肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI) 常见于肝脏外科手术过程中, 如肝部分切除术和肝移植等。HIRI可导致早期异体移植物功能障碍或原发性无功能, 并导致慢性移植物排斥反应或病毒性肝炎复发^[1], 其病理生理过程复杂, 主要包括短暂的血流阻断和恢复血流供应, 并伴随着氧自由基的产生、细胞因子/趋化因子的释放、黏附分子的表达上调等, 最终导致细胞和组织器官的功能障碍^[2]。目前, 还没有特定的针对减轻HIRI的治疗方法, 进一步研究其发病机制及寻找有效的治疗药物刻不容缓^[3]。趋化因子是一类能够吸引免疫细胞迁移的细胞因子, 参与多种炎症反应以及病理进程。在本课题组前期的研究中发现, 趋化素样因子1 (chemokine-like factor 1, CKLF1) 在HIRI中显著升高, 抑制CKLF1可通过抑制炎症反应及中性粒细胞的聚集降低肝脏损伤^[4]。以上结果提示, 抑制CKLF1为缓解HIRI提供了一个新的思路。

化合物7-羟基-5-甲氧基-4-甲基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-香豆素(IMM-H004) 是一种新型的香豆素类衍生物, 是以CKLF1为靶点, 采用钙瞬变模型筛选并经过结构优化得到的CKLF1的竞争性拮抗剂, 结构见图 1。本实验室前期的研究发现, IMM-H004对永久性局灶性缺血性脑损伤^[5]和短暂性全脑缺血/再灌注损伤^[6]均具有很好的保护作用。IMM-H004还可以改善全脑缺血造成的海马CA1区细胞的丢失以及空间学习记忆障碍^[7], 降低脑缺血再灌注损伤中的炎症反应^[8]。但是其在肝脏缺血再灌注损伤中的作用尚不明确, 因此本实验的目的就是探究IMM-H004对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

Figure 1

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Figure 1 The chemical structure of IMM-H004

实验动物   SPF级雄性C57BL/6J小鼠(6~8周, 体重18~20 g) 购自北京华阜康生物技术股份有限公司, 许可证号: SCXK (京) 2020-0004, 饲养于中国医学科学院药物研究所动物房。所有动物实验都获得中国医学科学院药物研究所实验动物管理与动物福利伦理委员会批准。室温22 ± 2 ℃, 相对湿度55% ± 5%, 12 h/12 h明暗交替。

主要药品及试剂  IMM-H004由中国医学科学院药物研究所合成室提供。反转录试剂盒、qPCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。qPCR引物合成自北京擎科新业生物技术有限公司, 引物序列见表 1。RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL超敏发光液购自北京普利莱基因技术有限公司。髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 抗体、NOD样受体蛋白3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3) 抗体购自Abcam公司。衔接蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC) 抗体、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1) 抗体购自Santa Cruz公司。白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β) 抗体购自ABclonal公司。丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase, ALT) 测定试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST) 测定试剂盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH) 测定试剂盒购自中生北控生物科技有限公司。

表1(Table 1)

Table 1 Primers for qPCR analysis. IL-1β: Interleukin-1β; IL-6: Interleukin-6; TNF-α: Tumor necrosis factor-α Gene Primer (5'-3') IL-1β GTGGCAGCTACCTGTGTCTT GGAGCCTGTAGTGCAGTTGT IL-6 TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC GACAGGTCTGTTGGGAGTGG TNF-α AGGCACTCCCCCAAAAGATG TGAGGGTCTGGGCCATAGAA β-Actin GAGACCTTCAACACCCCAGC CCACAGGATTCCATACCCAA

Table 1 Primers for qPCR analysis. IL-1β: Interleukin-1β; IL-6: Interleukin-6; TNF-α: Tumor necrosis factor-α

小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的建立  将小鼠随机分为3组, 假手术组、模型组和IMM-H004组, 每组10只, IMM-H004组于造模前7天尾静脉注射10 mg·kg^-1 IMM-H004, 连续7天。假手术组和模型组注射等量生理盐水。造模当天, 小鼠腹腔注射4%水合氯醛进行麻醉, 用血管夹夹闭肝左叶和中叶的血管造成肝脏缺血, 30 min后松开血管夹恢复肝脏血流。再灌注后, IMM-H004组立即尾静脉注射一次IMM-H004, 假手术组和模型组注射等量生理盐水。再灌注6 h后, 取血及肝组织标本。

血清生化指标检测  将血液样本室温静置1 h, 4 000 r·min^-1离心10 min, 分离血清, 利用全自动生化分析仪测定小鼠血清中ALT、AST、LDH的含量。

肝脏病理切片  取肝组织固定于多聚甲醛溶液中, 固定24 h后进行常规石蜡切片和H & E染色, 显微镜下观察, 采集图像。

免疫组织化学检测   石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇进行脱腊, 经过常规抗原修复、打孔、灭活、封闭等操作后, 每个样本滴加50 μL稀释后的抗体, 4 ℃孵育过夜, 漂洗3次, 滴加HRP标记的二抗, 室温孵育2 h, 漂洗3次, DAB显色, 滴加苏木素使细胞核染色, 脱水封片, 显微镜下观察, 采集图像。

免疫荧光检测  石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇进行脱腊, 经过常规抗原修复、打孔、封闭等操作后, 每个样本滴加50 μL稀释后的抗体, 4 ℃孵育过夜, 漂洗3次, 滴加荧光标记的二抗和Hoechst 33342, 室温孵育2 h, 漂洗后封片, 于荧光显微镜下观察。

Real-time quantitative PCR分析  取100 mg冻存的肝组织加入1 mL Trizol提取RNA, 反转录合成cDNA, 以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。以β-actin为内参, 计算2^-ΔΔCt值。

Western blot检测蛋白表达   取100 mg肝组织加入1 mL裂解液提取总蛋白, 用BCA法进行蛋白定量。加入上样缓冲液后, 100 ℃处理10 min进行变性。采用SDS-PAGE电泳, 电泳后将蛋白转印至PVDF膜, 室温封闭1 h。加入相应抗体4 ℃孵育过夜, TBST清洗3次, 二抗室温孵育2 h, TBST清洗3次, 加入ECL发光液显影。使用Quality one分析软件对蛋白条带进行灰度分析。

统计学分析  实验数据采用x± s表示, 采用GraphPad Prism 8.0统计分析软件进行统计分析。数据组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA) 结合Tukey检验, 以P < 0.05表示具有显著性差异。

如图 2A~C所示, 模型组小鼠血清中ALT、AST和LDH的含量与假手术组相比显著升高, 提示造模成功。IMM-H004给药可降低小鼠HIRI后血清生化指标, 与模型组相比有显著性差异, 提示IMM-H004对HIRI有显著的保护作用。H & E染色的结果与生化结果一致, 空白组小鼠肝组织结构清晰, 细胞形态完整。模型组可见大量的空泡样病变, 肝细胞坏死以及炎症细胞浸润的现象, 而IMM-H004给药组小鼠肝组织形态较完整, 空泡性坏死程度较轻, 整体损伤较模型组明显减轻, 如图 2D, 提示IMM-H004可减轻HIRI造成的肝脏损伤。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 The protective effect of IMM-H004 on hepatic ischemia reperfusion injury (HIRI). The level of aspartate transaminase (AST, A), alanine transaminase (ALT, B), and lactate dehydrogenase (LDH, C) in serum; D: Representative images of hematoxylin and eosin (H & E) staining results. n = 10, x± s. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1 vs sham group; ##P < 0.01, ####P < 0.000 1 vs model group

利用实时荧光定量PCR检测HIRI过程中炎症因子的表达, 结果显示模型组肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达与假手术组相比显著升高, 而IMM-H004可显著降低HIRI过程中炎症因子的mRNA水平, 与模型组相比具有统计学差异(图 3), 提示IMM-H004可显著降低HIRI过程中的炎症反应。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 The effect of IMM-H004 on inflammatory factors after HIRI. The mRNA expression of TNF-α (A), IL-1β (B), and IL-6 (C) in ischemia liver tissue. n = 3, x± s. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.000 1 vs sham group; #P < 0.05, ####P < 0.000 1 vs model group

利用免疫组化染色检测小鼠肝组织MPO的表达, 结果显示, 模型组MPO阳性细胞数显著增多, 而IMM-H004组MPO阳性细胞数显著减少(图 4A、B)。免疫荧光的结果与免疫组化的结果一致(图 4C、D)。以上结果提示, IMM-H004可显著降低HIRI过程中的中性粒细胞浸润。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 The effect of IMM-H004 on neutrophil infiltration after HIRI. A: Representative images of myeloperoxidase (MPO) immunohistochemistry staining; B: Quantitative analysis of positive cells in immunohistochemistry staining; C: Representative images of MPO immunofluorescence staining; D: Quantitative analysis of average intensity in immunofluorescence staining. n = 3, x± s. ***P < 0.001, ****P < 0.000 1 vs sham group; ##P < 0.01 vs model group. DAPI: Diamidino-phenyl-indole

利用Western blot检测NLRP3炎症小体通路相关蛋白的水平, 结果显示, 模型组NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表达显著升高, IMM-H004可显著降低NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白含量(图 5), 提示IMM-H004可抑制HIRI过程中NLRP3炎症小体通路的激活。

Figure 5

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Figure 5 The effect of IMM-H004 on NOD-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome activation after HIRI. A: Representative blots of proteins in NLRP3 inflammasome; B-E: Quantitative analysis of NLRP3 (B), apoptosis-associated speck-like protein (ASC, C), cysteinyl aspartate specific proteinase-1 (caspase-1, D) and IL-1β (E) normalized to β-actin. n = 3, x± s. *P < 0.05, ***P < 0.001 vs sham group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model group

HIRI是指肝组织发生一段时间的缺血后恢复血液灌注, 组织损伤没有减轻反而加重的一种病理过程, 是肝脏切除和肝移植等手术过程中不可避免的并发症, 直接影响到疾病的预后、手术的成功率以及患者存活率。有许多研究显示, CC类和CXC类趋化因子参与了HIRI的进程^[9-11], 抑制或者敲除趋化因子及其受体可减轻HIRI, 因此靶向趋化因子及其受体有可能成为HIRI治疗的一个新方向。CKLF1是一种CC类的趋化因子, 本课题组的前期研究发现, CKLF1可通过抑制MAPK通路的激活, 抑制炎症因子的释放以及中性粒细胞的聚集, 从而减轻HIRI^[4]。IMM-H004是以CKLF1为靶点, 经过筛选和结构优化得到的CKLF1的竞争性拮抗剂, IMM-H004能否对HIRI发挥保护作用成为作者关注的问题。

本实验采用小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型评价IMM-H004对HIRI保护作用。结果表明, IMM-H004对小鼠HIRI有显著的保护作用, 可以显著降低小鼠血清中肝脏生化指标ALT、AST和LDH的含量, 肝组织病理结果也显示IMM-H004给药可显著降低肝脏损伤程度, 肝脏坏死的程度较模型组明显降低。炎症反应在HIRI中有着至关重要的作用, 在HIRI的进程中受损的肝细胞和Kuffer细胞会释放出促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等进一步加剧损伤^[12]。本研究发现, 模型组小鼠肝组织的TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平显著升高, 而IMM-H004可显著降低这些促炎因子的mRNA含量, 提示IMM-H004有可能是通过降低HIRI中的炎症反应发挥对HIRI的保护作用。在HIRI的早期阶段, 受损的肝细胞和Kuffer细胞释放出的ROS和促炎因子会激活中性粒细胞。激活的中性粒细胞会进一步释放ROS和多种蛋白酶如组织金属蛋白酶等损伤肝细胞。此外, 中性粒细胞还会释放TNF-α和IL-1β等促炎因子进一步加剧炎症反应, 抑制中性粒细胞的聚集和激活可显著缓解HIRI^[13]。本研究利用免疫组化染色检测各组小鼠肝组织内MPO的表达, 结果显示IMM-H004给药组肝组织内MPO阳性细胞数显著减少, 提示IMM-H004可显著降低HIRI过程中肝组织内的中性粒细胞聚集。免疫荧光染色的结果与免疫组化一致, IMM-H004给药组肝组织切片荧光染色的平均光密度值较模型组显著降低, 因此可以得出结论, IMM-H004给药可抑制HIRI过程中的中性粒细胞的浸润。

越来越多的研究表明, NLRP3炎症小体通路在HIRI中有着至关重要的作用^{[14, 15]}。NLRP3炎性小体由NLRP3、接头蛋白ASC以及效应蛋白caspase-1三部分组成。当NLRP3被激活时, NLRP3与接头蛋白ASC结合, 引发caspase-1的活化, caspase-1切割IL-1β前体, 促进IL-1β的成熟和分泌以及细胞焦亡^{[16, 17]}。因此, 利用Western blot检测了HIRI过程中NLRP3炎症小体通路蛋白的表达变化。结果显示, 模型组NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表达显著高于假手术组, 并且有统计学差异。IMM-H004给药可显著降低NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白表达, 与模型组比较具有统计学差异。因此, 作者推测IMM-H004可能是通过降低HIRI过程中NLRP3炎症小体通路的激活, 发挥对HIRI的保护作用。

综上所述, 作者利用小鼠HIRI模型评价了化合物IMM-H004对HIRI的保护作用, 结果显示IMM-H004对小鼠HIRI具有显著的保护作用, 同时还可以降低HIRI中的炎症反应, 抑制中性粒细胞的聚集以及抑制NLRP3炎症小体通路的激活。此外, 作者推测IMM-H004是通过竞争性拮抗CKLF1与趋化因子受体4 (C-C motif chemokine receptor 4, CCR4) 的结合来抑制CKLF1从而发挥保护作用的, 在本课题组的前期研究中已利用Co-IP^[5]和BiFC双分子荧光互补技术^[18]证实IMM-H004可拮抗CKLF1与CCR4的结合, 因此本研究并没有验证CKLF1的变化及其与CCR4结合的变化。综上, 本研究证实了IMM-H004对HIRI的保护作用, IMM-H004为治疗缓解HIRI提供了一种新的方案。

作者贡献: 李芳芳负责实验方案设计、论文撰写; 李芳芳、周欣进行具体实验; 周欣、闫旭参与论文修改; 楚世峰、陈乃宏进行实验评估和指导。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。