电离辐射和化学致癌物是诱发人类肿瘤生成的主要物理、化学因素,在体外实验研究已经证实,辐射和化学致癌物可以分别诱发细胞的恶性转化[1、2]。但是在实际生活环境中,辐射和化学致癌物质常常同时存在并复合作用于人体。因此,研究电离辐射和化学物质复合致癌效应,不仅具有理论意义,而且具有实际应用价值。本研究应用细胞化学和形态计量学的手段,对60Coγ射线合并苯并芘在体外诱发人胚肺细胞恶性转化过程中,细胞核内AgNORs颗粒数量、大小等形态计量学参数的改变进行了研究,以期阐明辐射合并化学致癌物致癌过程中细胞核内AgNORs形态计量学的变化规律和特点。
1 材料和方法 1.1 细胞培养与样品制备本实验选用人胚肺细胞做为实验研究的观察对象,所用人胚肺细胞为本实验室建立的HEL —9402细胞系。37 C、5%СО2条件F,贴壁培养于含20%小牛血清的RPMI — 1640培养基中。60Coγ射线细胞吸收剂量率为2.44Gy.min1,剂量分组分别为0.25、0.5、1、3、5Gy。苯并班作用浓度分别为0.25,0.5, 1,3, 5μg/ml,作用时间为24小时。复合作用组细胞接受1μg/ml苯并芘作用24小时,同时接受1Gy 60Coγ射线照射。取处理后第五代的人胚肺细胞接种于内置盖玻片的Ф35mm平皿内,2×104细胞/皿,每剂量点、4个平行样品,37 С、5%СO2培养48小时,取出盖玻片制样。
1.2 细胞AgNORs染色平皿中取出载有细胞的盖玻片,D — Hanks液漂洗两次,Carnoy氏固定液固定12分钟,蒸馏水冲洗,1NHC1酸化,双蒸水充分漂洗。银胶染色液32 C避光染色30分钟,4%硫代硫酸钠5分钟,60 C下烤干,阿拉伯树胶封片。H、E染色做为AgNORs染色的对照。
1.3 数据收集及处理应用MIAS — 300型图象分析系统,随机选择测定视场,每个剂量点测量85~133个细胞核。主要分析的参数有:AgNORs颗粒计数、面积等。实验数据经方差分析进行显著性检验。计算机自动挑选系统进行统计回归分析。
2 结果 2.1 不同剂量60Coγ射线作用后AgNORs颗粒的变化接受0.25—5Gy 60Coγ射线作用后第五代的人胚肺细胞,细胞核内AgNORs颗粒计数以及颗粒面积与细胞核面积的比值明M增加(表 1),经统计检验表明,与对照组差别显著(P < 0.05)。
经0.25 —μg/ml苯并座作用后的人胚肺细胞,胞核内AgNORs颗粒数量及AgNORs面积/细胞核面积比值明显增加(P < 0.01),而且随着苯并芘作用浓度的加大呈现逐渐增加的变化规律(表 2)。
经统计回归分析,AgNORs颗粒计数/细胞核与60Coγ射线和苯并芘的剂量效应关系分别满足如下指数方程:
Y=l.63 + 0.81X (1) -0.13X (1)2
Y = 2.52X (2)0.037
Y: AgNORs颗粒数(/细胞核);
X (1): 60Coγ射线剂量(Gy)
X (2):苯并芘剂量(μg/ml)
从附图拟合的剂量效应曲线可以看到, 在γ辐射剂量为0~3Gy剂量范围内AgNORs颗粒计数/细胞核随辐射剂量的增加而逐渐增加,当剂量增加到5Gy时, AgNORs颗粒计数/细胞核较之3Gy剂量组略有下降,但是下降幅度在统计学上无显著性意义(P>0.05)。苯并芘在0 —5μg/ml剂量范围内,AgNORs颗粒计数/细胞核呈现随剂量的增加而逐渐增加的变化规律。
2.3 60Coγ射线复合笨并芘致AgNORs的改变从表 3的结果可以看到,经1Gy 60Coγ射线或1μg/ml苯并芘作用后,人胚肺细胞核内AgNORs颗粒计数及AgNORs颗粒面积/细胞核面积较之对照组均明显增大,单纯照射组和单纯苯并芘处理组之间比较,未见显著性差异(P>0.05); 1Gy60Coγ射线和1μg/ml苯并芘复合作用后,人胚肺细胞核内AgNORs颗粒计数及AgNORs面积/细胞核面积比值发生明显的改变,不仅显著性高于对照组,而且与60Coγ射线或苯并芘单独作用组比较亦显著性升高(P < 0.05)。
电离辐射和化学致癌物质广泛存在于人类生活的各个领域,是造成人类癌症发生率升高的主要物理、化学因素。随着人类生活环境的不断变化,物理和化学因素诱发人类肿瘤生成的研究已经愈来愈引起人们的广泛重视。由于电离辐射和化学致癌物经常是合并存在并同时作用于生物机体。因此,开展物理和化学复合因素致癌效应研究更具有实际应用价值。
体外诱发细胞恶性转化的研究,对于阐明辐射或/和化学物质致癌效应的剂量效应变化规律及致癌危险度估算具有重要意义。AgNORs作为肿瘤细胞核仁增生状态的标志,其在细胞内的数量、大小和分布,反映了细胞的增生活性及其潜在的恶性[3]。随着对AgNORs研究和认识的不断深入,AgNORs已被用于鉴别细胞良恶性[4]以及细胞恶性程度的鉴定中[5]。本实验中观察到,人胚肺细胞接受60Coγ射线或苯并芘作用后,随着剂量的增加,单位细胞核内AgNORs颗粒计数逐渐增加,表明细胞的增生活性及潜在的恶性随辐射剂量或化学致癌物作用剂量的增加而增加。单位细胞核内AgNORs颗粒计数与60Coγ射线或苯并芘作用剂量的量效关系,经计算机拟合回归方程,分别满足一定的指数方程,拟合曲线的复相关系数分别为r=1和r=0.9989, 表明其剂量效应改变具有一定的规律性。这种剂量效应关系规律性的变化为在体外定量地研究辐射或化学致癌物质诱发细胞恶性转化提供了一个较为理想的定量分析研究的手段,亦可望成为观察细胞恶性转化程度的指标,将有助于致癌危险度估算的研究。
实验研究结果表明,1Gy 60Coγ射线复合1μg/μl苯并芘作用后的人胚肺细胞,细胞核内AgNORs颗粒计数及AgNORs面积/细胞核面积比值发生明显的改变。不仅显著性地高于对照组,而且与60Coγ射线或苯并芘单独作用组比较亦显著性地升高(P < 0.05)。这一结果说明物理致癌因素复合化学致癌物质在诱发细胞恶性转化过程中,起到相互加强的作用。在考虑致癌物质致癌危险度估算时,这种物理和化学因素的复合作用效应应当引起相应的重视。
[1] |
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