2021, Vol. 56
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 102629;
3. 中国药科大学药学院, 江苏 南京 211198
2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629, China;
3. School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China
布地奈德(budesonide) 是一种高效局部抗炎糖皮质激素(ICS), 吸入给药为其首选给药途径, 可产生强的局部抗炎作用, 有效控制气道炎症, 减少哮喘发作频率和严重程度, 降低病死率。布地奈德作为长期控制哮喘的优选一线药物, 是被世界卫生组织(WHO) 儿童基本药物目录(适用于12岁以下儿童) 收录的唯一的抗哮喘吸入ICS, 也是唯一被美国食品药品管理局(FDA) 定为妊娠安全分级B类的ICS (包括鼻用和吸入制剂), 以及目前被批准的唯一可用于≤ 4岁儿童的雾化ICS[1]。
布地奈德常用剂型有鼻喷雾剂、吸入气雾剂、吸入粉雾剂及雾化吸入混悬液。吸入用布地奈德混悬液最早由AstraZeneca公司研制生产, 1991年在英国首次上市, 2001年进入中国市场, 临床使用量位居国内吸入制剂首位。据国家药品食品监督管理总局药品审评中心数据库显示, 已有两家国内企业的仿制药获批上市, 另有多家企业的产品正在审评或研发中。
吸入液体制剂是吸入制剂的一种, 特别适用于儿童和老人等不配合或不方便使用其他吸入制剂的患者。吸入用布地奈德混悬液需与雾化装置配合使用, 将含药物的混悬液通过连续雾化器产生气溶胶, 药物通过吸入沉积于呼吸道和肺部, 其中粒径小于5 μm的气溶胶颗粒可到达肺部, 起效迅速, 全身不良反应少。递送速率(delivery rate) 及递送总量(total drug substance delivered, TDD) 是评价吸入药物递送效率的重要指标, 其中TDD越高说明相同标示剂量下雾化器释放药量越高。因此, 各国药典均将雾化特性体外实验中小于5 μm粒径药量、递送速率与递送总量作为雾化吸入液体制剂临床有效性的评价指标[2-4]。
吸入混悬液处方工艺复杂, 临床中使用不同的雾化装置进一步增加了其雾化特性评价的复杂性。目前关于布地奈德吸入制剂雾化特性的报道较少[5-7]。本文建立了吸入用布地奈德混悬液的空气动力学粒径分布(aerodynamic particle size distribution, APSD)、递送速率与递送总量等雾化特性指标的分析方法, 考察不同企业样品与不同型号雾化装置联用后测试结果的差异, 为雾化吸入混悬液的质量研究和评价、仿制药物的研发提供参考, 为吸入用布地奈德混悬液在临床使用时选择适宜的雾化装置提供思路。
材料与方法仪器 新一代撞击器(next generation impactor, NGI), 配有DFM2000流量计、HCP5真空泵、冷却装置、CITDA计算软件、BRS2100呼吸模拟装置(英国Copley公司); 雾化装置由两家公司提供, 分为A型号和B型号, 均为喷射型雾化器, 含压缩机和雾化器; Ultimate 3000高效液相色谱仪, 配有单元泵、在线脱气机、自动进样器、UV检测器和Chromeleon 7工作站(美国Thermo公司); XS205DU电子天平和SevenEasy酸度计(瑞士Mettler公司)。
样品与试剂 布地奈德对照品(中国食品药品检定研究院, 批号: 100989-201502, 纯度: 98.9%); 乙腈为色谱纯(美国Fisher公司); 磷酸二氢钠、磷酸(分析纯, 国药集团化学试剂公司); 纯化水(实验室自制); 8839型NGI滤膜(直径76 mm)、呼吸模拟器用滤膜(直径67 mm) (英国Copley公司); 过滤用滤膜(Nylon66, 孔径0.45 μm, 直径25 mm, 津腾公司)。Ⅰ、Ⅱ两家企业生产的吸入用布地奈德混悬液各3批样品(编号: 1、2、3和4、5、6; 规格均为2 mL: 1 mg)。
高效液相色谱法 色谱柱: Phenomenex Gemini C18 (150 mm × 4.6 mm ID, 5 μm); 流动相: 乙腈-磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钠15.84 g、磷酸1.14 g, 加水5 000 mL振摇使溶解, 调节pH值至3.2 ± 0.1) (35∶65, v/v); 流速: 1.5 mL·min-1; 检测波长: 254 nm; 柱温: 30 ℃; 进样量: 100 μL[8]。
系统适用性 布地奈德差向异构体B与布地奈德差向异构体A依次出峰, 两峰之间分离度大于1.5。
线性方程 取布地奈德对照品约12.5 mg, 精密称定, 置于50 mL量瓶中, 加乙腈-磷酸盐缓冲液(1∶1, v/v) 溶解并定量稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品贮备液。取对照品贮备液适量, 稀释制成每毫升约含0.05、0.1、0.25、1.0、2.5、5和12.5 μg的系列对照品溶液, 以系列对照品溶液浓度(C) 为横坐标, 布地奈德两异构体峰面积之和(A) 为纵坐标, 计算线性回归方程: A = 2.085 0 C - 0.020 (r = 1), 布地奈德在0.051 2~12.798 μg·mL-1内线性关系良好。线性兼顾不同浓度的供试品溶液, 特别是微细粒子剂量项下NGI各层级含量差距较大的情况。
检出限和定量限 取线性溶液最低浓度样品依次稀释进样, 以信噪比(S/N) = 10确定定量限浓度为0.05 μg·mL-1; 以S/N = 3确定检测限浓度为0.02 μg·mL-1。
精密度 取对照品溶液(1.0 μg·mL-1) 连续进样6次, 布地奈德两主峰保留时间与峰面积之和的相对标准偏差(RSD) 分别为0.06%与0.9%, 说明仪器精密度良好。
稳定性 取对照品溶液(1.0 μg·mL-1) 分别在2、4、8、16、24和48 h进样, 布地奈德两异构体峰面积之和的RSD小于2%, 说明对照品在48 h内稳定。
递送速率与递送总量 参照吸入制剂(《中国药典》2020年版四部通则0111)“4.吸入液体制剂”项下测定[2]。将呼吸模拟器用滤纸置于滤纸装置中, 并与呼吸模拟器连接, 设置呼吸模式(表 1)。精密量取吸入用布地奈德混悬液2 mL, 置于雾化装置的雾化器中, 依次连接压缩机、雾化器、口含器和适配器, 再与滤纸装置连接。开启呼吸模拟器及压缩机并计时, 60 s后关闭压缩机与呼吸模拟器, 取出滤纸置烧杯中, 精密加入乙腈-磷酸盐缓冲液(50∶50, v/v) 20 mL, 加盖搅拌3 min, 滤过, 取续滤液作为供试品溶液(1); 更换滤纸并继续雾化10 min, 关闭压缩机与呼吸模拟器, 取出滤纸和滤纸装置置于烧杯中, 精密加入乙腈-磷酸盐缓冲液(50∶50, v/v) 40 mL, 加盖搅拌3 min, 滤过, 取续滤液作为供试品溶液(2)。更换新的雾化器, 分别精密量取内容物2 mL置雾化器中, 依次按照上述方法操作, 共测试5次。取企业Ⅰ和企业Ⅱ的吸入用布地奈德混悬液分别采用雾化装置A和雾化装置B同法操作, 并取2个型号各2个批号压缩机进行雾化。
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Table 1 Breathing simulator modes |
精密称取布地奈德对照品适量, 用乙腈-磷酸盐缓冲液(50∶50, v/v) 溶解, 并稀释制成每毫升中分别含0.05~5 μg的系列溶液。
以系列对照品溶液浓度为横坐标, 布地奈德两异构体峰面积之和为纵坐标, 计算线性回归方程, 由回归方程计算供试品溶液(1) 和(2) 的含量。供试品溶液(1) 的含量为1 min递送剂量, 作为递送速率; 供试品溶液(1) 与(2) 含量之和为样品的全部递送剂量, 作为递送总量。
空气动力学粒径分布 参照《中国药典》2020年版四部通则0951吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法[9]。将NGI与人工喉组装并置于5 ℃冷却装置中预冷90 min, 并在微孔收集器(micro-orifice collector, MOC) 放置滤膜, 将NGI撞击器与真空泵连接。将人工喉与流量计连接, 开启真空泵, 调节流速为15 L·min-1, 取下流量计。依次连接压缩机、雾化器、口含器和适配器, 再将适配器与人工喉连接。精密量取吸入用布地奈德混悬液2 mL, 置雾化器中, 开启压缩机并计时, 60 s后关闭压缩机, 取下雾化器, 关闭真空泵。在1~7级收集盘中分别精密加入乙腈-磷酸盐缓冲液(50∶50, v/v) 10 mL, 加盖振荡5 min, 作为供试品溶液(3)~(9); 另取出MOC级滤膜置于烧杯中, 精密加入乙腈-磷酸盐缓冲液(50∶50, v/v) 10 mL, 加盖搅拌3 min, 滤过, 取续滤液作为供试品溶液(10)。同上测定, 共测试5次, 采用2种样品、2种雾化装置和2台压缩机。
计算供试品各层级收集的药量, 并采用CITAS软件计算APSD评价参数: 微细粒子剂量(fine particle dose, FPD)、微细粒子分数(fine particle fraction, FPF)、质量中值空气动力学粒径(mass median aerodynamic diameter, MMAD) 和几何标准偏差(geometric standard deviation, GSD)。
统计学分析 统计分析采用SPSS16.0软件的独立样本t检验, 对递送速率与递送总量、空气动力学粒径分布的评价参数(FPD、FPF、MMAD、GSD) 的实验结果进行显著性检验, P < 0.05表示具有显著性差异。
结果 1 递送速率和递送总量计算递送速率和递送总量5次结果的平均值, 见图 1。
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Figure 1 The delivery rate and total drug substance delivered by different nebulizers. A1, A2: Nebulizer A; B1, B2: Nebulizer B. n = 5 (A2: n = 10), x ± s |
使用雾化装置A (1台压缩机与随机5个雾化器), 每个雾化器测试1次, 递送速率与递送总量5次结果的RSD均小于15%; 每个雾化器再测试1次, 10次结果的RSD仍小于15%。更换相同型号的压缩机重复以上操作, 多次结果的RSD均小于15%, 两台压缩机之间无显著差异(P > 0.05)。结果表明, 随机取1台压缩机配合5个雾化器各测试1次, 取测得结果的平均值具有代表性, 可反映该雾化装置的递送剂量。
两企业同批次样品使用两个雾化装置各测试5次, 递送速率与递送总量均存在显著差异(P < 0.01)。结果表明不同雾化装置的递送剂量差异较大。
使用雾化装置A测定两企业各3批样品结果见图 2。两种呼吸模式下, 企业Ⅰ的递送速率和递送总量均略高于企业Ⅱ; 两企业样品均存在一定的批间差异。
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Figure 2 The delivery rate and total drug substance delivered by nebulizers A. n = 5 (A2: n =10), x ± s |
两企业样品使用两种型号雾化装置在NGI各层级收集的药量典型分布见图 3。两企业样品使用雾化装置A时测得NGI第3层的药量最高; 使用雾化装置B时测得第4层的药量最高。
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Figure 3 Next generation impactor (NGI) stages of manufacturer Ⅰ and Ⅱ by nebulizer A and B. MOC: Micro-orifice collector |
常用的APSD评价参数有FPD、FPF、MMAD和GSD。FPD为空气动力学粒径小于5 μm的气溶胶含药量, 描述了可能进入肺部的药物粒子剂量; FPF指药物在肺部沉积百分比。FPD与FPF越高, 药物的输送效率越高, 肺部沉积量越高[10]; MMAD是质量中值气溶胶的颗粒直径, 衡量颗粒大小的趋势, MMAD在1~5 μm内越小则颗粒越容易输送到气道的远端分支, 肺部沉积越好; GSD是气溶胶颗粒大小的离散程度, GSD越接近1则气溶胶颗粒大小越均一。相关参数见图 4。
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Figure 4 The aerodynamic particle size distribution (APSD) items of different nebulizers. FPD: Fine particle dose; FPF: Fine particle fraction; MMAD: Mass median aerodynamic diameter; GSD: Geometric standard deviation. n = 5, x ± s |
两企业同批次样品使用两雾化装置各测试5次, FPD、FPF、MMAD和GSD均存在显著差异(P < 0.01), 雾化装置A的FPD较大。结果表明, 不同型号递送至肺部的剂量差异较大; 两种型号雾化装置的压缩机间均存在一定的批间差异。
使用雾化装置A对两企业各3批样品进行测试, 企业Ⅰ的FPD较大, MMAD略高于企业Ⅱ; 两企业样品均存在一定的批间差异(图 5)。
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Figure 5 The APSD items of manufacturer Ⅰ and Ⅱ by nebulizer A. n = 5, x ± s |
考察吸入液体制剂的雾化特性要特别关注药液的理化性质, 对于吸入混悬液, 更要关注其混悬物粒径及黏度等[11, 12]。因此, 本文使用酸度计、渗透压摩尔浓度测定仪、库尔特计数器及流变仪等分别测定了吸入用布地奈德混悬液的pH值、渗透压摩尔浓度比、混悬物平均粒径、黏度及相对密度(表 2)。
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Table 2 The physicochemical properties of budesonide suspension for inhalation from different manufacturers |
企业Ⅰ与企业Ⅱ的混悬物平均粒径存在一定差异, pH值、渗透压摩尔浓度比、黏度及相对密度均基本一致。流变曲线拟合的HerscheL-BuLkLey方程为τ = 1.748×10-2 + 5.488×10-3γ1.256 (样品Ⅰ) 与τ = 2.743×10-2 + 2.927×10-4γ1.377 (样品Ⅱ)。结果表明, 两企业样品虽为混悬液, 但均近似为牛顿流体且黏度较低, 流变学特性接近溶液。因此, 除雾化装置外混悬颗粒的粒径也是影响雾化吸入混悬液雾化特性的原因之一[10, 13]。
讨论吸入液体制剂临床使用时需与雾化装置联用, 雾化特性考察的是药品与雾化装置联用后产生的气溶胶特性, 因此影响其雾化特性的主要因素是雾化装置。雾化装置的工作原理主要分为喷射型、超声型和振动筛型。市场上目前主流产品多为喷射型压缩机与雾化器的组合, 且吸入用布地奈德混悬液说明书中要求本品不宜使用超声型雾化器, 因超声雾化机的原理是通过压电晶片产生的高频超声, 从而在储药池的顶层液面形成雾粒。但混悬液的药物微粒并不能完全到达液面顶层; 且超声雾化产生的气雾中水分比例高, 药物颗粒少, 高频超声还能转化为热能, 可能影响ICS的活性[1, 14]。故本文选择使用不同型号的喷射型雾化装置与吸入用布地奈德混悬液联用, 考察递送剂量和肺部沉积剂量。
本文研究结果表明, 相同样品使用雾化装置A测得的FPD、DD、TDD明显高于雾化装置B, 说明雾化装置A递送的药物剂量及肺部沉积剂量较高。比较两型号压缩机说明书, 压缩机A的气流量大于压缩机B。因压缩机用于提供稳定而充足的气流, 通过文丘里效应产生气溶胶, 故雾化装置A递送的药物剂量更高。
与压缩机相比, 雾化器结构对雾化特性的影响更为显著[15], 特别是压缩空气孔径、隔片直径高度和喷嘴角度等关键尺寸参数决定了雾化气溶胶的粒径分布(图 6)。
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Figure 6 Nebulizer structure |
雾化装置A的雾化器为闭口式, 雾化装置B的雾化器为开口式, 雾化过程中雾化器A损失的气溶胶小于雾化器B, 也是雾化装置A递送剂量更高的原因之一。虽然相同样品使用雾化装置B在NGI第4层级沉积最多(截至粒径为3.3 μm), 表现为MMAD略低于雾化装置A, 空气动力学粒径可能更小, 有利于沉积, 但其TDD与FPD均远低于雾化装置A, 故综合考虑本品与雾化装置A联用肺部沉积剂量更高。由于本品是混悬液, 雾化器在使用后可用温水洗涤, 防止混悬颗粒黏附和堵塞通气孔。
相同型号雾化器批间差异较大, 故本文采用随机取雾化器5个分别测试, 先进行APSD预实验, 雾化1 min后NGI各层级上液滴无黏连的雾化器方可用于APSD实验和递送实验。若各层级液滴黏连可造成NGI过载, 使测试结果的变异性增加。本文中5支雾化器的各项测试结果RSD均小于15%。故取5支雾化器各测试1次, 5个结果的平均值具有代表性。
在研究过程还发现, 企业Ⅱ样品挤出药液中主药含量低于企业Ⅰ样品且批次间差异较大, 但两样品挤出药液的体积无显著差异。故挤出药液中主药含量的差异也是引起雾化特性差异的因素之一, 可能与安瓿瓶形状或材料导致的混悬物残留有关, 有待于进一步研究。
《中国药典》2020年版四部通则0951项下未明确说明FPD的定义及计算方法, 要求见品种正文项下。USP与EP中说明以log-probit插值法(interpolation) 计算FPD、MMAD和GSD, 具体公式不甚详细; 目前国内外研究均大多以CITDA软件计算FPD、FPF、MMAD和GSD, 软件普及性存在困难, FPD和MMAD的计算公式鲜有文献报道。作者已初步建立吸入用混悬液FPD和MMAD的计算公式见式(1) 和(2) (公式中数值见表 3), 并对多批次样品的测定结果进行了验证, FPD和MMAD计算结果与CITDA软件计算结果差异均小于2%, 将在以后的研究中收集更多样本进行充分验证。
| $ \mathrm{FPD}({\rm{\mu}} \mathrm{g})=\frac{(5-D a)}{(D b-D a)} \times(c b-c a)+c a $ | (1) |
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Table 3 Cumulative percentage of mass less than the stated aerodynamic diameter[3] |
其中, Da为恰小于5 μm的截止粒径(μm); Db为恰大于5 μm的截止粒径(μm); ca为Da对应的累积沉积药量(μg); cb为Db对应的累积沉积药量(μg)。
| $ \operatorname{MMAD}(\mu \mathrm{m})=10^{n} $ | (2) |
其中,
《经口吸入制剂仿制药生物等效性研究指导原则》[16]规定在与参比制剂药学质量一致的前提下, 吸入混悬液一般还应进行人体生物等效性研究, 而吸入溶液剂则不需要, 说明吸入混悬液更为复杂。目前雾化吸入疗法在我国儿科临床应用迅速增加, 很多医疗机构建立了专门的雾化治疗中心或雾化室, 越来越多需要长期ICS治疗的儿科患者考虑在家庭进行雾化治疗。本文提供的雾化特性分析方法可用于不同吸入液体制剂在临床上选择递送剂量与微细粒子剂量适宜的雾化装置; 也可作为吸入液体制剂仿制药的研发与质量一致性评价研究时选择雾化装置和操作方法的指导。
作者贡献: 宁保明、李苗和魏宁漪构思并设计了实验。李苗、郑静和晏菊姣进行论文的整体实验和数据分析; 陈路和卢劲涛参与雾化特性实验; 晏菊姣和郑静参与数据分析工作。李苗、魏宁漪、郑静、晏菊姣和宁保明撰写论文。
利益冲突: 所有作者声明不存在利益冲突。
| [1] |
Shen KL, Deng L, Li YZ. Expert consensus on the application of corticosteroids aerosol inhalation therapy in pediatrics[J]. Clin Pediatr (临床儿科杂志), 2018, 2: 95-105. |
| [2] |
Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China (中华人民共和国药典)[S]. 2020 Ed. Vol 4. Beijing: China Medical Science Press, 2020: 12-16.
|
| [3] |
European Pharmacopeia 10.0[S]. Strasbourg: European Directoratefor the Quality of Medicines, 2019: 927-928.
|
| [4] |
The United States Pharmacopeia Online. 2020 Ed. The United States Pharmacopeial Convention Inc. <5>Inhalation and nasal drug products-general information and product quality tests.
|
| [5] |
Liang ZL, Wang XH, Ni R. Preparation of budesonide sustained-release dry powder for inhalation and influence of lactose content[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2015, 50: 1180-1185. |
| [6] |
Zhu J, Chen BL, Lu JT. Effect of different jet nebulizer on in vitro deposition properties of inhalation suspension[J]. J Int Pharm Res (国际药学研究杂志), 2016, 43: 1140-1144. |
| [7] |
Ding YN, Kang B, Wang J. Preparation and in vitro evaluation of budesonide nanosuspensions for aerosol inhalation[J]. Chin J Pharm (中国医药工业杂志), 2017, 48: 1131-1137. |
| [8] |
Liu Q, Liang CR, Xie YC, et al. Determination of the content and related substances of budesonide aerosol by HPLC[J]. Chin J Pharm Anal (药物分析杂志), 2014, 34: 471-474. |
| [9] |
Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China[S]. 2020 Ed. Vol 4. Beijing: China Medical Science Press, 2020: 142-143.
|
| [10] |
Zhou XJ, Hong JG. Nebulizers and nebulization parameters[J]. Chin J Respir Critical Care Med (中国呼吸与危重监护杂志), 2019, 18: 98-102. |
| [11] |
Huang HF, Li M, Xiao MQ. Comparison of aerodynamics particle size distribution of terbutaline sulphate solution for nebulisation[J]. Chin J Pharm Anal (药物分析杂志), 2020, 40: 1039-1044. |
| [12] |
Wang Z, Wei NY, Zhou Y. Comparison of nebulization characteristics of different formulations for ambroxol hydrochloride inhalation solution[J]. Chin J New Drugs (中国新药杂志), 2020, 29: 1535-1539. |
| [13] |
Meng HQ, Chen L, Chen DH. Effect of carrier size and surface morphology on the aerosolizationof formulation in a capsule-based dry powder inhaler[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2019, 54: 1673-1679. |
| [14] |
Martin AR, Finlay WH. Nebulizers for drug delivery to the lungs[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2015, 12: 889-900. DOI:10.1517/17425247.2015.995087 |
| [15] |
Zhou Y, Wei NY, Lin L. Compare the delivery rate and delivered amount of ambroxol hydrochloride nebules inhalation solution of two types of nebulizer by breathing simulator[J]. Chin J New Drugs (中国新药杂志), 2018, 27: 290-294. |
| [16] |
Center for Drug Evaluation, National Medical Products Administration. Guideline on the bioequivalence of generic drugs of orally inhaled products center for drug evaluation[EB/OL]. 2020[2021-09-22]. http://www.cde.org.cn/main/news/viewInfoCommon/e1fac37cca917e1d9355bb630e440c1a.
|