仙灵骨葆制剂在临床上应用广泛, 是用于治疗骨质疏松、骨折、骨关节炎、骨无菌性坏死等骨科疾病的苗药制剂, 收载于《国家基本药物目录》。近年来, 相继有仙灵骨葆引起药物性肝损伤的报道^{[1, 2]}, 国家食品药品监督管理局也发出了相关通报^[3]。然而, 仙灵骨葆引起药物性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI)的风险大小尚不完全清楚。

仙灵骨葆由淫羊藿、续断、知母、补骨脂、地黄和丹参六味中药组成, 从组方来看仙灵骨葆中均为传统无毒中药。课题组前期研究发现仙灵骨葆对正常动物不会引起肝损伤, 但在免疫应激模型上可引起大鼠血浆ALT和AST水平升高以及组织学损伤^[4]。仙灵骨葆方中的主要致肝损伤药味, 以及是否存在配伍减毒, 尚未充分研究。

基于此, 为进一步明确仙灵骨葆肝损伤的临床特征、风险因素以及风险大小, 本研究对仙灵骨葆进行文献不良反应报告、重点医院病例和区域全人群健康大数据分析, 评估其引起肝损伤在临床DILI中的占比及粗发生率, 为其安全性评价和临床合理用药提供参考^[5]。进一步对仙灵骨葆进行两步拆方的动物实验, 以期明确其导致肝损伤的原因和具体药味, 为降低仙灵骨葆肝损伤风险提供参考。

文献回顾性分析  检索数据库中国知网(CNKI), 根据医学主题词表, 限定检索的关键词为“仙灵骨葆”并且“肝功能不全”或“肝功能异常”或“肝损伤”或“肝损害”或“肝衰竭”, 检索的截止日期为2018年12月31日, 对检索到的病例进行统计比较。相同方法检索其他骨病用药并进行病例数统计, 与仙灵骨葆病例数进行比较, 判断仙灵骨葆相关肝损伤的总体发生水平。

住院病例再评价  在解放军总医院第五医学中心(2008年1月1日~2017年12月31日)数据库中诊断为“药物性肝损伤”、“药物性肝炎”且服用骨病用药的病例, 将仙灵骨葆与其他骨病用药进行比较, 对其肝损伤发生水平进行再评价。

在首都医科大学附属友谊医院(2009年1月1日~2018年12月31日)数据库中诊断为“药物性肝损伤”、“药物性肝炎”且服用过仙灵骨葆制剂的病例。参照中华中医药学会《中草药相关肝损伤临床诊疗指南》(以下简称《指南》)推荐的基于整合证据链法的HILI诊断策略对住院病例进行客观性评价^[6]。

肝损伤粗发生率估算  在2009年1月1日~2017年12月31日期间, 基于鄞州社区全人群健康大数据检索出仙灵骨葆相关肝损伤病例进行再评价, 合并同一病例, 删除重复病例, 筛选得到服用仙灵骨葆后发生肝功能异常并被诊断为“药物性肝损伤”或“药物性肝炎”的病例。按照肝损伤发生率的计算公式估算仙灵骨葆肝损伤的粗发生率。同时基于鄞州社区全人群健康大数据筛选出几种治疗骨病化学药物的相关肝损伤病例, 计算其肝损伤粗发生率, 与仙灵骨葆进行比较, 进一步判断仙灵骨葆的相对发生风险。肝损伤粗发生率的计算公式^[7]: $仙灵骨葆肝损伤年化粗发生率=\frac{\text { 研究时间内服用过仙灵骨保且发生肝损伤的病例数 }}{\text { 研究时间内所有服用过仙灵骨保的病例数 }} \times 100\%$。采用正态近似法, 计算其95%置信区间, 公式为: $P \pm \mu_{\alpha / 2} \mathrm{Sp}, \mathrm{Sp}=\sqrt{\frac{P(1-P)}{n}}$

动物  健康SPF级雄性C57小鼠80只, 6周, 体重18±2 g, 购于斯贝福实验动物科技有限公司[合格证号SYXK (京) 2017-0002]。分笼饲养于解放军总医院第五医学中心实验动物中心, 自由饮水饮食。饲养环境: 湿度50%~60%、温度(25±1)℃, 明暗周期(各12 h), 通风良好。动物实验获得中国人民解放军总医院第五医学中心动物伦理委员会批准(批准号: IACUC-2019-0019)。

仪器  微量分析天平(Mettler Toledo AL204瑞士); 低温离心机(美国Thermo Fisher Scientific Sigma公司); SynergyH2全功能微孔板检测仪(美国BioTek公司); Nikon E200光学显微镜(日本Nikon公司); Leica2016石蜡切片机(上海莱卡仪器有限公司); Leica EG1150组织包埋机等。

药物与试剂  仙灵骨葆(XLGB)处方药物: 淫羊藿(批号181102, 产地甘肃)、补骨脂(批号181102, 产地云南)、丹参(批号181101, 产地山东)、地黄(批号181001, 产地河南)、知母(批号181101, 产地安徽)、续断(批号181101, 产地四川), 均由贵州同济堂制药有限公司提供。仙灵骨葆各药按原方比例称取适量, 根据要求制作水煎液。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)购于Sigma公司(批号: 028M4094V); 丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(货号: C009-2)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(货号: C010-2)购于南京建成生物工程研究所。按照给药剂量(2.8 mg·kg^-1)^[8]计算所需脂多糖的量, 采用无菌生理盐水涡旋溶解, 4℃贮存备用。

仙灵骨葆拆方实验

拆方实验一  C57小鼠80只随机分为8组(每组10只), 分为正常组(N)、仙灵骨葆全方组(X)、淫羊藿+补骨脂组(A)、地黄+丹参+知母+续断组(B)、LPS模型组(L)、LPS+仙灵骨葆组(LX)、LPS+淫羊藿+补骨脂组(LA)、LPS+地黄+丹参+知母+续断组(LB)。正常组给予生理盐水, 各给药组分别灌胃给予对应药液(20 mL·kg^-1), 淫羊藿、补骨脂、地黄、丹参、知母、续断剂量分别为1.68、0.12、0.12、0.12、0.12和0.24 g·kg^-1。免疫应激模型动物尾静脉注射LPS 0.5 mg·kg^-1, 其余各组尾静脉注射等体积生理盐水, 2.5 h后给予相应药液, 6 h后摘眼球取血, 4℃、3 500 r·min^-1离心15 min, 分离血浆, 于-80℃冰箱内保存; 取小鼠肝大叶部分, 放置于4%中性多聚甲醛溶液中固定。

拆方实验二  C57小鼠60只随机分为6组(每组10只), 分为正常组(N)、LPS+淫羊藿+补骨脂组(LA)、LPS+淫羊藿+补骨脂+地黄组(DH)、LPS+淫羊藿+补骨脂+丹参组(DS)、LPS+淫羊藿+补骨脂+知母组(ZM)、LPS+淫羊藿+补骨脂+续断组(XD)。给药方式、给药剂量及操作同上。

肝功能指标检测和肝脏病理学检查  按照说明书操作测定并计算血浆ALT、AST的活力值。肝组织HE染色, 显微镜下观察病理切片。

统计分析  采用SPSS 22.0统计软件进行分析, 计量资料采用单因素方差分析(ANOVA), P < 0.05或P < 0.01表示具有显著性差异。

从CNKI数据库中检索到的仙灵骨葆相关肝损伤文献中, 剔除会议摘要、综述, 符合要求的文献一共7篇, 合计11例患者^[9-15], 基本情况见表 1, 整合信息发现很大比例的病例报告信息不完整, 联合用药多, 因果关系不清晰。同时检索到另外5种致肝损伤的骨病用药^[16-20], 构成比排序为见图 1。

表1(Table 1)

表 1 Basic information of cases of liver injury related to Xianling Gubao (XLGB) retrieved by CNKI (all of patients was improved in this treatment and reactivation did not happen to them). ALP: Alkaline phosphatase; ALT: Alanine aminotransferase; TBIL: Total bilirubin; INR: International normalized ratio; RUCAM: Roussel-Uclaf causality assessment method No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Gender Female Female Female Female Female Female Female Female Male Female Female Age (years) 65 68 45 57 57 67 40 63 64 57 60 Other possible causes induced liver injury investigation Autoimmune antibodies - - Negative - - - Negative - - - - Hepatitis A, hepatitis C, and hepatitis E antibodies - - Negative - Negative - Negative - - - - Hepatitis B serological test All negative All negative Hbcab positive All negative All negative - All negative - - - - Drink history - - - - - - - No No No No Clinical type of liver injury - - Hepatocellular - - - - Hepatocellular Mixed Hepatocellular Mixed Medication history Compound reserpine and triamterene tablets, compound Ginkgo leaves tablets Cisapride - Omeprazole capsules, Dengzhan Shengmai capsules, calcitriol soft gelatin capsules, levothyroxine tablets Amlodipine besylate Tablets Alfarosalitol, levothyroxine tablets Diclofenac sodium sustained release capsules - - - - Duration from medication to liver injury (days) 180 60 10 60 20 194 28 30 300 30 60 Clinical characteristics ALP/U·L-1 - - 129 - - - - 267.65 163 88.16 579 ALT/U·L-1 85 158 1 098 389 2 196 930 - 1 477.4 770 150 629 TBIL/μmol·L-1 - - 47.2 - - - 496 313.51 228.3 12.4 12 INR - - - - - - - - - - - RUCAM scores - - - - - - - 8 6 7 6 Final outcome Cured Cured Cured Cured Cured Cured Death - - - - Integrated evidence chain evaluation - - - - - - - - - - -

表 1 Basic information of cases of liver injury related to Xianling Gubao (XLGB) retrieved by CNKI (all of patients was improved in this treatment and reactivation did not happen to them). ALP: Alkaline phosphatase; ALT: Alanine aminotransferase; TBIL: Total bilirubin; INR: International normalized ratio; RUCAM: Roussel-Uclaf causality assessment method

Figure 1

Figure 1

Figure 1 The number of cases of liver damage related to medicines in the treatment of bone disease in 2007-2019 searched by China National knowledge infrastructure (CNKI)

从两家重点专科医院数据库中, 收集解放军总医院第五医学中心(2008~2017年)和首都医科大学附属友谊医院(2009~2018年)的药物性肝损伤病例共4 275例, 其中仙灵骨葆相关肝损伤的病例只有6例。收集到的6例患者中男性2例, 女性4例, 年龄在55~82岁之间, 病例的基本情况见表 2。

表2(Table 2)

表 2 Evaluation of 6 liver injury cases in two key specialized hospitals (in the investigation of other possible causes induced liver injury, i.e. autoimmune, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C and hepatitis E virus, the serological antibodies test of all of them were negative. All of patients had not drink history. The clinical type of liver injury was hepatocellular. Disease reaction did not happen to all of patients) No 1 2 3 4 5 6 Gender Female Male Female Male Female Female Age (years) 70 75 55 82 75 64 Medication history Xianling Gubao capsules, tinidazole, Qianggu capsules, calcitriol soft gelatin capsules Xianling Gubao capsules, loxoprofen sodium tablets Xianling Gubao capsules, Thai snake medicine Xianling Gubao capsules, olanzapine, estazolam, calcitriol, cervus and cucumis polypeptide, cobamamide Xianling Gubao capsules, warfarin, calcitriol, Qianggu capsules, calcarea carbonica Xianling Gubao capsules, Gushukang capsules Duration from medication to liver injury (days) 180 30 20 40 30 25 Clinical characteristics ALP/U·L-1 120 113 101 168 225 165 ALT/U·L-1 904 775 1 149 666 520 610 TBIL/μmol·L-1 390.9 100.3 13.4 432 8.8 165.69 INR 2 1.75 1.03 3.82 1.82 1.08 RUCAM scores 5 8 9 7 7 9 Outcome Invalid Improved Improved Invalid Improved Improved Final outcome Death Cured Cured Death Cured Cured Integrated evidence chain evaluation Suspected diagnosis Suspected diagnosis Clinical diagnosis Suspected diagnosis Suspected diagnosis Clinical diagnosis

表 2 Evaluation of 6 liver injury cases in two key specialized hospitals (in the investigation of other possible causes induced liver injury, i.e. autoimmune, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C and hepatitis E virus, the serological antibodies test of all of them were negative. All of patients had not drink history. The clinical type of liver injury was hepatocellular. Disease reaction did not happen to all of patients)

以上住院病例中, 患者均在服用仙灵骨葆一个月左右发生肝损伤, 多数患者经停药并积极治疗后, 病情好转出院。通过整合证据链的方法, 对这6例病例进行再评价, 2名患者达到“临床诊断”标准, 另外4名患者为“疑似诊断”。

从解放军总医院第五医学中心数据库中, 对检索的仙灵骨葆相关肝损伤病例进行统计, 同时检索到另外4种致肝损伤的骨病用药, 构成比排序: 骨康胶囊 > 丹鹿通督片 > 尼美舒利 > 仙灵骨葆制剂 > 金天格胶囊。

鄞州区域全人群健康大数据从2009年到2017年间, 服用过仙灵骨葆的病例总数为149 838例, 其中发生肝功能异常并被诊断为“药物性肝损伤”和“药物性肝炎”的有50例, 估算仙灵骨葆药物性肝损伤的粗发生率为: 0.034%(95%CI, 0.025%~0.043%)。参照国际医学科学组织理事会(CIOMS)对不良反应发生率的风险分级: 十分常见(≥10%), 常见(1%~10%, 含1%), 偶见(0.1%~1%, 含0.1%), 罕见(0.01%~0.1%, 含0.01%), 十分罕见(< 0.01%), 仙灵骨葆的粗发生率属于“罕见”。将仙灵骨葆与另外三种治疗骨病的化学药物进行对比, 结果显示, 仙灵骨葆肝损伤总体发生风险低于化学药(表 3)。

表3(Table 3)

表 3 Comparison of the incidence of liver injury between XLGB and chemical drugs for bone diseases Drugs Diagnostic cases Medication cases Occurrence rate/% 95% CI Allopurinol 114 22 623 0.504 0.41%-0.60% Leflunomide 6 3 680 0.163 0.033%-0.29% Celecoxib 60 125 686 0.048 0.036%-0.060% XLGB 50 149 838 0.034 0.025%-0.043%

表 3 Comparison of the incidence of liver injury between XLGB and chemical drugs for bone diseases

课题组前期利用脂多糖(LPS)介导的免疫应激模型, 发现壮骨关节丸的组成药味淫羊藿、补骨脂均可导致免疫特异质肝损伤^[21]。基于此研究结果, 以淫羊藿和补骨脂为药对, 对仙灵骨葆进行拆方分析研究, 验证淫羊藿和补骨脂在免疫应激模型下的肝损伤作用, 并观察其余4味药是否有肝损伤作用。

仙灵骨葆全方、淫羊藿和补骨脂、其余4味药均未引起正常小鼠肝功能生化指标AST、ALT明显改变, 也未引起肝脏病理明显改变。在免疫应激状态下, 全方组及淫羊藿和补骨脂组相对其他组, 小鼠肝功能指标AST, ALT显著升高(P < 0.01)、肝脏病理发生变化, 出现明显的肝损伤表型, 淫羊藿和补骨脂组比全方组肝损伤程度更严重, 而其他4味药无明显作用(图 2)。结果提示在免疫应激状态的条件下, 仙灵骨葆方中淫羊藿和补骨脂可致肝损伤, 可能为仙灵骨葆的损肝组分。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Plasma biochemical indexes (A, B) and HE staining (×200)(C) of liver tissue.#P < 0.05 vs L.N: Normal; L: Lipopolysaccharide, LPS; X: XLGB; LX: LPS+XLGB; A: Epimedii Folium+Psoraleae Fructus; LA: LPS+Epimedii Folium+Psoraleae Fructus; B: Dipsaci Radix+Anemarrhenae Rhizoma+Rehmanniae Radix+Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (the other 4 herbs); LB: LPS+Dipsaci Radix+Anemarrhenae Rhizoma+Rehmanniae Radix+Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma

在免疫应激动物模型上, 仙灵骨葆方中淫羊藿和补骨脂可致肝损伤, 且毒性要高于全方组, 说明仙灵骨葆方中其余四味药存在一定的减毒效果, 本部分将基于拆方实验的内容, 分别对地黄、丹参、知母、续断的减毒作用进行评价。

在免疫应激状态下, 淫羊藿和补骨脂组、淫羊藿和补骨脂分别配伍其余4味药组肝功能指标ALT、AST均显著升高, 以淫羊藿和补骨脂组最为明显(图 3)。与模型组相比, 加地黄、丹参、知母、续断的各组均有不同程度的减毒作用, 其中丹参组减毒作用最明显, 具有显著性差异(P < 0.05)。结果提示在免疫应激状态下, 方中丹参对仙灵骨葆全方具有配伍减毒作用。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Biochemical indexes of plasma.A: ALT; B: AST.#P < 0.05 vs M.N: Normal; M: LPS; DH: LPS+Epimedii Folium+Psoraleae Fructus+Rehmanniae Radix; DS: LPS+Epimedii Folium+Psoraleae Fructus+Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma; ZM: LPS+Epimedii Folium+Psoraleae Fructus+Anemarrhenae Rhizoma; XD: LPS+Epimedii Folium+Psoraleae Fructus+Dipsaci Radix

仙灵骨葆是临床常用的治疗骨病的中成药, 近年来有关其肝损伤的报道逐渐引起社会各界关注, 评估仙灵骨葆致肝损伤的发生风险和方中损肝药味变得尤为重要。通过文献回顾性分析, 发现仙灵骨葆临床病例中大多报告不准确, 存在因果关系不清晰的情况^[22]。仙灵骨葆临床DILI病例的比例排序低于其他骨病用药, 提示仙灵骨葆相关肝损伤总体发生水平较低。对鄞州社区全人群健康大数据记载的病例进行筛选统计, 估算仙灵骨葆肝损伤粗发生率为0.034%, 属罕见范畴, 说明仙灵骨葆相关肝损伤仅发生在极少数人身上, 绝大多数的人服用仙灵骨葆是安全的。将仙灵骨葆与用于治疗骨病的三种化药进行对比发现其肝损伤发生率低于同类型的化学药物。综合提示, 仙灵骨葆可能在极少数易感个体引起特异质肝损伤, 发生风险低于其他常用骨病药物。

拆方研究表明在免疫应激状态的条件下, 仙灵骨葆方中淫羊藿和补骨脂是引起肝损伤的相关药味, 丹参对仙灵骨葆全方具有配伍减毒作用。此研究明确了仙灵骨葆导致肝损伤的原因和具体药味, 以及仙灵骨葆全方中丹参可降低其引起肝损伤毒性, 可为仙灵骨葆安全性评价和临床安全用药提供参考。课题组针对淫羊藿的研究表明淫羊藿次苷II可通过增强NLRP3炎症小体的激活导致特征性肝损伤^{[23, 24]}。另有文献研究表明补骨脂素、补骨脂二氢黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂酚等与补骨脂潜在肝毒性相关^[25]。此外, 丹参水溶性成分丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素和脂溶性成分丹参酮IIA均有保肝作用^{[26, 27]}。但淫羊藿、补骨脂、丹参成分均复杂, 仍需要深入研究。特别是不同产地的丹参成分含量差异很大, 选择适宜产地的丹参原料可能更好地降低仙灵骨葆全方的肝损伤风险, 有待深入研究。

作者贡献：王伽伯、肖小河负责实验思路设计; 黄迎、马润然为本文主要撰写者; 刘亚蕾、黄迎负责完成主要的实验部分; 李春雨、马致洁和高源提供实验思路; 景婧、沈鹏和林鸿波提供病例信息; 王伽伯、郭玉明和柏兆方负责论文修改; 所有作者均对本文有所贡献。

利益冲突：本文无任何利益冲突。