由于细胞凋亡是细胞的一种主动生理过程, 在机体组织更新、细胞发育和维持内环境的稳定方面起着重要的作用[1]。我们已经通过荧光镜揭示了作为核电站燃料和核武器装料的α辐射体核素浓缩铀235U, 以及作为荧光涂料激发能源和在核辅助动力装置系统中广泛应用的β辐射体核素147Pm诱发免疫细胞凋亡的比较研究[2]。鉴于核能技术的发展, 放射性核素在医学领域内的应用越来越广泛, 如依据α粒子核素具有高线能量转移的生物毒性和射程短的特点[3], 临床上将其与单克隆抗体或药物偶联用于内照射放射治疗病例[4]。但随之而来的是内污染核素对机体细胞产生的凋亡效应。考虑到细胞凋亡涉及到蛋白质的合成, 以及某些蛋白酶的活化等, 为此, 本文探讨了α核素235U内照射诱发免疫细胞凋亡的电镜形态特征观察, 以及蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)和RNA合或抑制剂放线菌素D(ActD)[5]对浓缩铀235U诱发免疫细胞凋亡的防护作用。
1 实验材料与方法 1.1 主要试剂CHX和ActD, 以及MTT均为Sigma公司产品。将CHX和ActD用RPMI 1640全培养液稀释无菌过滤后, 4℃冰箱保存备用, MTT用PBS配制无菌过滤后备用。使用的浓缩铀235UO2F2原液浓度为60mg/ml, 其中235U的丰度为18.9%, 由核工业系统提供。
1.2 细胞培养急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞和巨噬细胞株Ana-1细胞为我院细胞免疫中心室长期冻存和传代培养的。实验所用上述细胞株于含10%灭活新生小牛血清的RPMI 1640全培养液中维持培养, 临实验时取对数生长期的Molt-4细胞, 先用Hank's液洗涤二遍后, 再用全培养液调至实验所需细胞浓度备用。Ana-1细胞则先用0.25%无菌胰蛋白酶消化, Hank's液洗涤三遍去除胰蛋白酶后, 用全培养液RPMI 1640调至所需细胞浓度备用。
1.3 细胞辐照及内照射剂量估算收集实验用Molt-4和Ana-1细胞, 用RPMI1640全培养液调至细胞浓度为2× 106cells/ml。取无菌24孔培养板, 在每培养孔内放置1ml细胞悬液, 然后在每一实验孔中另加入1ml用RPMI 1640全培养液稀释的128.4Bq/ml235UO2F2工作液, 从而使235U的最终放射性活度为64.2Bq/ml, 而对照组每孔加入1ml RPMI 1640全培养液, 使实验孔和对照孔细胞最终浓度为1×106cells/ml。将24孔培养板放置到5%CO2培养器内37℃培养, 经不同时间收集细胞用于细胞凋亡研究。研究中选择的时间观察点分别为3h, 6h, 9h, 12h, 24h和48h。对Molt-4或Ana-1两株免疫细胞受235U内照射不同阶段的累积吸收剂量估算, 参照公式D=AET/ m进行[6]。
实验所用的235U平均α粒子能量为4.4MeV, 其放射性活度为64.2Bq/ml。经估算, 细胞受不同时间的235U内照射后的累积吸收剂量见表 1中所示。
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表 1 235U内照射培养Molt-4和Ana-1细胞不同时间的累积吸收剂量估算 |
分别收集受235U内照射作用不同时间的Molt-4和Ana-1细胞, 洗涤和离心去除游离的放射性核素后, 用3%戊二醛在4℃固定1h, 随后用0.1M、pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤二遍, 再用1%锇酸固定1h, 然后用丙酮液梯度脱水, 树脂包埋后, 用LKB型超薄切片机切取0.05μm超薄切片, 使粘贴在预先覆有支持膜的铜网上, 经醋酸铀-枸椽酸铅染色, 在电镜下观察凋亡细胞形态。
1.5 DNA链断裂程度观察运用JAM法[7]检测凋亡细胞的DNA链断裂程度。先收集经不同时间点培养后的实验组和对照组的Molt-4及Ana-1细胞, 分别离心洗涤后, 计数细胞总数, 用RPMI 1640全培养液将细胞调至1×106cells/ml, 然后加入37kBq的3H-TdR, 置37℃、5%CO2培养器中培养6h, 再次收集细胞, 用Hank's洗涤去除未掺入的3H-TdR。用多头细胞收集器将细胞收集于49型玻璃纤维滤膜上, 用Beckman液体闪烁计数装置计数3H-TdR掺入到细胞DNA中的量, 以cpm表示。因凋亡细胞降解断裂成小片段的DNA, 经洗涤后可通过玻璃纤维滤膜洗脱, 而膜片上经液闪计数的3H-TdR量为未断裂的DNA含量, 反映了每实验组内未凋亡的细胞数量。
235U内照射诱发免疫细胞DNA链断裂程度按如下公式计算:
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所用CHX剂量为10μg/ml, 而ActD为0.5μg/ml, 在用RPMI 1640全培养液调Molt-4及Ana-1细胞至浓度为2×106cells/ml。随即取无菌24孔培养板, 每孔放置1ml细胞悬液, 并分别加入10μg/ml CHX或0.5μg/ml ActD, 而平行对照孔只加入RPMI 1640全培养液, 最后加入1ml用RPMI 1640全培养液稀释的128.4Bq/ml235UO2F2工作液, 使核素235U的终浓度为64.2Bq/ml。将操作完毕的24孔板置于37℃、5%CO2培养器内培养, 经过不同时间的实验观察点收集细胞, 进行细胞凋亡程度观察。
2 实验结果与讨论 2.1 235U诱发免疫细胞凋亡的电镜形态学观察通过电子显微镜观察结果表明, 正常的Molt-4和Ana-1两株免疫细胞在透射电镜下, 可见细胞核形正常, 核内染色质呈不均一分布。而当受235U内照射作用下的Molt-4和Ana-1两株免疫细胞均呈现出核断裂见图 1(图均见封二), 细胞染色质边聚见图 2, 以及膜包裹着的凋亡小体形成如图 3中所示的凋亡细胞形态特征。
2.2 CHX和ActD对235U诱发免疫细胞DNA链断裂的防护作用鉴于DNA链断裂是细胞凋亡的主要指征, 也是对凋亡细胞进行定量分析的主要依据。通过研究, 揭示了由235U内照射作用不同时间所诱发的Molt-4和Ana-1两株免疫细胞的DNA链断裂程度见表 2中所示。结果还显示, 蛋白质合成抑制剂CHX和RNA合成抑制剂ActD都具有显著的抑制由235U诱发免疫细胞DNA链断裂的作用, 从而呈现出明显的对235U辐照所诱发免疫细胞凋亡的防护效果。值得指出的是, 尤其是CHX对Molt-4和Ana-1两株免疫细胞DNA链断裂的防护作用就较ActD呈现的为强。
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表 2 CHX和ActD对235U内照射诱发Molt-4和Ana-1两株免疫细胞DNA链断裂的防护作用 |
机体的免疫系统是防御机制的重要组成部分, 在本研究中揭示了由于浓缩铀235U内照射, 可诱发Molt-4和Ana-1两株具有免疫功能的细胞株凋亡。从而可以理解到在临床上进行内照射放射治疗时或核事故的放射性核素内污染引起的免疫功能抑制和损伤效应。我们曾揭示了细胞因子对由235U诱发免疫细胞损伤的保护作用[8], 以及在本文中所探讨的蛋白质合成抑制剂CHX和RNA合成抑制剂ActD对核素诱发免疫细胞凋亡的防护作用。而这些防护因子的运用, 将对临床上放射性核素内污染病例免疫功能的调节和增升, 起重要作用, 从而有利于对临床上放射性核素内污染病例免疫功能的评价和预后的监测。
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