类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA) 是一种常见的自身免疫性疾病, 以滑膜炎症、滑膜组织增生、血管翳形成、关节软骨和骨侵蚀等为主要病变特征, 最终可出现进行性的关节破坏, 造成残疾, 严重影响患者的生活质量, 为个人、家庭和社会带来沉重负担^[1-3]。随着对RA病理机制研究的不断深入, 越来越多的证据表明CD4⁺ T细胞在其中扮演着重要的角色^[4]。在抗原刺激和特定细胞因子的作用下, naïve CD4⁺ T细胞可分化为不同的亚型, 包括辅助性T细胞1 (T helper 1, Th1)、Th2、Th17和调节性T细胞(regulatory T, Treg) 等^[5]。它们在转录因子和功能性因子等层面发生相互作用, 维持着精妙的平衡, 一旦该平衡被破坏, 即可导致机体免疫紊乱。其中, Th17和Treg细胞比例的失衡已被证实参与RA的发生和发展。资料显示, RA患者滑液和外周血中Th17细胞比例明显上调, 且与疾病严重程度呈正相关性; Treg细胞应答则处于相对不足的状态, 且活动期RA患者外周血单个核细胞中叉头框蛋白P3 (forkhead box P3, Foxp3)/维甲酸相关孤核受体γt (retinoic acid-related orphan receptor γt, RORγt) 比值较非活动期RA患者明显降低^[6-8]。因此, 恢复Th17/Treg平衡为RA治疗的有效策略。

桑色素(2', 3, 4', 5, 7-pentahydroxyflavone, morin) 是从桑科植物中分离得到的一种黄酮类化合物。现代药理学研究显示, 桑色素具有抗炎、抗氧化、神经保护和抗菌等活性^{[9, 10]}。此外, 桑色素可显著抑制二丁酸佛波醇酯和离子霉素联用或刀豆蛋白A所致T细胞活化和增殖, 表明其具有良好的免疫调节作用^{[11, 12]}。然而, 桑色素对CIA小鼠的治疗作用及关节炎状态下Th17/Treg失衡的改善作用均未见报道。基于此, 本研究建立胶原诱导的小鼠关节炎模型, 考察桑色素的治疗效果, 并从恢复Th17/Treg平衡的角度展开机制初探。

药品与试剂  桑色素购自南京景竹生物科技有限公司; 来氟米特购自苏州长征-欣凯制药有限公司; 羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂有限公司; 鸡II型胶原购自Chondrex公司; 弗氏完全佐剂购自Sigma公司; 佛波酯/离子霉素混合物、布雷非德菌素A/莫能霉素混合物、固定 & 破膜试剂盒、小鼠IgG ELISA试剂盒、小鼠IgG1 ELISA试剂盒和小鼠IgG2a ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司; Foxp3/转录因子染色试剂盒、异硫氰酸荧光素(fluorescence isothiocyanate, FITC) 标记的抗小鼠CD4抗体、藻红蛋白(phycoerythrin, PE) 标记的抗小鼠白细胞介素-17A (interleukin-17A, IL-17A) 抗体、别藻蓝蛋白(allophycocyanin, APC) 标记的抗小鼠CD25抗体和PE标记的抗小鼠Foxp3抗体购自eBioscience公司; 小鼠肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-6和IL-1β ELISA试剂盒购自达科为生物技术股份有限公司; 小鼠前列腺素E₂ (prostaglandin E₂, PGE₂)、基质金属蛋白酶-13 (matrix metalloproteinase-13, MMP-13) ELISA试剂盒和一氧化氮(nitric oxide, NO) 试剂盒购自南京建成生物工程研究所; HiScriptTM Q RT SuperMix和AceQTM qPCR SYBR Green Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

实验仪器  双蒸纯水仪(型号: Direct-Q with pump), 美国Milipore公司; 超高速冷冻离心机(型号: 3K-15), 湖南湘西仪器装备有限公司; 逆转录仪(型号: T100) 和实时荧光定量PCR仪(型号: CFX Connect), 美国Bio-Rad公司; Multiskan spectrum酶标仪(型号: 1500), 美国Thermo Fisher公司; 流式细胞仪(型号: FACS Calibur), 美国BD公司; Micro-CT成像系统(型号: SkyScan 1176), Bruker公司。

实验动物  雄性DBA/1小鼠, 6~8周, 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物生产许可证号: SCXK (沪) 2017-0005]。饲养于22 ± 2 ℃的环境中, 自由摄食和饮水, 适应3天后用于后续实验。本研究中动物福利和实验过程均遵循中国药科大学动物伦理委员会的相关规定。

II型胶原乳剂配制  称取II型胶原适量, 溶解于0.05 mol·L^-1乙酸中, 终浓度为2 mg·mL^-1。将弗氏完全佐剂与2 mg·mL^-1 II型胶原溶液按体积比1∶1充分混合, 乳化均匀, 4 ℃短暂保存备用。

小鼠胶原关节炎模型的建立及后续处理  将DBA/1小鼠随机分组, 选取1组为正常组, 其余各组小鼠于尾根部皮内注射II型胶原乳剂100 μL进行初次免疫, 记为第0天, 第21天尾根部皮内注射II型胶原乳剂100 μL进行二次免疫, 初次免疫后第28天小鼠出现明显的继发反应, 根据AI评分将小鼠再次随机分组, 分别为模型组、桑色素(20、40和80 mg·kg^-1) 组和来氟米特(2 mg·kg^-1) 组。分组后即开始灌胃给药, 每天1次, 连续14天。同时, 每天记录各组小鼠全身病变程度, 进行AI评分, 评分标准如下^{[13, 14]}: 0分: 无红肿; 1分: 1个足趾关节红肿; 2分: 2个关节受累; 3分: 2个以上关节受累; 4分: 广泛红肿, 出现强直。每只小鼠最高评分为16分。初次免疫后第41天, 小鼠眼底静脉丛取血, 离心, 收集血清备用; 对小鼠足趾拍摄照片, 随后处死, 取后肢进行micro-CT扫描成像; 取踝关节, 石蜡包埋固定, 切片, 进行H & E染色和病理评分, 具体观察内容和评分标准如下^[15]: 病变: ①滑膜细胞有无受侵蚀(变性、坏死)、增生; ②有无炎性细胞浸润; ③有无血管翳形成(由血管和成纤维细胞组成); ④有无骨质侵蚀(关节骨和软骨受到破坏)。评分: 根据各部位病变轻重程度, 依次定量为0~4分。1分(轻度), 2分(中度), 3分(重度), 4分(极重度), 0分(基本正常), 累加所有分数, 分值越高提示病变程度越高。

血清相关因子检测  取小鼠血清, 按试剂盒说明书所述方法对TNF-‍α、IL-6、IL-1β、PGE₂、MMP-13、NO、IL-17A和IL-10水平进行测定。

Th17和Treg细胞比例测定  取小鼠肠系膜淋巴结和脾脏, 研碎, 分离得到淋巴细胞。

Th17细胞比例测定在用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬的淋巴细胞悬液中, 加入佛波酯/离子霉素混合物和布雷非德菌素A/莫能霉素混合物, 于37 ℃、5% CO₂条件下孵育5 h。随后, 加入FITC标记的抗小鼠CD4抗体, 4 ℃避光孵育30 min。按固定 & 破膜试剂盒说明书所述方法加入Medium A进行固定。预冷PBS缓冲液洗涤后加入Medium B和PE标记的抗小鼠IL-17A抗体, 4 ℃避光孵育1 h, 再次洗涤后重悬于预冷PBS缓冲液中, 采用流式细胞术测定Th17 (CD4⁺IL-17A⁺) 细胞比例。

Treg细胞比例测定在用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬的淋巴细胞悬液中, 加入FITC标记的抗小鼠CD4抗体和APC标记的抗小鼠CD25抗体, 4 ℃避光孵育30 min。预冷的PBS缓冲液洗涤后加入Foxp3/转录因子染色试剂盒中的固定/破膜试剂, 4 ℃避光孵育5 h。随后, 加入破膜缓冲液(1×) 洗涤细胞, 并重悬于破膜缓冲液(1×) 中。加入PE标记的抗小鼠Foxp3抗体, 4 ℃避光孵育1 h。预冷PBS缓冲液洗涤细胞并重悬后采用流式细胞术测定Treg (CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺) 细胞比例。

mRNA水平测定  取小鼠肠系膜淋巴结和脾脏, 分别提取总RNA并将其逆转录为cDNA。随后, 采用Q-PCR法测定RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22、Foxp3、IL-10和TGF-β mRNA水平。相关引物序列如表 1所示。

表1(Table 1)

Table 1 Primers used in Q-PCR. RORγt: Retinoic acid-related orphan receptor γt; IL: Interleukin; Foxp3: Forkhead box P3; TGF-β: Transforming growth factor-β Gene Sequence (5’-3’) β-Actin Forward ATCACTATTGGCAACGAGCGGTTC Reverse CAGCACTGTGTTGGCATAGAGGTC RORγt Forward TACCCTACTGAGGACAGG Reverse CCACATTACACTGCTGGCTG IL-17A Forward TACCTCAACCGTTCCACGTC Reverse TTTCCCAACCGCATTGACACA IL-21 Forward TGGATCCTGAACTTCTATCAGC Reverse CACGAGGTCAATGATGAATGTC IL-22 Forward GCAGATAACAACACAGATGTCC Reverse GTCTTCCAGGGTGAAGTTGAG Foxp3 Forward TTTCACCTATGCCACCCTTATC Reverse CATGCGAGTAAACCAATGGTAG IL-10 Forward TTCTTTCAAACAAAGGACCAGC Reverse GCAACCCAAGTAACCCTTAAAG TGF-β Forward AGCTGCGCTTGCAGAGATTA Reverse CAGCCACTCAGGCGTATCAG

Table 1 Primers used in Q-PCR. RORγt: Retinoic acid-related orphan receptor γt; IL: Interleukin; Foxp3: Forkhead box P3; TGF-β: Transforming growth factor-β

统计学方法  采用SPSS软件进行数据分析, 所有结果均以均值±标准差(x̅ ± s) 表示。两组间比较采用t检验方法; 多组间比较采用one-way ANOVA方法。若方差非齐性, 则进一步采用非参数检验。P < 0.05表示有显著性差异。

如图 1所示, 于初次免疫后第28天至第41天, CIA小鼠全身关节呈现不同程度的红肿, AI评分逐渐升高后趋于平缓。桑色素(40和80 mg·kg^-1) 显著改善CIA小鼠疾病症状, 降低AI评分, 且剂量为80 mg·kg^-1时作用与阳性药来氟米特(2 mg·kg^-1) 相当。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Effect of morin on the arthritis index (AI) score in collagen-induced arthritis (CIA) mice. n = 6, x̅ ± s. ##P < 0.01 vs normal group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs CIA group (model group)

如图 2所示, 初次免疫后第41天, CIA小鼠与正常小鼠相比足趾明显肿胀。桑色素(40和80 mg·kg^-1) 和来氟米特(2 mg·kg^-1) 灌胃给药呈现良好的抑制作用。此外, micro-CT三维重建结果显示, 正常小鼠踝关节表面光滑、外形完整, CIA小鼠踝关节表面凹凸不平、外形不完整, 表明与正常小鼠相比, CIA小鼠踝关节骨质侵蚀严重, 关节完整性受到破坏。桑色素(40和80 mg·kg^-1) 和来氟米特(2 mg·kg^-1) 组小鼠踝关节表面粗糙程度减轻, 关节外形较完整, 骨损伤得到明显改善。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Representative photo and micro-CT imaging of the paws and ankle joints

如图 3所示, 正常组小鼠关节表面被覆薄层透明软骨, 无血管翳形成, 细胞排列整齐、表面光滑。关节骨、软骨无破坏, 滑膜组织无变性、坏死, 未见充血、水肿和炎细胞浸润; 模型组滑膜细胞变性、坏死, 滑膜组织内有不同程度的炎性细胞浸润和肉芽组织增生。关节骨和软骨受到明显破坏, 关节腔狭窄。桑色素(40和80 mg·kg^-1) 和来氟米特(2 mg·kg^-1) 明显减少炎性细胞浸润和滑膜增生, 减轻软骨和骨的损伤。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Effect of morin on the histological changes of ankle joints in CIA mice. Scale bars: 100 μm. n = 6, x̅ ± s. ##P < 0.01 vs normal group; **P < 0.01 vs CIA group

如图 4所示, 与正常小鼠相比, CIA小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE₂、MMP-13、NO、IgG和IgG2a水平明显升高, IgG1水平无明显变化。桑色素(80 mg·kg^-1) 和来氟米特(2 mg·kg^-1) 对血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE₂、MMP-13、NO、IgG和IgG2a水平均具有显著的下调作用, 对IgG1水平则无明显影响。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Effect of morin on the levels of proinflammatory factors, proinflammatory mediators and IgG class antibodies in CIA mice. n = 6, x̅ ± s. ##P < 0.01 vs normal group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs CIA group

如图 5所示, CIA小鼠肠系膜淋巴结和脾脏中Th17细胞比例明显升高, 桑色素(80 mg·kg^-1) 对此呈现抑制作用, 且作用强度与来氟米特相当。此外, 桑色素(80 mg·kg^-1) 能够明显升高肠系膜淋巴结和脾脏中Treg细胞比例。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Effect of morin on the frequencies of Th17 and Treg cells in CIA mice. A: The frequencies of Th17 cells in mesenteric lymph nodes (MLNs) and spleen; B: The frequencies of Treg cells in MLNs and spleen. n = 6, x̅ ± s. ##P < 0.01 vs normal group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs CIA group

如图 6所示, CIA小鼠淋巴结/脾脏中Th17特异性转录因子RORγt及功能性因子IL-17A、IL-21和IL-22的mRNA水平较正常小鼠明显升高, 而Treg特异性转录因子Foxp3及功能性因子IL-10和TGF-β的mRNA水平与正常小鼠相当。桑色素(80 mg·kg^-1) 灌胃给药可明显下调CIA小鼠淋巴结/脾脏中RORγt、IL-17A、IL-21和IL-22 mRNA水平, 上调Foxp3、IL-10和TGF-β mRNA水平。此外, 桑色素(80 mg·kg^-1) 可显著下调CIA小鼠血清中IL-17A水平, 上调IL-10水平。

Figure 6

Figure 6

Figure 6 Effect of morin on the levels of Th17- and Treg-related factors in CIA mice. A: The mRNA expression levels of RORγt and Foxp3 in MLNs and spleen; B: The mRNA expression levels of IL-17A, IL-21, IL-22, IL-10 and TGF-β in MLNs and spleen; C: The levels of IL-17A and IL-10 in serum. n = 6, x̅ ± s. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs normal group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs CIA group

RA为一种慢性自身免疫性疾病, 主要表现为对称性多关节炎性病变, 伴有晨僵、乏力和体重减轻等。除此之外, RA患者常出现累及全身多个器官的系统性综合征, 如血管炎和间质性肺病等^{[16, 17]}。临床上用于RA的治疗药物主要包括非甾体抗炎药、类固醇激素、缓解病情的抗风湿药和生物制剂等。然而, 上述药物仍存在诸多不足, 如易引起胃肠道反应、视网膜病变和肝肾功能损害等不良反应, 较高剂量或频繁的给药模式亦导致高治疗成本, 无法切实满足患者的治疗需求^{[18, 19]}。因此, 开发新型安全有效且价格低廉的RA治疗药物迫在眉睫。

由于建立合理的动物模型为筛选潜在疾病治疗药物的关键, 研究人员对RA的动物模型进行了大量的探究。目前比较成熟和稳定的模型包括: 佐剂诱导的关节炎模型、II型胶原诱导的关节炎模型、链球菌细胞壁诱导的关节炎模型、软骨寡聚基质蛋白诱导的关节炎模型、降植烷诱导的关节炎模型及转基因动物关节炎模型等^[20]。上述模型各有优缺点, 但II型胶原诱导的小鼠关节炎模型为使用最广泛的模型, 尤其适用于免疫相关性研究^[21]。在前期研究, 本课题组通过建立弗氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎模型, 初步揭示了桑色素对RA的改善作用^[10]。本研究则通过建立II型胶原诱导的小鼠关节炎模型, 进一步明确桑色素在RA治疗中的潜力。结果显示, 桑色素(20、40、80 mg·kg^-1) 灌胃给药, 可剂量依赖性改善II型胶原所致小鼠关节炎疾病症状, 且80 mg·kg^-1桑色素的作用与阳性药来氟米特(2 mg·kg^-1) 相当。

在RA发生发展过程中, 普遍认为CD4⁺ T细胞介导的免疫应答异常发挥着关键性作用。其中, Th17细胞受转录因子RORγt调控, 通过分泌IL-17A、IL-21和IL-22等, 刺激滑膜成纤维细胞和巨噬细胞产生IL-6和TNF-α等炎症因子, 诱发滑膜炎症, 且能够促进破骨细胞形成、增强MMPs表达, 引起软骨和骨破坏。相反, Treg细胞具有免疫抑制活性, 可通过直接接触或分泌IL-10和TGF-β等抑制性因子, 拮抗包括Th17细胞在内的炎性细胞的功能, 发挥抗炎和维持免疫耐受的作用^[6-8]。基于恢复Th17/Treg平衡在RA治疗中的重要意义, 本研究从免疫调节角度进一步探究了桑色素改善小鼠CIA的机制。研究发现, 桑色素(80 mg·kg^-1) 可显著下调Th17细胞比例、抑制其相关因子的表达及分泌, 显著上调Treg细胞比例, 对Treg相关因子表达及分泌亦具有明显的促进作用, 表明桑色素可恢复CIA小鼠中Th17和Treg细胞的平衡。

综上所述, 在一定剂量范围内, 桑色素对小鼠CIA具有良好的治疗效果, 且机制与改善Th17/Treg失衡相关。

作者贡献: 缪雨濛负责完成实验和论文撰写工作; 仲雨乐参与部分实验的实施工作; 魏志凤负责实验指导和论文修改工作。

利益冲突: 本研究与任何组织和个人均无利益冲突。