组小鼠淋巴细胞转化率无明显差别，照后第28 d IL-6组小鼠淋巴细胞转化率明显高于对照组（P < 0.01)，表明IL-6可明显提高6.5 Gy照射小鼠淋巴细胞转化率，对照射小鼠免疫功能的恢复有促进作用（图 4)。

2.1.3 IL-6对照射小鼠30 d存活率的影响

照后第3 d各组小鼠开始死亡，第5 ~ 18 d为死亡髙峰, IL- 6组存活率高于对照组。照后笫30 d, IL- 6组存活率是对照组2倍。

2.2 IL-6促进造血功能恢复和提高存活率的机制

辐射引发细胞的程序性死亡。目前对IL-6促进造血功能恢复和提高存活率的机制了解不彻底。这种作用是由于抑制受照射小鼠骨髓细胞程序性死亡(PCD)的发生，还是经过一段较长的时间，通过刺激骨髓残余造血干细胞的增殖、分化？为此研究了IL-6对受照小鼠骨髓细胞程序性死亡(PCD)形成的影响。

首先选择8.0 Gy剂量照射，结果发现照后48 h，骨髓细胞发生PCD。说明辐射引起骨髓细胞发生PCD需要一定的时间。

照射后立即给予IL- 6的治疗，照后48 h各组骨髄细胞均出现PCD，表明造血生长因子治疗后不能抑制照射引起的PCD发生。

3 讨论

Selig^[1]、Ishibashi^[2]曾观察了IL - 6促进小鼠、狗造血功能恢复的作用，但他们使用的照射剂量不大、在大剂量照射情况下IL - 6是否促进造血功能恢复的作用？另外已发现IL-6可以作用于免疫系统，那么IL-6对受照动物的免疫系统有何影响？机理如何？为此，我们以照射小鼠为模型，研究了IL - 6对受照射小鼠造血和免疫功能的影响并对机理进行了初步探讨。

IL-6在体内主要由单核/巨噬细胞产生, 来自中胚层的如上皮细胞、成纤维细胞也可产生。在体外可由LPS、THF、IL- 1、TPA、GM-CSF、IL-3、IL-4、IFN -R诱导产生。从实验结果来看，免疫功能的恢复速度慢于造血系统的恢复，照后第28 d脾脏淋巴细胞转化率只有照射前的60%左右D IL-6可以促进受照小鼠造血和免疫功能的恢复[3_4]，提高照射小鼠的存活率。其原因是由于IL-6具有多效性，一方面刺激造血干细胞的增生、分化，另外还作用于其它系统(如免疫系统)使其功能改善。免疫功能和造血功能的共同恢复有利于照后小鼠存活率的提高，表明免疫功能也是一个重要的指标。

为了探讨细胞因子提高存活率的原因，我们研究了IL一6应用对受照小鼠PCD形成的影响。结果表明，其促进了照后机体的造血功能的恢复是通过刺激残余骨髓造血干细胞的増殖、分化，该过程需要一段较长的时间，而不是通过抑制照后即刻细胞的程序性死亡。我们只观察了对8. 0 Gy照射小鼠PCD形成的影响，改变照射剂量(如降低照射剂量）是否会起到抑制照后细胞程序性死亡的作用是将要探讨的问题。