药学学报  2021, Vol. 56 Issue (5): 1265-1278     DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-1691   PDF    
基于靶标IDO1、TDO的抑制剂研究进展
董俊敏, 刘站柱     
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050
摘要: 吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)和色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)催化色氨酸代谢的第一步也是限速步骤,与肿瘤免疫耐受和患者的不良预后相关,已经成为肿瘤免疫治疗的重要靶标。到目前为止,有9个IDO1抑制剂、3个IDO1/TDO双靶点抑制剂进入临床试验。本篇综述从药物化学角度总结了IDO1抑制剂、TDO抑制剂、IDO1/TDO双重抑制剂的研究进展。
关键词: 吲哚胺2, 3-双加氧酶1    色氨酸2, 3-双加氧酶    免疫治疗    抑制剂    构效关系    
Advances in research on inhibitors based on targets: IDO1 and TDO
DONG Jun-min, LIU Zhan-zhu     
State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Nature Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
Abstract: Indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 (IDO1) and tryptophan 2, 3-dioxygenase (TDO) catalyze the initial and rate limiting step in the catabolism of tryptophan, which is related to tumor immune tolerance and poor prognosis in patients. In this regard, two enzymes have become important therapeutic targets for tumor immunotherapy. So far, nine IDO1 inhibitors and three IDO1/TDO dual inhibitors have entered clinical trials. This review summarizes the research progress of IDO1 inhibitors, TDO inhibitors and IDO1/TDO dual inhibitors from the perspective of medicinal chemistry.
Key words: indoleamine-2, 3-dioxygenase 1    tryptophan-2, 3-dioxygenase    immunotherapy    inhibitor    structure-activity relationship    

色氨酸是蛋白质合成所必需的氨基酸, 对维持细胞的功能至关重要。体内超过95%的色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢为犬尿氨酸、犬尿酸、喹啉酸和辅酶NAD+[1, 2]。该途径的第一步也是限速步骤, 由吲哚胺2, 3-双加氧酶1 (IDO1)、吲哚胺2, 3-双加氧酶2 (IDO2) 和色氨酸2, 3-双加氧酶(TDO) 催化[3]。三者都是包含血红素的酶, 具有不同的结构、组织分布和生物学功能[4-6]。IDO1是单体酶, 广泛分布在哺乳动物的组织、器官和细胞中; 可被炎性刺激(如干扰素-γ) 诱导; 催化L-色氨酸、D-色氨酸和各种吲哚胺类衍生物的转化; 与色氨酸的非饮食分解代谢和免疫防御相关。IDO2与IDO1有43%的序列同源性, 主要分布在肾小管、肝脏和精子中, 色氨酸降解活性低, 作用机制仍不太明确。而TDO是一个四聚体结构, 主要分布在哺乳动物的肝脏中, 受刺激后, 也可以在胎盘、睾丸和大脑等其他组织中检测到; TDO具有高度的选择性, 优先与L-色氨酸结合; 可被色氨酸、糖皮质激素和犬尿氨酸诱导; 负责调节全身的色氨酸水平, 并在癌症免疫学中起到类似的作用。

色氨酸的耗竭和犬尿氨酸等代谢物的产生导致肿瘤微环境产生免疫抑制作用, 促进癌细胞的免疫逃逸[7]。研究表明IDO1和TDO在多种癌症细胞如乳腺癌、宫颈癌、脑癌等上调表达, 与肿瘤的侵袭性和患者的不良预后相关[8, 9], 其抑制剂已成为癌症免疫治疗的新策略。本文回顾了IDO1和TDO介导的肿瘤免疫逃逸的机制和各自独特的结构, 从药物化学角度总结IDO1抑制剂、TDO抑制剂和IDO1/TDO双重抑制剂的研究进展。

1 IDO1和TDO介导的肿瘤免疫逃逸的机制

IDO1和TDO催化色氨酸分解代谢, 可以维持机体正常的免疫反应幅度和持续时间, 防止健康细胞产生不受抑制的免疫激活[10]。但在恶性肿瘤中IDO1和TDO的表达上调, 导致色氨酸耗竭和下游产物的积累, 创造了一个免疫抑制微环境, 使肿瘤细胞逃避有效的免疫应答。主要包括以下3条路径(图 1): ①色氨酸的耗竭活化GCN-2激酶, 导致其下游靶标eIF-2磷酸化和衰减, 导致效应T细胞(Teff) 在G1周期增殖停滞[7]。②色氨酸的耗竭抑制mTOR所介导的分子应激反应, 诱发Teff细胞自噬。③色氨酸的分解代谢物犬尿氨酸与内源性芳烃受体(AhR) 的结合, 导致Treg细胞选择性分化增殖; 同时阻止辅助性T细胞17 (Th17) 的成熟, 进而抑制DC细胞的浸润和细胞毒性T细胞的免疫反应[7, 11, 12]。值得注意的是, IDO1涉及到这三种效应途径, 而TDO的免疫作用主要归功于活化GCN-2通路和与AhR的结合。除了色氨酸和犬尿氨酸诱导的免疫应答外, 喹啉酸、3-羟基犬尿氨酸等代谢物的产生还会影响巨噬细胞的转化, 抑制NK细胞的增殖和功能, 这些路径共同介导局部和/或全身性的免疫抑制作用, 促进肿瘤细胞的存活和转移[13]

Figure 1 Indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 (IDO1), tryptophan 2, 3-dioxygenase (TDO) signaling effect or pathways
2 IDO1和TDO的结构

IDO1是包含血红素铁的单体氧化酶, 分子质量约为45 kDa, 可以分成两个结构域(图 2A), 大的结构域(口袋A) 是由13个α-螺旋(G-S) 和2个310螺旋组成; 4个长螺旋(G、I、Q、S) 与其他3个短螺旋(K、L、N) 共同构成血红素结合口袋; 小的结构域(口袋B) 由6个α-螺旋(A-F)、两个短β-折叠和3个310螺旋构成[14]

Figure 2 The crystal structure of IDO1 and hTDO. A: IDO1-4PI complex (PDB code: 2D0T); B: hTDO (PDB code: 5TIA) monomer; C: hTDO (PDB code: 5TIA) tetramer

TDO是由分子质量在35~45 kDa的单体组成的同型四聚体酶, 从细菌到人类结构都非常保守[15-17]。hTDO单体由15个α螺旋组成, 可以被分成3个主要的区域(图 2B)—N端区域(α1~α3)、大结构域(α4~α9、α13、α14) 和小结构域(α10~α12、α15)。4个单体(A~D, 图 2C) 通过3个相互垂直的双向轴关联, 相连两个单体的相互作用力更强, 其中两个C形二聚体(AB和CD) 彼此垂直地被夹紧而形成紧密的四聚体[18]

hTDO和hIDO总体氨基酸序列同源性虽然只有10%, 但它们的大结构域显示相似的折叠, 可以共享相对保守的活性位点区域, 小结构域的整体结构和空间方向有所不同[14, 18]。总之, 这些结构可以帮助人们更深入地了解酶与底物结合、催化的分子机制, 也为设计新型的IDO1和TDO抑制剂提供了帮助。

3 临床进展 3.1 进入临床研究的IDO1抑制剂

对IDO1选择性抑制剂的研究已引起医药界的广泛关注, 相关专利文献已经报道了数千种化合物, 但还没有抑制剂上市。表 1为处于临床研究阶段的9个小分子化合物, 其中已知的结构式如图 3, 这些化合物除了作为单体使用, 还可以和化学疗法、免疫检查点疗法、放射疗法等联合使用, 相关文献[19]对联合用药的临床进展进行了详细的综述。

Table 1 IDO1 inhibitors in clinical trial

Figure 3 The structures of IDO1 inhibitors in clinical trials
3.2 进入临床研究的IDO1/TDO双重抑制剂

TDO和IDO1在某些肿瘤的表达是重叠的, 因此探索TDO抑制剂、IDO1/TDO双重抑制剂具有合理性。目前尚未有选择性TDO抑制剂进入临床研究, 有3个IDO1/TDO双重抑制剂已进入临床研究阶段(表 2), 均由中国制药公司研发, 但具体的结构并未公开。

Table 2 IDO1/TDO dual inhibitors in clinical trials
4 新型抑制剂研究进展 4.1 IDO1抑制剂

2003年, Van den Eynde首次证明IDO1与癌症相关[20], 在学术界和制药公司兴起一股热潮来寻找新颖的抑制剂骨架。已有研究者对IDO1抑制剂进行了详细的综述[21-23], 下文将根据化合物的结构类型对最新研究结果进行综述。

4.1.1 咪唑结构

NewLink基因公司从4-苯基咪唑(7, 图 4, IC50 = 48 μmol·L-1) 出发得到的化合物NLG-919 (5, IC50 = 28 nmol·L-1)[24], 目前已经进入到临床Ⅰ期研究阶段, 用于实体瘤的治疗。咪唑并[5, 1-a]异吲哚母核增加了分子的刚性, 改善了生化和细胞效能。分子对接显示NLG-919母核的2-位氮原子直接与血红素的铁原子配位, 三环骨架通过范德华力与口袋A上的残基Val130、Phe163、Phe164和Leu234紧密连接, 11-位羟基可以与丙酸血红素形成氢键, 环己醇部分则伸向口袋B, 末端羟基参与形成氢键网络, 这些相互作用有助于生物活性的提高。对NLG-919衍生物8 (IC50 = 38 nmol·L-1) 的研究进一步阐明了广泛的疏水相互作用和独特的氢键网络有利于提高咪唑异吲哚衍生物的抑制活性[25]。2019年, Tu等[26]报道了对NLG-919侧链的改造: 用不同环状基团取代侧链, 活性均下降或失活, 只有苯基哌啶基取代维持相似的活性。合成并评估了一系列取代的哌啶基, 手性分离得到对映体9 (IC50 = 9.7 nmol·L-1) 活性最好。9没有羟基不能形成氢键, 但侧链可以更深地插入口袋B中, 甲基吡唑环与残基Arg231之间存在的阳离子-π相互作用使其成为更有效的抑制剂。综上, 苯基咪唑骨架是研究IDO1抑制剂的良好起点, 咪唑并[5, 1-a]异吲哚作为一类新的药效团结构, 仍具有广阔的研究空间。

图 4 IDO inhibitors with imidazole scaffold

2020年, Serafini等[27]基于IDO1结构的虚拟筛选, 发现了苯并咪唑类化合物10 (图 5, IC50 =16 nmol·L-1), 对10进行系列的结构修饰, 构效关系总结如下: 苯并咪唑1-位N与血红素铁离子直接作用, 被移除活性消失; 5-位被Br原子取代, 增加与口袋A的亲和力, 保持活性; 仲酰胺的NH参与IDO1活性位点内关键氢键的形成, 被取代活性下降; 右侧为吡咯环时活性最好, 吡咯环上的NH可以和血红素形成氢键, 溴原子可以与残基形成卤素键, 被取代或移除活性均下降。所选化合物(10~13) 在几种肿瘤细胞中显示纳摩尔水平的抑制作用, 没有明显的细胞毒性。化合物12的体外代谢稳定性要优于1113, 在体外相同时间内, 分别残留65%、32%、59%的底物; 静脉注射12后, 小鼠血浆中犬尿氨酸水平在2 min内迅速下降, 并在30 min内保持在基础水平以下, 证明12在体内也是有效的。但体内半衰期(t1/2 = 0.65 h) 很短, 需要优化药代动力学参数。总之12与已知的IDO1抑制剂相比, 在化学结构、活性位点的构成、合成的可行性上展现了独特的优势。

Figure 5 IDO inhibitors with benzimidazole scaffold

基于IDO1/Amg-1的晶体结构, Tojo等[28]对Amg-1 (14, 图 6) 进行结构优化得到咪唑并噻吩类化合物, 其中化合物15 (IC50 = 77 nmol·L-1) 活性最高。2018年Griglio等[29]和2019年Serafini等[30]保持15的咪唑并噻唑骨架和对溴苯基部分不变, 对侧链进行了修饰和生物学评估。咪唑氮与血红素铁配位, 对溴苯基插入口袋A中, 与周围残基发生疏水相互作用, 侧链则插入口袋B中。化合物16~19 IDO1酶学抑制活性最高, IC50在0.2~0.8 μmol·L-1之间, 但仍较15要弱。遗憾的是, 这一类化合物对细胞膜的渗透性低, 在体外A375细胞实验中没有显示IDO1的抑制性。

Figure 6 IDO inhibitors with imidazothiazole scaffold
4.1.2 N-羟基脒结构

Incyte公司的临床候选化合物epacadostat (2, IC50 = 73 nmol·L-1)[31], 目前正在进行Ⅲ期临床试验, 用于多种癌症的治疗。但数据显示epacadostat在体内被代谢酶UGT1A9转化为O-葡萄糖醛酸共轭化合物20 (图 7), 半衰期只有2.5 h, 疏水性比较差(clogP = 0.09), 口服生物利用度不尽满意(大鼠和灵猴口服生物利用度分别是11%、33%)。因此, 有必要对epacadostat进行结构修饰, 发现药效和药动学性质更佳的化合物。

Figure 7 IDO1 inhibitors with N-hydroxyamidine scaffold

Meng课题组[32]在4位侧链引入一个环状结构以增加分子的空间位阻, 使其完全占据口袋B, 通过调节环状同源物的电子和空间效应来研究构效关系。但改造的效果不是很理想, 只有少部分化合物保持纳摩尔活性。化合物2122[32]通过环化末端氨磺酰胺部分得到, 化合物2324[33]是在磺酰胺基团和噁二唑环之间引入环状结构, 它们在HEK293细胞实验中保持与epacadostat相似的活性, IC50在16.8~68.59 nmol·L-1之间。值得注意的是, 化合物23与epacadostat相比, 药动学性能显著提高, 半衰期延长至3.82 h, 大鼠口服生物利用度达33.6%。同时在CT-26同系异种移植模型中, 口服化合物23与epacadostat具有相似的治疗效果, 适合作为先导化合物进一步开发。

2020年, Steeneck等[34]将epacadostat侧链的NH用S原子取代, 得到S-EPA (25, IC50 = 130 nmol·L-1), 细胞活性较epacadostat提高了3倍。对S-EPA进行结构改造, 发现口袋A处苯环上取代基的极性变化对活性有显著的影响; 侧链末端具有磺酰胺基可以提高效能和代谢稳定性。优选的化合物26 (IC50 = 21 nmol·L-1) 在人源化肝小鼠模型中, 葡萄糖醛酸化代谢作用明显降低。Du等[35]用磷酰胺基团代替epacadostat的磺酰胺基团得到一系列含磷酸氨基酯的化合物, 其中化合物27 (IC50 = 104 nmol·L-1, HeLa IC50 = 10.1 nmol·L-1) 展示了良好的IDO1抑制活性, 与epacadostat对Lewis细胞的肺转移实验有同等的抑制活性(77%的抑制率), 但半衰期短、口服生物利用度也未提高。

其他N-羟基脒类化合物还有2829, 用苯并噁二唑环代替苯环, 生物活性保持在纳摩尔水平, IC50分别为80、59 nmol·L-1 [36]。总之, N-羟基脒是这类化合物强抑制活性的关键药效团。在对epacadostat的结构修饰方面, 重点是在保持细胞活性的同时降低体内葡萄糖醛酸化代谢速率来改善药代动力学性质。

4.1.3 联苯羧酸类

近年来, Jure-Kunkel课题组通过高通量筛选得到联苯羧酸类化合物30 (图 8, IC50 = 0.087 μmol·L-1)[37], 通过四唑基团等位取代羧基、取代基的优化等, 得到化合物31 (HeLa IC50 = 4 nmol·L-1) 活性最佳[38]。分子32 (HeLa IC50 = 13 nmol·L-1) 与hIDO1晶体结构对接显示: 羧基的氧原子与血红素铁形成六配位, 苯环占据了口袋A, 二异丁基氨基和对甲苯脲部分延伸到口袋B中, 尿素的两个NH都与血红素的丙酸基团形成氢键。基于此, 2020年, Cai等[39]用萘环或苯并五元杂环取代化合物32的苯环并保留羧基, 评估体内外IDO1的抑制活性。这类化合物构效关系显示: 羧基和脲基是保持活性所必需的基团; 左侧芳环自身的电子云密度对活性影响较大, 其上有卤素基团可以更好地提高亲脂性。萘环系列活性最好的化合物是33 (HeLa IC50 = 2.6 nmol·L-1), 苯并五元杂环系列活性最好的是34 (HeLa IC50 = 12.8 nmol·L-1)。化合物33在MTT实验中并未显示细胞毒性, 在小鼠体内抗肿瘤研究中, 作为单体使用效果与epacadostat相当(抑制率为53.9%), 与5-氟尿嘧啶合用时, 抑制率高达92.8%, 值得进一步的研究。

Figure 8 IDO1 inhibitors with biphenyl carboxylic acid scaffold
4.1.4 醌类结构

醌类化合物大多来源于天然产物及其衍生物。近年来, 新的天然产物被报道。2015年, Blunt等[40]发现异噻唑苯醌天然产物aulosirazole (35, 图 9, IC50 = 0.08 μmol·L-1) 和pronqodine A (36, IC50 = 0.13 μmol·L-1) 都是有效的IDO1抑制剂。2019年, Pan等[41]从细极链格孢菌(Alternaria tenuissima) DFFSCS013中分离出3个新型蒽醌类化合物: anthrininone B、C (3738) 和39, 具有明显的IDO1酶抑制活性, IC50分别是4.2、0.5、1.7 μmol·L-1, 但在HEK293细胞中, 10 μmol·L-1的浓度也没有产生抑制活性。值得注意的是, 天然醌结构是细胞内NQO1等还原性辅因子的有效底物, 历经细胞内辅因子依赖的氧化还原循环, 导致氧化应激反应, 会限制醌类化合物在高浓度下使用[42]

Figure 9 IDO1 inhibitors with quinone scaffold

2018年, Pan等[43]设计合成了60个新型萘醌衍生物, 对A、B环进行不同的改造, 构效关系总结如下: 2位被4-吡啶基或4-咪唑基取代活性最好, 吡啶基或咪唑基上有任何的取代基活性下降; 在1, 4-萘醌的C-5或C-8位引入N原子活性下降; B环是噻唑环比咪唑环活性要好。选择两个活性最高的化合物40 (IC50 = 26 nmol·L-1)、41 (IC50 = 18 nmol·L-1) 进行深入研究。4041可使大鼠血浆中犬尿氨酸水平分别下降50.1%和30.5%, 同时在其对IDO1的有效抑制浓度下均无细胞毒性(在MTT毒性实验中, CC50 > 20 μmol·L-1), 这两个化合物被选作先导化合物进行更进一步的研究。

4.1.5 吲哚结构

在过去的几十年中, 大多数色氨酸类似物被证明可以作为IDO1抑制剂。最经常使用的就是1-甲基-色氨酸(1-MT, 42, 图 10)[44], 现在多作为化学工具研究IDO1的生物学作用。1-MT和低氧细胞毒素替拉扎明(TPZ) 的杂合分子43 (Ki = 76.3 μmol·L-1), 首先作为低氧细胞毒素起作用, 然后它们的代谢产物TPZ-NO杂合物作为IDO1抑制剂, 具有独特的作用模式[45]。含有D-1-MT的Pt (Ⅳ) 复合物4445作为免疫化疗剂, 可以促进T细胞增殖, 促进免疫调节作用[46]。2017年, Crosignani等[47]开发出琥珀酰亚胺类化合物PF-06840003 (4, IC50 = 0.41 μmol·L-1), 用于治疗Ⅳ级胶质母细胞瘤或Ⅲ级间变性胶质瘤, 正在进行I期临床试验, PF-06840003与大多数IDO1抑制剂不同, 它不与血红素铁结合, 而是通过与hIDO1形成高密度氢键发挥作用。总体来说, 这一类化合物值得进一步研究癌症影像学、癌症免疫化学疗法等新应用。

Figure 10 IDO1 inhibitors with indole scaffold
4.1.6 其他结构

BMS (百时美施贵宝) 公司开发的BMS-986205 (3, IC50 = 1.7 nmol·L-1)[48], 与PD-1抑制剂nivolumab联合用药, 处于临床Ⅲ期研究阶段。值得注意的是, BMS-986205是与不含亚铁血红素的IDO1蛋白结合, 具有独特的结合模式。分子对接显示: 苯环占据口袋A, 与Tyr126形成π-π相互作用; 酰胺上的NH与Ser167形成氢键; 环己烷作为连接基团将喹啉环导向一个新的疏水性口袋; 喹啉环与Phe270形成π-π相互作用; 喹啉上的氮原子与Arg343形成氢键[49]。这种结合模式, 为抑制剂的设计提供了新的思路。

此外, 非天然产物来源的化合物(46~48, 图 11)[50-52], IC50分别是36 nmol·L-1、0.22 μmol·L-1、151 nmol·L-1, 为IDO1抑制剂提供了多样性的结构, 在体内实验中能够抑制肿瘤的生长。2019年, Xu等[53]采用虚拟筛选的策略, 结合相似性搜索和分子对接方法发现了氰基吡啶骨架化合物, 分子对接显示: 嘧啶环中的腈基直接与铁血红素结合, 嘧啶环位于口袋A中, 另一个芳环占据口袋B中, 其中化合物49 (IC50 = 84 nmol·L-1) 活性最好。

Figure 11 Other IDO1 inhibitors
4.2 TDO抑制剂

与IDO1相比, TDO虽然在1930s年就被发现, 但直到2011年, 一项脑肿瘤研究才正式将TDO与癌症联系起来[54], 使该酶成为有兴趣的药理学靶标。目前针对TDO的类似研究仍处于初始阶段, 只有少量的TDO抑制剂被报道。下文对有代表性的结构进行简要概述。

4.2.1 吲哚结构

自TDO发现以来, 少数基于吲哚骨架的化合物被发现具有TDO抑制活性[55-57]。1995年, Salter等[58]开发了一系列3-(2-(吡啶基) 乙烯基) 吲哚类化合物作为TDO/5-羟色胺再摄取组合抑制剂用于治疗抑郁症, 其中680C91 (50, 图 12, IC50 = 0.28 μmol·L-1), 它对肝脏提取的TDO具有出色的体外抑制活性(Ki约为30 nmol·L-1)。但溶解度低, 生物利用度差, 未进行更深入的研究。2011年, Dolusic等[59]将680C91与XcTDO (野油菜黄单胞菌TDO) 进行分子对接, 显示吲哚的NH基团与残基His55形成H键稳定吲哚环, 3-吡啶基向活性位点的入口突出, 并与残基Thr254的NH形成H键。基于此模型, Dolusic合成了70多个类似物, 在细胞水平测定TDO的抑制活性。构效关系总结如下: 吲哚骨架是保持活性所必需的结构, NH参与形成氢键, 不可被取代; 母核5位或6位被F取代或没有取代基时活性最佳; 连接链为反式双键或炔键可以保留活性; 3位侧链引入带负电荷的基团, 可与残基通过氢键作用增加溶解度而不影响稳定性。尽管得到了相对完整的构效关系, 但仍无法显著提高该系列化合物的TDO抑制活性。含四唑基团的LM10 (51, IC50 = 0.62 μmol·L-1) 和含羧基的化合物52 (IC50 = 3 μmol·L-1), 活性较50稍弱, 但具有改善的理化参数, 表现为低亲脂性(logD7.4分别为0.2和0.6)、高溶解度和高稳定性, 特别是LM10, 具有高的口服生物利用度。LM10因其高选择性、高活性成为最具潜力的候选药物, 在临床前实验中还显示出有效的抗肿瘤活性[60]

Figure 12 TDO inhibitors with indole scaffold

2016年Abdel-Magid等[61]合成了一系列3-吲哚衍生物, 以化合物53 (A172 IC50 = 27 nmol·L-1) 和54 (A172 IC50 = 26 nmol·L-1) 细胞水平活性最好。但重要特性如溶解度、生物利用度和抗肿瘤活性的结果未公开。

4.2.2 萘三唑二酮结构

2015年, Wu等[62]采用基于结构的虚拟筛选方法得到苗头化合物55 (图 13, IC50 = 711 nmol·L-1), 包含萘三唑二酮的核心结构, 具有潜在的TDO抑制活性。当去掉苄基或者对萘三唑二酮结构进行修饰, 均使活性消失, 证明核心结构和苯基与血红素和周围残基的相互作用是保持活性的重要原因, 该类化合物构效关系研究集中在对苯环的修饰, 在N-苄基的对位和间位引入刚性叔酰胺可显著提高对TDO的抑制作用。其中化合物56 (IC50 = 30 nmol·L-1) 的抑制活性最高。分子对接发现, 5556的萘三唑二酮和苯基结构高度重叠, 与血红素基团和周围残基具有相似的配位和疏水相互作用, 但56N-甲基哌嗪酰胺基团与残基Arg144形成额外的氢键增强了TDO的抑制活性。同时, 56对TDO抑制活性比IDO1抑制活性(IC50 = 640 nmol·L-1) 高21倍, 高选择性的原因是56无法与IDO中的残基Arg231 (TDO中的相应残基Arg144) 相互作用。根据上述结果, 设计与hTDO中残基Arg144相互作用的化合物将是提高TDO抑制剂活性和选择性的有效方法。化合物56是第一个通过基于结构的虚拟筛选鉴定的新型TDO抑制剂, 需要进一步评估其作为癌症治疗剂的潜力。

Figure 13 TDO inhibitors with naphthotriazoledione scaffold

2019年, Hua等[63]提出将TDO抑制剂引入Pt (Ⅳ) 复合物的策略。通过释放顺铂以损伤DNA的方式诱导癌细胞死亡, 同时生成TDO抑制剂阻断TDO蛋白的表达, 促进T细胞增殖并杀死癌细胞, 提高化疗药物的治疗效果。复合物58 (IC50 = 1.06 μmol·L-1) 与57 (IC50 = 5.23 μmol·L-1)、顺铂(IC50 = 3.85 μmol·L-1) 相比, 在MTT实验中展示了最强的细胞毒性。同时58具有适中的TDO酶抑制活性(IC50 = 0.85 μmol·L-1), 在qRT-PCR实验中可以有效下调TDO蛋白的表达, 阻断犬尿氨酸的产生, 促进T细胞增殖, 显著改善肿瘤免疫微环境。相关方法的协同作用及相关的强化机制有待于继续研究。

4.2.3 氨基异噁唑结构

2018年Pei等[64]通过高通量筛选发现苗头化合物4-苯基-5-氨基异噁唑59 (图 14), SW48细胞EC50为85 nmol·L-1, 从异噁唑环氨基的修饰、苯环的取代或替换、异噁唑的替换三方面对59进行修饰(图 14)。构效关系发现: 5-氨基异噁唑结构是抑制TDO所需的核心结构, 替换活性降低; 苯环的取代或替换(化合物60~62) 对活性影响程度较小, 其中以化合物62 (SW48 EC50 = 77 nmol·L-1) 细胞活性最好。62对TDO的选择性是IDO1的6倍, 酶实验没有观察到对细胞色素P450的抑制作用, 并且在全血的稳定性更高。总之, 这一类化合物存在全血中稳定性不高的问题, 未来研究应明确其不稳定的原因以及与结构的关系。

Figure 14 TDO inhibitors with aminoisoxazole scaffold
4.2.4 其他结构

1961年, 氧化还原活性化合物如儿茶酚、对苯二酚、对苯醌、L-二羟基苯丙氨酸和L-肾上腺素被发现作为TDO抑制剂[65]。2014年, Pantouris等[66]筛选了将近2 800种化合物, 采用hTDO酶促分析方法鉴定了7种有效的TDO抑制剂, 其抑制常数(Ki) 在纳摩尔或低微摩尔范围内, 但没有报道这些TDO抑制剂的IC50值。其中黄酮类化合物NSC36398 (63, 图 15) 对TDO的Ki约为16 μmol·L-1, 而对IDO1的Ki值超过100 μmol·L-1, 是选择性最好的化合物, 可以进行进一步的结构优化。2018年, Zhang等[67]评估了天然产物色胺酮64 (IC50 = 3.94 μmol·L-1) 和衍生物潜在的TDO抑制活性, 其中化合物6566的酶活性分别是0.937和0.1 μmol·L-1, 相较于IDO1有良好的选择性(分别是38倍和88倍)。构效关系表明: 8位是吸电子基团活性要优于给电子基团; 2位、7位、9位被取代不利于TDO抑制活性。分子对接显示色胺酮环通过O-Fe配位作用和疏水相互作用直接结合到hTDO的活性位点。化合物6566具有发展成为新型TDO抑制剂并应用于TDO相关靶标治疗的潜力。2020年, Parr等[68]根据IDO1选择性抑制剂NLG-919 (5, IDO1 EC50 = 0.45 μmol·L-1; TDO EC50 = 2.0 μmol·L-1) 的结构, 保留骨架咪唑并异吲哚, 对侧链进行结构改造。当侧链为四氢苯并噁二唑67 (IC50 = 0.054 μmol·L-1)、N-稠合四氢吡唑并吡啶68 (IC50 = 0.13 μmol·L-1)、四氢苯并吡啶69 (IC50 = 0.05 μmol·L-1) 时具有较高的TDO选择性和抑制活性。在肝微粒体和肝细胞中, 有适中的代谢稳定性。

Figure 15 Other TDO inhibitors
4.3 IDO1/TDO双重抑制剂

2018年, ECHO-301 (IDO1抑制剂epacadostat与PD-1检查点抑制剂pembrolizumab联合用药) 用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤的Ⅲ期临床试验以失败告终。试验失败的原因一方面可能是药效学指标不适用或药物组合策略不匹配, 另一方面可能是对IDO1在生理病理中的确切调控机制以及对肿瘤微环境等的影响了解得不够深入, epacadostat选择性阻断IDO1的表达, 但TDO通路可以发挥潜在的代偿作用引起肿瘤免疫抑制效应[69]。因此开发组合或泛型IDO1/TDO抑制剂, 可以克服选择性IDO1抑制剂在临床试验中的不足, 扩大癌症治疗的适用范围。下文对文献中有代表性的结构进行阐述。

4.3.1 吲哚结构

2019年Cui等[70]通过对数据库随机筛选发现了具有2-羧酸吲哚骨架的新型IDO1/TDO双重抑制剂70 (图 16, IDO IC50 = 40.7 μmol·L-1; TDO IC50 = 99.2 μmol·L-1) 和71 (IDO IC50 = 35.6 μmol·L-1; TDO IC50 = 22.5 μmol·L-1), 以其为先导化合物进行广泛的结构修饰, 总结构效关系如下(图 16): 2-羧基吲哚骨架和4位NH连接链是保持活性所必需的结构; 骨架7位修饰空间有限, 甲基、氰基、硝基等取代时活性消失, 只有F原子和甲氧基取代保持活性; 6位乙酰氨基或乙胺基通过氢键促进与IDO1或TDO的结合, 增加活性; 4位连接链上苯环的取代方式及取代基的性质对活性影响较大, 苯环3′位上是-F、-OCH3、-CH3等小的疏水性基团有利于活性, 苯环4′位上是氢键受体如F或O原子可增加与酶的亲和力。化合物72 (IDO IC50 = 8.4 μmol·L-1; TDO IC50 = 8.48 μmol·L-1) 和IDO1/TDO酶的分子对接显示2-羧基吲哚骨架位于血红素顶部的口袋中, 结构修饰空间非常有限; 而在4位的芳香族基团可以延伸到环和IDO1中残基Arg231 (TDO中残基Arg144) 周围的区域, 具有一定的灵活性, 可增加结构多样性。在A172细胞中, 化合物73 (IDO IC50 = 3.18 μmol·L-1; TDO IC50 = 7.12 μmol·L-1) 是最有效的抑制剂, 在浓度为100 μmol·L-1时抑制率为77.7%, 在浓度为50 μmol·L-1时抑制率为55.9%, 在10 μmol·L-1时可以促进T细胞增殖, 但活性远比NLG-919要弱。值得注意是, Cui同时鉴定了化合物72的衍生物74 (IDO IC50 = 18 nmol·L-1; TDO IC50 = 25 nmol·L-1), 一类新型的醌衍生物, 对IDO1和TDO的抑制性更高, IC50值均达到纳摩尔水平。这一发现可以用于指导进一步的结构优化, 以开发活性更强的IDO1/TDO双重抑制剂。

Figure 16 IDO1/TDO dual inhibitors with indole scaffold and preliminary SAR conclusions
4.3.2 吲唑结构

Qian课题组[71]之前研究的吲唑类化合物LWQ-84 (75, 图 17, IC50 = 5.3 μmol·L-1) 具有弱的IDO1抑制活性, 没有TDO的抑制活性, 在细胞(HeLa细胞和A172细胞) 实验和CT26异种移植模型中几乎没有抗癌作用。2019年, 该课题组以LWQ-84为先导化合物, 通过改变4位氨基上的取代基, 合成了38个吲唑衍生物, 但改造效果并不令人满意, 只有几个化合物与LWQ-84的活性相当或更好。其中, 化合物76对IDO1和TDO的抑制作用最强, IC50分别为0.74和2.93 μmol·L-1。且在HeLa细胞实验中显示IDO1抑制活性(IC50 = 1.37 μmol·L-1), 在A172细胞实验中显示TDO抑制活性(IC50 = 7.54 μmol·L-1), 在CT26异种移植模型中表现出体内抗肿瘤活性。总体来说, 吲唑类化合物还需要进一步探索结构优化的位点。

Figure 17 IDO1/TDO dual inhibitors with indazole scaffold
4.3.3 其他母核结构

近年, Kuang课题组[72, 73]对天然产物色胺酮的2位进行结构修饰, 合成了24个衍生物。大部分化合物都具有相似的IDO1和TDO抑制活性, 在基于细胞的测定中均显示出比酶活法测定更高的抑制活性, N-苄基取代的色胺醌(77, 图 18, IDO IC50 = 0.5 μmol·L-1; TDO IC50 = 0.76 μmol·L-1) 活性要高于N-苯基取代的色胺醌(78, IDO IC50 = 2.2 μmol·L-1; TDO IC50 = 2.59 μmol·L-1), 化合物79对IDO1和TDO抑制活性最佳, IC50分别是0.12和0.03 μmol·L-1, 但化合物水溶性较差。79可与IDO1和TDO直接相互作用, 逆转T淋巴细胞的抑制作用, 对LLC和H22荷瘤小鼠的体内研究发现, 明显抑制了肿瘤的生长。这项研究使色胺酮类化合物成为有吸引力的IDO1/TDO双重抑制剂。

Figure 18 Other IDO1/TDO dual inhibitors

2019年, Feng等[74]报道了新的IDO1/TDO双重抑制剂F04 (80), 其结构与IDO1抑制剂epacadostat相似, 包含磷酰胺基团。酶实验显示具有很强的IDO1抑制性(IC50 = 94.5 nmol·L-1) 和中等的TDO抑制性(IC50 = 2.6 μmol·L-1)。比起epacadostat, F04显著抑制C57BL6小鼠和Lewis细胞肺转移模型中肿瘤的生长。泛IDO1/TDO特性降低了肿瘤细胞中犬尿氨酸与色氨酸的比例, 其机制值得进一步研究。同年, Guo等[75]筛选天然产物数据库, 发现一类醌类结构的化合物81~83, 在低微摩尔范围内抑制酶的活性。最活跃的化合物83表现出亚微摩尔活性。在酶学实验中, 化合物81 (IDO IC50 = 2.2 μmol·L-1; TDO IC50 = 91.1 μmol·L-1) 和82 (IDO IC50 = 0.98 μmol·L-1; TDO IC50 = 5.05 μmol·L-1) 对IDO1的抑制活性更强(大于10倍), 化合物83 (IDO IC50 = 2.8 μmol·L-1; TDO IC50 = 5.1 μmol·L-1) 对IDO1和TDO具有相似的抑制活性。在HEK293细胞实验中, 三者在抑制IDO1和TDO上具有相似的效力, 表明在细胞环境中可同时抑制IDO1和TDO, 为开发具有新型分子骨架的IDO1/TDO双重抑制剂提供了新的线索。

5 总结和展望

免疫治疗可以通过恢复甚至激活癌症患者天然的免疫系统来识别和清除肿瘤细胞, 作为一种新的肿瘤治疗方法, 发展前景广阔。IDO1和TDO介导的色氨酸分解代谢是肿瘤免疫逃逸的重要机制。肿瘤细胞中IDO1和TDO的高表达, 导致色氨酸的耗竭和犬尿氨酸等代谢物的积聚, 使效应T细胞(Teff) 和自然杀伤(NK) 细胞被抑制, 调节性T细胞(Treg) 被激活, 提供肿瘤免疫耐受的微环境, 促进肿瘤免疫逃逸。综上, IDO1和TDO成为肿瘤免疫治疗的重要靶标。

在过去的几十年里, IDO1在肿瘤发生发展中的作用及机制研究取得了重要进展, 有数千种选择性IDO1抑制剂被报道, 但仅有9个候选化合物进入临床研究。尽管ECHO-301 Ⅲ期临床研究以失败告终, 但对IDO1的研究兴趣依旧持续很高。TDO与IDO1相比, 作用机制和相关抑制剂的研究仍处在初始阶段。它们可以催化相同的反应, 但组织分布和生物学功能不同, 因此TDO仍需被深入的探索。开发选择性TDO抑制剂、IDO1/TDO双重抑制剂可成为免疫疗法的新策略。

总之, 在基于靶点的药物分子设计、天然产物的结构修饰、高通量筛选、组合化学等研发策略的指导下, 开发具有新骨架、高活性的新型抑制剂, 优化药代动力学性质, 是未来抑制剂的发展方向。同时IDO1和TDO参与多种肿瘤的免疫逃逸过程, 其抑制剂联用其他免疫检查点抑制剂或者与化学疗法、放射疗法等传统方法的联合使用也值得尝试和期待。

作者贡献: 董俊敏负责文章的资料收集、撰写以及修改工作; 刘站柱对文章结构和具体内容进行审阅和指导以及获取研究经费。

利益冲突: 本文所有作者无任何利益冲突。

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