放疗在杀灭肿瘤细胞的同时也损害了机体的正常组织和功能, 如何更有效地杀伤肿瘤细胞, 积极地保护机体的正常组织和功能, 已成为当今放疗领域的主要研究课题之一。大量研究证明^{[1, 2]}, 低剂量辐射在一定条件下可以诱导机体的兴奋性效应和抵抗再次大剂量损伤的适应性反应。本文探讨了低剂量辐射对荷瘤小鼠肝细胞抗氧化酶的影响及合并大剂量照射后肿瘤组织的变化情况。

1 材料和方法 1.1 实验动物和分组

昆明种小鼠, 雄性, 22 ±2g (白求恩医科大学实验动物部提供), 隔离检疫1周后移植肿瘤。每只鼠右后肢皮下接种S₁₈₀肉瘤0.1ml (1 ×10⁷细胞/ml), 1周后待肿瘤长出, 依肿瘤生长大小分成若干等级, 再平均分成对照组(铅屏蔽假照射)、D_1.1组(施加一次低剂量全身辐射)、D_1.7组(每天施加一次低剂量全身辐射, 共7次)、D_2.7组(每天施加一次2Gy的大剂量肿瘤局部辐射)以及D_1.7+D_2.7组(每天大剂量照射前6小时施加一次低剂量辐射)。

1.2 照射条件

用philips深部X射线治疗机, 电压200kV, 电流10mA; 滤板Cu 0.5mm。Al 1.0mm。使用自制木质动物盒盛装小鼠。全身低剂量照射(D₁)为0.05Gy, 剂量率为0.05Gy· min^-1, 肿瘤局部大剂量照射(D₂)为2Gy, 剂量率为0.288Gy· min^-1。照射顺序:每天先行D₁, 6小时施加D₂照射。

1.3 检测与方法 1.3.1 肝细胞过氧化脂质(LPO)的测定

将肝脏用0.05mol PBS制成10%匀浆, 加0.4mL 8.1% SDS、3.0mL 20%乙醇(pH3.5)、3.0mL 0.67% TAB。煮沸(100℃)1小时, 冷却至室温后3000 rpm 15 min, 取上清液532nm处测OD值。

1.3.2 肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶(DTNB)测定

取上述10%肝匀浆0.2mL加1.0nmolGSH 0.4mL, 37℃水浴预热5min, 加入37℃水浴预热的H₂O₂ 0.2mL, 37℃水浴反应3min, 加偏磷酸沉淀液4.0mL, 3000 rpm离心10min, 取上清2.0mL加0.4mL蒸馏水, 1.6mL偏磷酸沉淀液作为试剂空白。各加0.32mol Na₂HPO₄ 2.5mL, 加DTNB显色液0.5mL反应1min, 5min内于422 nm处测OD值。

1.3.3 肝细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

取10%肝匀浆0.2mL, 加入0.9mL 20%乙醇应用液中, 后加入Tris-HCI 1.0mL, Tritonx-100 0.2 mL, NBT 0.5ml, 邻苯三酚50μL, 甲醇0.5mL。于450nm处测OD值。

1.3.4  

肿瘤组织石蜡切片及HE染色方法见文献^[3]。

1.3.5 肿瘤组织吖啶橙荧光染色法

切片经各级酒精下行至水; 2.1%醋酸水溶液洗30sec, 水洗; 以0.01%吖啶橙磷酸缓冲液洗(pH 4.8)染10-15min, 用磷酸缓冲液冲洗; 浸入1/10M CaCl₂ 30sec, 以磷酸缓冲液洗后加盖片。

2 结果 2.1 单纯应用低剂量辐射全身照射对小鼠肝细胞丙二醛(MDA)、GSH-Px及SOD的影响

荷瘤小鼠经过低剂量照射后肝细胞内MDA含量下降, 当低剂量刺激到第七天时(即D1、7), 与对照组相比差异显著(P < 0.05), 而经过低剂量照射7天后, GSH-Px和SOD活性均比对照组明显升高, 两种酶的活性与对照组相比出现显著性差异(P < 0.05), 详见表 1。

2.2 低剂量辐射在合并肿瘤局部放疗后对肝细胞内(MDA)、GSH-Px及SOD的影响

在低剂量辐射合并肿瘤局部大剂量放疗后与单纯放疗组比较, 荷瘤小鼠肝细胞MDA下降, GSH-Px和SOD活性明显升高, 且分别与对照组比较呈高度显著性差异, 详见表 2。

2.3 低剂量辐射作用后肿瘤组织病理学变化 2.3.1 对照组

癌细胞排列紧密, 分布不均匀, 周边侵入到肌层, 呈明显的浸润生长, 未见完整的包膜。癌细胞形状不规则, 体积增大, 胞核丰富, 增大呈多形性, 色浓染, 胞浆与胞核比值明显减少(约1:3.5), 呈旺盛生长状态。周围肌纤维被癌细胞浸润, 正常结构被破坏, 肌纤维在照片上呈孤岛状, 肌纤维内及接近癌组织附近有零星淋巴细胞浸润。组织荧光分析表明, 癌细胞排列密集, 不规则, 细胞核明显增大, 几乎占满了整个细胞(故整个细胞几乎都显示出橙黄色), 呈多形态性, 色浓染。周围纤维层有癌细胞浸润, 肌纤维中有小淋巴细胞浸润。

2.3.2  

经过低剂量辐射照射后, 与未处理组比较, 癌组织浸润生长少量或不可见, 癌组织与肌纤维之间有类似软组织样物质生长, 癌细胞核大小未见明显改变, 周围纤维孤岛状减少, 可见有少量退化性细胞, 癌组织边缘及肌纤维内有较多的淋巴细胞浸润, 可见有毛细血管增生。组织荧光下可见有大量淋巴细胞浸润, 偶可见有癌细胞呈核固缩性死亡现象。

2.3.3  

单纯大剂量照射时癌组织边缘有类似纤维样被膜生长, HE染色可见, 癌组织排列疏松, 癌床内有散在的癌细胞坏死灶, 位于组织中心有许多空隙, 期间可见到蛋白样物质及细胞碎片, 偶可见到异物巨细胞出现, 癌细胞体积普遍比对照组减少, 胞浆与胞核着色较淡, (浆:核比在1:1.5~2)。荧光片可见, 癌细胞排列松散, DNA的橙黄色着色较淡, 有大片无明显细胞轮廓的坏死灶, 灶内未见有小淋巴细胞浸润。

2.3.4 D₁+D₂组

与单纯D₂组比较, 未见有癌组织浸润生长, 癌组织内有类似纤维组织生长, 其可见新生毛细血管增生, 肌纤维中及肌与癌组织见有大量小淋巴细胞和泡沫样细胞浸润, 偶可见异物巨细胞出现, 组织荧光表明, 癌细胞大小不等, DNA荧光着色极淡, 细胞核固缩现象明显多见, 组织内可见大面积坏死灶, 其边缘有大量小淋巴细胞浸润。

3 讨论

低剂量辐射对移植肿瘤鼠机体整体照射表明, 肝细胞内过氧化脂质代谢产物MDA与对照组比较含量明显降低, GSH -Px、SOD两种酶活性却明显升高, 亦与对照组比较均有显著性差异(P < 0.05)。有文献报道^[4], 肿瘤患者体内过氧化脂质(LPO)含量多明显增高, 而一定浓度的LPO会促进肿瘤的发生和发展。研究证明, 每天一次的0.05Gy低剂量X射线照射可诱导机体抗氧化酶系统, 促使抗氧化酶活性增高, 从而再清除荷瘤机体的自由基方面发挥作用。进一步研究发现, 同一条件下的低剂量辐射在移植肿瘤机体局部肿瘤放射治疗中的应用, 随着低剂量辐射的介入使相应组的累加辐射剂量增加了, 肝组织中的过氧化脂质氧化产物MDA含量不但没有增加, 反而含量减少, 同时相应组的抗氧化酶如GSH-Px、SOD的含量明显上升, 且该照射组的肿瘤体积却明显减少(已另文发表), 说明低剂量辐射在模拟肿瘤局部放疗的实验中应用在抵抗自由基方面是有益的。