肿瘤免疫疗法已成为近年来肿瘤治疗的研究热点。该治疗手段主要是提高自身免疫系统肿瘤微环境(tumours microenviroment, TME)中肿瘤特异性T细胞(tumour-specific T cell)的免疫应答来杀伤或抑制肿瘤。其中CD3⁺CD8⁺ T在TME中起着非常重要的作用, 它属于细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs), 可特异性识别肿瘤细胞表面抗原, 进而靶向杀伤肿瘤细胞^{[1, 2]}。而CD3⁺CD4⁺ T归属于辅助性T细胞(T helper cells, Th), 它能通过胞溶机制直接清除肿瘤细胞或间接调节TME发挥抗肿瘤作用。此外, Th辅助细胞可增加CTLs的克隆数量, 提高其分泌IFNγ的能力, 增强CTLs抑瘤活性^{[1, 3, 4]}。因此, 评价CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞功能在肿瘤免疫治疗分子机制及其药物研发具有重要意义。本实验采用不同的刺激剂CD3/CD28抗体、金黄色葡萄球菌B型肠毒素(Staphylococcus auresus enterooxin B, SEB)、白介素27 (interleukin 27, IL27)、植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)和佛波酯+离子霉素(PMA+ionomycin)作用于人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC) 24 h, 观察CD3⁺CD4⁺ T和CD3⁺CD8⁺ T细胞的活化标志物CD69的变化以及淋巴细胞增殖和IFNγ分泌能力。一方面综合评价这些生物学指标能否反映T功能变化; 另一方面对比这些刺激剂活化T细胞的强度, 从而为后续肿瘤免疫研究和药物筛选提供实验依据。

血液样本  新鲜健康人全血, 由中国食品药品检定研究院提供, 已取得志愿者的知情同意, 并得到中国食品药品检定研究院伦理委员会批准。

试剂  人外周血淋巴细胞分离液购于达科为生物技术有限公司。CellTiter-Glo检测试剂盒购于Promega公司, IL27、PHA、SEB、PMA、ionomycin购于Sigma公司。IFNγ的ELISA试剂盒、CD3/CD28抗体和Pecy7 anti-human CD69抗体购自Biolegend公司。

仪器  美国BD公司的FACSVerse流式细胞仪, 日本三洋公司的CO₂培养箱, 美国Sigma公司冷冻离心机, 美国Bio-tec酶标仪。

人PBMC的制备  取新鲜抗凝人全血至无菌的50 mL离心管, 再用等体积的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)稀释全血。在另一离心管中加入一定体积的分离液, 将稀释后的全血小心缓慢地平铺到分离液面上方, 使两界面保持清晰。淋巴细胞分离液、未稀释全血、PBS体积比为1：1：1。于室温并置于水平转子离心机, 800 ×g离心25 min。离心结束后, 小心吸取离心管中部致密白色细胞层(PBMC层)移至新的无菌离心管中。用PBS稀释到一定体积, 颠倒混匀。于室温水平转子250 ×g离心10 min, 弃上清。重复洗涤2次, 进行细胞计数后调整细胞数至1×10⁶个/孔。

流式细胞术检测不同刺激剂对淋巴细胞的活化作用  将制备好的PBMC接种于96孔U型板中, 置于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中平衡2 h。加入不同刺激剂, 如抗人CD3/CD28抗体(终质量浓度: 20和200 ng·mL^-1)、SEB (终质量浓度10 ng·mL^-1)、PHA (终质量浓度1 μg·mL^-1)、IL27 (终质量浓度10 ng·mL^-1)、PMA + ionomycin联合刺激(终质量浓度为PMA: 10 ng·mL^-1、ionomycin: 1 μg·mL^-1)。每个剂量组设3个平行孔, 置于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中继续培养24 h。离心, 收集细胞上清, 冻于-80 ℃冰箱保存。将细胞用预冷PBS洗涤2次, 加入Pecy7 anti-human CD69抗体孵育30 min, 预冷的PBS洗涤2次后, 采用流式细胞检测仪(BD FACS Verse)检测淋巴细胞CD69的表达情况, 并采用Flowjo 7.6软件分析淋巴细胞CD69的平均荧光强度和CD69阳性淋巴细胞百分比。

CellTiter-Glo发光法检测淋巴细胞增殖  将上述处理的细胞重悬, 移取100 μL细胞悬液至新的96孔板中, 加入100 μL CellTiter-Glo底物, 室温避光5 min, 于Bio-tec酶标仪检测发光值。

ELISA试剂盒检测IFNγ  将试剂盒中Capture antibody加入96孔板中, 4 ℃过夜孵育。次日用清洗缓冲液清洗5次, 向每孔中加入待测样品及不同浓度的标准品于室温孵育2 h, 用清洗缓冲液洗5次。加入检测抗体于室温孵育1 h, 清洗缓冲液洗5次。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育30 min。再加入底物TMB于室温避光孵育15 min, 加入硫酸终止, 在酶标仪450 nm处检测。

统计学方法  采用GraphPad Prism统计软件处理, 数据用x ± s表示。P≤0.05为具有统计学意义。

采用流式细胞术, 对CD3⁺CD4⁺ T细胞亚群中的CD69表达进行检测。如图 1所示, 静息状态下CD3⁺CD4⁺ T细胞表面上的CD69表达量较低。CD3/CD28 (20和200 ng·mL^-1)、PMA (10 ng·mL^-1)+ionomycin (1 μg·mL^-1)、SEB (10 ng·mL^-1)和IL27 (10 ng·mL^-1)均可以显著性促进CD69的表达, 表现为PE-Cy7通道的平均荧光强度右移。其中PMA+ionomycin诱导CD3⁺CD4⁺ T细胞上CD69的表达能力最强, CD3/CD28、SEB和IL27刺激因子诱导CD3⁺CD4⁺ T细胞上CD69的表达能力基本一致。上述这些因子诱导CD69高表达的CD3⁺CD4⁺ T细胞百分比分别为74.7%、91.5%、85.2%、64.1%、68.3%。而PHA (1 μg·mL^-1)对CD3⁺CD4⁺ T细胞上CD69的表达无诱导作用, CD3⁺CD4⁺CD69⁺ T细胞百分比基本无影响。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 The effect of different stimulators on the CD69 expression of CD3+CD4+ T lymphocytes at 24 h by flow cytometry analysis. PHA: Phytohaemagglutinin; SEB: Staphylococcus auresus enterooxin B; IL27: Interleukin 27; PMA: Phorbol myristrate acetate

本研究也检测了不同刺激因子对CD3⁺CD8⁺ T细胞亚群中的CD69表达的影响。如图 2所示, 与CD3⁺CD4⁺ T细胞一致, 在未刺激状态下CD3⁺CD8⁺ T细胞表面上的CD69表达量较低。CD3/CD28 (20和200 ng·mL^-1)、PMA (10 ng·mL^-1)+ionomycin (1 μg·mL^-1)、SEB (10 ng·mL^-1)、IL27 (10 ng·mL^-1)和PHA (1 μg·mL^-1)均可以促进CD3⁺CD8⁺ T细胞CD69的表达。其中CD3/CD28、PMA+ionomycin、SEB和IL27促进CD3⁺CD8⁺ T细胞CD69的表达能力基本一致, 都显著强于PHA。上述这些因子诱导CD69高表达的CD3⁺CD8⁺ T细胞百分比分别为88.3%、92.4%、88.5%、70.6%、82.9%、15.1%。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 The effect of different stimulators on the CD69 expression of CD3+CD8+ T lymphocytes at 24 h by flow cytometry analysis

T细胞增殖对机体的免疫应答起到了重要作用。本研究采用CellTiter-Glo^®发光法检测了不同刺激剂对淋巴细胞增殖能力的检测。如图 3所示, CD3/CD28、PMA+ionomycin、SEB、IL27和PHA作用24 h均无明显促进人淋巴细胞增殖的作用。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 The proliferation of lymphocytes after exposed of different stimulators for 24 h

IFNγ是T淋巴细胞活化的重要标志。采用ELISA法检测了不同刺激剂对淋巴细胞分泌IFNγ含量的影响。如图 4所示, CD3/CD28 (200 ng·mL^-1)、PMA (10 ng·mL^-1)+ionomycin (1 μg·mL^-1)、SEB (10 ng·mL^-1)、IL27 (10 ng·mL^-1)作用24 h显著诱导由淋巴细胞分泌的IFNγ。其中, PMA+ionomycin诱导IFNγ分泌的作用最强。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 The IFNγ levels were detected after exposed of different stimulators for 24 h

T细胞的功能, 主要从T细胞增殖、活化和分泌水平方面进行评价。增殖能力检测常用形态学观察、放射性核素掺入法和MTT法。镜下形态观察效率低且主观影响大; 同位素虽然精确, 但会对环境造成污染; MTT法灵敏度不够, 同时会受到化合物自身的颜色干扰。本研究采用CellTiter-Glo发光法检测淋巴细胞的增殖。该方法通过检测ATP含量, 可快速灵敏地反映活细胞数量, 成为目前免疫细胞增殖检测的一种常用方法^{[5, 6]}。活化能力评价的方法有CFSE标记检测细胞分裂^[7], ELISA法检测细胞因子分泌如IFNγ, 流式细胞术检测细胞表面标志物CD69、CD25和HLA-DR等^[8-10]。本研究则检测不同功能刺激剂对T细胞亚群细胞表面标志物CD69表达和IFNγ分泌。其中, CD3/CD28抗体为体外模拟特异性T淋巴细胞活化信号而诱导T细胞的增殖^[11]; PMA激活PKC信号从而使T细胞活化增殖^[12], ionomycin为Ca²⁺载体并介导Ca²⁺的内流^[13], 与PMA联用进一步增强其激活淋巴细胞的能力; SEB为超级抗原, 通过T细胞受体β (TCR-β)大量激活T细胞^[14]; PHA是一种有丝分裂原从而激活淋巴细胞^[7]; IL27与其受体相互作用诱导早期Th1型反应^[15]。在本实验所用浓度下的CD3/CD28抗体、PMA+ionomycin、SEB和IL27作用刺激24 h, CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞CD69的表达显著增高。以上结果提示, CD69是一个很好的T细胞早期活化的标志物, 可同时反映CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T的活化。与此同时, 淋巴细胞分泌的IFNγ含量也显著增高。IFNγ是T淋巴细胞活化的重要指征之一^[16]。IFNγ最初由机体固有免疫中自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T (NKT)细胞分泌, 然后被特异性抗原免疫中Th1和CTLs细胞进一步分泌^[17]。因此, 应该综合活化标志物CD69与IFNγ含量来评价T细胞的活化状态。而刺激剂作用24 h对淋巴细胞增殖几乎无影响, 提示淋巴细胞在接受刺激后短时间内以活化为主, 随着时间的延长才可能表现出增殖能力增强。

由于小分子化合物体外单独作用不能直接刺激淋巴细胞活化, 因此在体外评价小分子化合物对T细胞功能的影响时, 需要模拟肿瘤微环境的抗原呈递细胞(APCs)与T细胞的相互作用, 或者采用刺激因子先将T细胞活化^[18]。本研究除了发现反映T细胞活化的标志物外, 更好地建立了体外活化T细胞的方法, 为进一步抗肿瘤免疫小分子药物发现奠定实验基础。