定位于人类细胞X染色体上的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt), 对于电离辐射及环境化学诱变剂较为敏感, 实验研究已经证实辐射和环境化学诱变剂单一作用于生物机体均可造成细胞hprt基因突变^{〔1, 2〕}。但是在人类实际生活环境中, 辐射和化学致癌物质常常同时存在并复合作用于人体。因此, 开展电离辐射和环境化学致癌物质复合效应研究不仅具有理论意义, 而且具有实际应用价值。本文应用细胞质分裂阻滞法(CB法), 检测了⁶⁰Coγ射线和苯并芘对人胚肺细胞hprt基因突变损伤效应, 以期阐明⁶⁰Coγ射线合并苯并芘所致hprt基因突变损伤复合效应的规律和特点。

1 材料与方法 1.1 人胚肺细胞

为本实验室建立的HEL -9402细胞系。细胞取自水囊引产的6个月女性胎儿。染色体核型分析为正常二倍体核型(2n=46)。37℃、5%CO₂条件下, 贴壁培养于含15%小牛血清的RPMI-1640培养基中。

1.2 作用因子

⁶⁰Coγ射线细胞吸收剂量率为2.44Gy·min^-1, 剂量分组分别为0.25、0.5、1、3、5Gy。苯并芘剂量分组为0.25、0.5、1、3、5μg/ml(作用24小时)。复合作用组为1Gy⁶⁰Coγ射线复合1μg/ml苯并芘。

1.3 人胚肺细胞hprt基因突变检测

本实验采用细胞质分裂阻滞法(CB法)^〔3〕, 检测人胚肺细胞hprt基因突变。⁶⁰Coγ射线和苯并芘处理后第4代的人胚肺细胞分为两组, 其中一组加入终浓度为0.1mM的6-TG(6- thioguanine), 37℃培养30h, 同时向两组中加入终浓度为6μg/ml的细胞松弛素-B(CytB), 继续培养42h。醋酸甲醇固定, 细胞悬液制片, Giemsa染色。显微镜下计数双核或多核细胞数。

1.4 hprt基因突变变异系数

变异系数定义为, 含6-TG培养的1000个细胞中双核或多核细胞数除以不含6-TG培养的1000个细胞中双核或多核细胞数。

2 结果 2.1 ⁶⁰Coγ射线致人胚肺细胞hprt基因突变

人胚肺细胞经不同剂量⁶⁰Coγ射线作用后第4代, 反映细胞hprt基因突变损伤的细胞变异系数, 除0.25Gy剂量组外, 在各剂量作用组均明显增加, 经统计学检验差别显著(表 1)。

2.2 苯并芘致人胚肺细胞hprt基因突变

经不同剂量苯并芘作用后第4代的人胚肺细胞, hprt基因突变异系数, 在0.25和0.5μg/ml剂量组虽然有所增加, 但无统计学意义。当剂量增加到1μg/ml以上时, 各剂量作用组hprt变异系数均明显增加, 经统计学经验差别显著(表 2)。

2.3 人胚肺细胞hprt基因突变与辐射及苯并芘作用剂量间的关系

人胚肺细胞hprt基因突变变异系数, 随⁶⁰Coγ射线照射剂量及苯并芘作用剂量变化的量效关系, 均表现为随着剂量的增加而逐渐增加(附图)。

对不同剂量⁶⁰Coγ射线和苯并芘作用后的人胚肺细胞hprt变异系数与作用剂量之间的关系进行回归分析。结果表明, hprt变异系数与γ射线和苯并芘的剂量效应关系分别满足如下方程:

(1)

(2)

式中, Y为变异系数; X₁:⁶⁰Coγ射线剂量(Gy); X₂:苯并芘剂量(μg/ml)。

2.4 ⁶⁰Coγ射线合并苯并芘致细胞hprt基因突变复合效应

接受1Gy⁶⁰Coγ射线合并1μg/ml苯并芘复合作用的人胚肺细胞, hprt变异系数不仅明显的高于对照组, 与单纯γ射线作用组及苯并芘作用组比较, 亦显著性地增高(表 3)。

3 讨论 3.1

本实验应用细胞质分裂阻滞法检测辐射及苯并芘对人胚肺细胞hprt基因突变损伤效应。当细胞培养体系存在嘌呤类似物(6 -TG)时, 野生型细胞因摄取嘌呤类似物而死亡, hprt突变型的细胞对培养体系中的嘌呤类似物表现出抗性。因此, 当细胞hprt基因突变时, 通过检测细胞对嘌呤类似物抗性出现的频率, 即可确定细胞hprt基因突变位点的突变频率。CB法利用细胞松弛素B阻止细胞质分裂而不影响细胞核分裂这一特性, 检测对嘌呤类似物出现抗性的突变细胞。hprt基因突变细胞在含6-TG培养体系中继续存活分裂, 由于胞质分裂被抑制, 因而出现双核或多核细胞。检测双核或多核细胞出现的频率, 即可确定细胞hprt基因位点的突变频率^〔3〕。本实验观察到, 人胚肺细胞经不同剂量⁶⁰Coγ射线和苯并芘作用后, 反映细胞hprt基因突变频率的变异系数, 在各剂量作用组均明显增加, 表明⁶⁰Coγ射线和苯并芘均造成了人胚肺细胞hprt基因突变位点的突变损伤。

3.2

体细胞hprt基因突变损伤对于电离辐射和化学致癌物较为敏感。许多研究工作者, 致力于不同LET辐射^{〔4, 5〕}和不同剂量率照射^{〔6, 7〕}及不同环境化学物质^{〔8, 9〕}诱发hprt基因突变的量效关系变化规律和特点的研究。也有部分研究工作者, 应用分子生物学的实验手段, 开展了辐射及化学诱变剂诱发细胞hprt基因突变谱的分析^{〔10, 11〕}。本实验对⁶⁰Coγ射线和苯并芘作用后, 人胚肺细胞hprt基因突变与作用因子作用剂量之间的关系进行了研究。结果表明, hprt基因突变与⁶⁰Coγ射线和苯并芘作用剂量之间存在着良好的线性正相关的剂量效应关系, 线性相关系数分别为0.9984和0.9793, 显著性检验P值均小于0.01。证明hprt基因突变可以作为电离辐射和环境化学物质致突效应及量效关系研究的观察指标。

3.3

⁶⁰Coγ射线合并苯并芘复合作用后, 人胚肺细胞hprt变异系数明显地高于对照组的同时, 与单纯γ射线或苯并芘作用组比较, 亦显著性地增高。复合作用组细胞hprt变异系数高于单纯γ射线及苯并芘作用组细胞hprt变异系数之和, 表明⁶⁰Coγ射线合并苯并芘诱发人胚肺细胞hprt基因突变具有复合加强作用。