肝纤维化是一种严重影响人们生活质量的疾病, 是肝硬化和肝癌早期的重要病理特征^[1]。肝纤维化因其发病率高、治愈率低和致死率高日益受到重视^[1-3]。肝纤维化主要由肝病毒感染、酗酒、胆汁淤积和代谢紊乱等因素引发的慢性病^{[1, 4]}。细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成与降解失衡, 导致ECM过度沉积是引发肝纤维化主要的原因。肝星形细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的激活在肝纤维化中发挥了关键性作用^[5]。目前, 无有效可逆转肝纤维化的药物。

人参皂苷Rg1是一种四环三萜类皂苷, 许多中草药含有Rg1。药理学研究表明, Rg1具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗肿瘤和抗疲劳等作用^{[6, 7]}。人参皂苷Rg1在多种肝脏疾病中具有广泛的药理作用^[8]。先前的研究表明, Rg1对脂肪肝、酒精肝炎和药物性肝损伤具有强效作用^[8-12]。Rg1可介导核因子红系2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2)信号通路抵抗酒精等因素引发的氧化应激。另外, Rg1通过其他多种途径抵抗四氯化碳(CCl₄)等因素诱发的肝炎和肝纤维化^[13-17]。但是, Rg1对胆汁淤积诱导的肝纤维化的作用尚未见报道。

本研究采用胆总管结扎(BDL)的方法制备胆汁淤积性肝纤维化模型^[18], 在此基础上, 通过灌胃给予人参皂苷Rg1的方法评价其对BDL诱导的肝纤维化的治疗作用, 同时观察Rg1在此模型中对VCAM-1的表达影响, 进一步探究VCAM-1在此模型肝纤维化过程中表达变化规律, 并探讨Rg1对肝纤维化治疗相关的作用机制, 为将Rg1开发成有效的肝纤维化治疗药物提供理论依据。

动物  雄性C57 BL/6J小鼠(8周, 体重22~24 g), 购自北京斯贝福生物技术有限公司[清洁级, 合格证号: SCXK (京) 2016-0002], 饲养于中国医学科学院药物研究所动物房。所有动物实验都获得单位伦理学委员会批准。实验动物在明暗交替(12 h:12 h)的清洁级动物房中饲养, 自由进食饮水, 预适应环境7天。

药品与试剂  人参皂苷Rg1购自云南极粹生物科技有限公司, 纯度 > 98%;异氟烷(瑞沃德实验技术有限公司); DAPI、AlexaFluor 546标记驴抗兔抗体(Life Technology公司); NF-κB p65抗体、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗体(美国Santa Cruz公司); 白细胞介素-1β (interleukin 1β, IL-1β)抗体、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)抗体、VCAM-1抗体、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)抗体和α平滑肌动蛋白(alpha smooth muscle actin, α-SMA)抗体(Abcam公司); 谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)试剂盒、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)试剂盒、总胆汁酸(total bile acid, TBA)试剂盒和总胆红素(total bilirubin, T.Bili)试剂盒(中生北控生物科技有限公司); P1200核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒、RIPA裂解液、ECL超敏发光液(北京普利莱基因技术有限公司); 其他相关试剂购自北京化工厂。

胆总管结扎模型的建立  将小鼠分成两批进行实验:第1批进行胆总管双结扎, 随机分为假手术组、BDL-1d组、BDL-3d组、BDL-7d组和BDL-14d组(分别在胆总管双结扎后的第1、3、7和14天进行取材), 经过禁食不禁水12 h。采用异氟烷吸入性麻醉后, 将小鼠仰卧于手术台上, 头部放置通有异氟烷的小鼠面罩, 以便手术中持续麻醉小鼠, 医用胶条固定其四肢, 75%酒精消毒。在剑突处下方正中切口, 长约1.5 cm左右, 打开腹腔后找到胆总管, 过程中注意避免伤及肝脏和胰腺等, 游离出胆总管后, 用手术缝合线在近十二指肠端和靠近肝脏端双重结扎, 然后依层复位, 缝合手术切口, 碘酊消毒后常规饲养。假手术组不进行结扎, 其余操作同胆总管双结扎的模型组。手术后先将小鼠放置于温控毛毯上, 待小鼠苏醒。第2批小鼠也随机分为假手术组、BDL-14d组和Rg1 (40 mg·kg^-1)治疗组。小鼠经过胆总管结扎后, 1天1次进行灌胃给药。假手术组和BDL-14d组以同样的方式给予生理盐水, 治疗组每天通过灌胃给药方式给予Rg1 (40 mg·kg⁻¹), 每天观察小鼠状态, 连续给药14天, 禁食不禁水12 h后进行取材。

血清生化指标检测  将血浆室温静置2 h后进行离心, 常规分离血清, 利用全自动生化分析仪测定小鼠血清中ALT、AST、TBA和T.Bili含量。

肝脏病理切片  小鼠麻醉后固定, 用常规浓度磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)经心脏灌流, 至肝脏白色, 换4%多聚甲醛灌流5 min, 取小鼠肝脏固定于4%多聚甲醛24 h以上, 石蜡切片脱蜡水化, 进行苏木素-伊红染色(苏木素染细胞核, 伊红染细胞质), 脱水封片, 显微镜镜检, 图像采集分析。

Sirius red染色  石蜡切片脱蜡至水。天狼猩红染色液染色:切片入饱和苦味酸天狼猩红染色液内染色8 min。漂洗:切片入无水酒精漂洗数分钟, 显微镜下观察满意为止。封片:切片于60 ℃烤箱烤干后于二甲苯透明5 min, 中性树胶封片。显微镜镜检, 图像采集分析。

Masson染色  石蜡切片脱蜡至水, 苏木素染细胞核, 丽春红染色, 磷钼酸处理, 苯胺蓝染色, 分化, 脱水中性树胶封片, 显微镜镜检, 图像采集分析。

免疫组化  检测肝脏中VCAM-1表达情况。主要的操作步骤:石蜡切片经二甲苯和酒精梯度脱蜡, 抗原修复, 透化打孔(0.5% Triton X-100室温孵育10 min), 灭活10 min (3% H₂O₂), 5% BSA室温封闭45 min, 将VCAM-1抗体溶液1:200 (3% BSA+PBS)加于切片上, 4 ℃孵育过夜, PBS漂洗5 min×3次, 二抗羊抗兔1:200, 室温孵育120 min, PBS漂洗5 min×3次, DAB试剂盒显色, 适当时终止显色, 脱水封片, 显微镜下观察, 采集图像。

免疫荧光  检测肝脏内中性粒细胞(MPO阳性细胞)数目的变化情况。具体操作步骤:石蜡切片脱蜡, 抗原修复, 透化打孔(0.5% Triton X-100室温孵育10 min), 5% BSA室温封闭45 min, 将MPO抗体溶液1:200 (3% BSA+PBS)滴加于切片上, 4 ℃孵育过夜, PBS漂洗10 min×3次, 免疫荧光二抗(AlexaFluor 546标记驴抗兔抗体1:500, Hochest 33342 1:1 000)室温避光孵育1 h, PBS漂洗10 min×3次, 90%甘油封片, 荧光显微镜下观察, 采集图像。

Western blot  小鼠安乐处死, 分离并取出肝脏, 总蛋白提取, 液氮速冻后加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液超声破碎, 离心取上清液, BCA法蛋白定量, 加入上样缓冲液, 沸水中15 min, -20 ℃保存。根据胞浆胞核蛋白提取试剂盒说明书提取核内蛋白。蛋白上样量为40 μg, 具体步骤:配制聚丙烯酰胺凝胶, 电泳, 将蛋白转印至PVDF膜, 用封闭液3% BSA封闭2 h, 一抗(VCAM-1、IL-1β、TNF-α、NF-κB p65、PCNA、α-SMA、β-actin) 4 ℃孵育过夜, PBST漂洗10 min× 3次, 二抗室温孵育2 h, PBST漂洗10 min×3次, 加入ECL超敏发光液显影。用Quantity one分析软件对蛋白条带进行灰度分析。

Real-time PCR分析  小鼠安乐处死, 分离并取出肝脏, 液氮速冻后加入Trizol试剂提取肝脏组织中总RNA、总RNA的纯度分析及含量计算, 经逆转录得到cDNA, 获得的cDNA保存于-20 ℃。实时荧光定量PCR检测, 检测指标VCAM-1。

统计学分析  实验数据采用x± s表示, 实验结果用Graphpad Prism 6软件进行统计分析。数据多组间比较采用方差分析(one-way ANOVA)进行统计分析; 两两比较采用t检验, 当P < 0.05, 则有显著性差异。

如图 1a所示, 分别对每组小鼠的肝组织进行了苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, H & E)。正常小鼠肝小叶结构清晰, 肝细胞形态完整。BDL诱导的模型组小鼠肝组织可见大量炎性细胞浸润、显著的空泡样病变、肝细胞坏死及明显的胆汁淤积现象, 并随BDL时间的延长而加重。另外, BDL对小鼠肝功能产生严重影响, 随着BDL造模时间的延长, 模型组小鼠的肝功能明显受到损伤, 小鼠血清中AST和ALT测定结果见图 1b, c。BDL造成胆汁淤积现象, 随着造模时间延长而加重, 如图 1d, e所示, 总胆汁酸(TBA)和总胆红素(T.Bili)随造模时间延长而升高。此外, 本研究分别对每组小鼠的肝组织进行了Sirius red染色和Masson染色, 结果见图 1f, 假手术组小鼠肝几乎没有胶原纤维, BDL诱导的模型组小鼠肝组织中胶原纤维随胆总管结扎时间延长而增加, 胶原纤维结缔组织大量增生沉积, 形成宽大致密的汇管区－中央静脉纤维间隔和假小叶。与假手术组相比, BDL-7d组胶原基质沉积有明显差异, 而BDL-14d组肝组织Sirius red染色和Masson染色的阳性面积显著增加。这些指标表明BDL诱导的胆汁淤积性肝损伤模型是成功的。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Aggravation of liver function and collagen fibers with prolonged time during bile duct ligation (BDL)-induced fibrosis. a: Representative HE staining results of BDL mice. b-e: Representative serum biochemical parameters of BDL mice. b: Aspartate transaminase (AST); c: Alanine transaminase (ALT); d: Total bile acid (TBA); e: Total bilirubin (T.Bili). Liver tissue sections are semi-quantitatively analyzed for the positive areas of collagen fiber staining. f: Sirius red staining and Masson staining. n = 6, x± s. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs sham group. Original magnification, 100×

如图 2a所示, H & E染色发现人参皂苷Rg1 (40 mg·kg^-1)对胆汁淤积性肝损伤具有保护作用, 可保护肝细胞组织结构。BDL导致小鼠肝组织肿胀、点状坏死和融合性坏死、大量炎性细胞浸润及胆汁淤积现象。Rg1治疗后可缓解这些病理改变。通过14天造模和给药后, 取血清检测AST、TBA、T.Bili和ALT水平的改变(图 2b~e)。由图可见, BDL导致这些血清生化指标显著升高(P < 0.001), Rg1可降低这些指标, 但未能降低至正常水平。与模型组相比, Rg1 (40 mg·kg^-1)组可显著降低AST、ALT和T.Bili水平, 而TBA水平有所下降, 但无显著性差异。综上, 人参皂苷Rg1能够减轻BDL诱导的胆汁淤积性肝损伤, 并改善肝功能。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Protective effect of Rg1 on histopathological changes and serum parameters. a: Representative liver histology of mice by H & E staining. The abnormal elevations of AST, ALT, TBA and T.Bili were reversed by the treatment of Rg1 (40 mg·kg-1). b: AST; c: TBA; d: T.Bili; e: ALT. n=4-6, x± s, ***P < 0.001 vs sham group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs BDL-14d group. Original magnification, 40×

本研究结果显示, 人参皂苷Rg1能明显缓解BDL诱导的胆汁淤积性肝纤维化。分别对假手术组、BDL-14d组和给药组Rg1 (40 mg·kg^-1)的肝组织切片进行了Masson染色和Sirius red染色, 结果见图 3。在图 3a, c中, 假手术组小鼠肝组织中几乎没有胶原纤维沉积, BDL诱导的模型组小鼠肝中胶原纤维结缔大量增生沉积, 主要分布在汇管区和坏死区域, 40 mg·kg^-1 Rg1组可减轻肝纤维化程度, 减少Masson染色和Sirius red染色阳性面积。如图 3b, d所示, 分别是Masson染色和Sirius red染色的阳性面积量化结果。活化的HSC细胞是ECM主要的来源^[19], 而α-SMA是HSC细胞活化的标记物。如图 3e, f所示, 与BDL-14d组相比, 40 mg·kg^-1 Rg1组可降低肝脏中α-SMA蛋白的表达水平, 抑制HSC细胞的活化。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Rg1 effectively ameliorated BDL-induced liver fibrosis. Liver tissue sections are semi-quantitatively analyzed for the positive areas of collagen fiber staining; Positive areas of Masson staining and Sirius red staining in BDL-14d group was significantly increased compared with sham group, while the Rg1 (40 mg·kg-1) group was significantly reduced comparing with the BDL-14d group. Rg1 inhibited expression level of α-SMA in BDL-induced mice. a: Masson staining; b: Quantitative results corresponding to Masson staining; c: Sirius red staining; d: Quantitative results corresponding to Sirius red staining; e, f: Western blot analysis of α-SMA in liver tissue. n=4-6, x± s. *P < 0.05, ***P < 0.001 vs sham group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs BDL-14d. Original magnification, 40×

黏附分子在肝炎和肝纤维化中扮演了重要角色, 慢性肝炎患者的肝脏中黏附分子被上调^[20]。本研究分析Rg1对BDL诱发肝纤维化中VCAM-1的影响。首先发现, VCAM-1在BDL诱导的肝纤维化过程中呈现一种动态变化(图 4a, b)。免疫组织化学(图 4a)显示, VCAM-1主要表达在肝组织坏死区的肝细胞、血管内皮细胞和胆管上皮细胞, 诱导白细胞跨过上皮和内皮向炎症部位聚集, 加剧炎症反应。与假手术组相比, BDL造模后第1天VCAM-1表达上调, 到第7天VCAM-1的表达达到高峰, 第14天表达略有下调。采用qPCR方法, 对各组肝组织中VCAM-1 mRMA水平进行检测, 结果(图 4b)显示, BDL诱导的肝纤维化过程中VCAM-1 mRNA表达水平与蛋白水平一致。另外, 给予Rg1后降低VCAM-1的表达。如图 4c, d所示, 与假手术组相比, VCAM-1在BDL-14d组肝组织中表达升高, 40 mg·kg^-1 Rg1可显著降低VCAM-1的蛋白水平。免疫组织化学显示, 40 mg·kg^-1 Rg1也减轻肝损伤, 并缓解炎性细胞的聚集(图 4c)。为进一步研究人参皂苷Rg1对VCAM-1的调控机制, 本研究检测了VCAM-1的上游NF-κB的活化情况。对3组实验小鼠的肝组织细胞核中NF-κB的含量进行检测发现, 与假手术组相比, BDL-14d组肝组织细胞中NF-κB入核显著增加, 而Rg1 40 mg·kg^-1组可明显降低细胞核内NF-κB的含量(图 4e, f)。这提示Rg1可抑制NF-κB信号通路的活化, 下调VCAM-1的表达, 抑制炎症反应, 从而减轻肝纤维化。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Dynamic changes of VCAM-1 during BDL-induced liver fibrosis and activation of the NF-κB signaling pathway inhibited by Rg1. Rg1 (40 mg·kg-1) inhibits the activation of NF-κB signaling pathway, down-regulates the expression of VCAM-1, andinhibits the inflammatory response, thereby reducing liver fibrosis. a: Immunohistochemistry results of VCAM-1 staining; b: Quantitative analysis of VCAM-1 by qPCR; c and d: Inhibitory effect of Rg1 on VCAM-1 level determined by immunohistochemistry and Western blot in BDL-induced mice. e and f: Inhibitory effect of Rg1 on nucleus NF-κB level determined by Western blot in BDL-induced mice. n=4-6, x± s. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 vs BDL-14d group. Original magnification, 100×

VCAM-1可介导白细胞向炎症部位聚集, 而上述结果表明Rg1可降低VCAM-1表达。本文检测了肝脏中性粒细胞浸润情况。结果显示, Rg1可显著减少受损后肝脏组织中性粒细胞浸润。如图 5a所示, 与假手术组相比, BDL-14d组肝组织中MPO阳性细胞显著增多, 40 mg·kg^-1 Rg1组可明显降低MPO阳性细胞数, 这可能与其降低VCAM-1的表达相关。然后, 采用Western blot方法, 对肝纤维化组织中IL-1β和TNF-α的蛋白水平进行检测, 如图 5b, c所示, 与假手术组相比, BDL-14d组的肝组织中两者含量显著上升, 40 mg·kg^-1 Rg1组可有效地降低损伤肝组织内IL-1β和TNF-α的含量。说明Rg1抑制炎性细胞浸润, 降低炎性因子的含量, 减轻炎症反应。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Attenuation of hepatitis and liver fibrosis induced by Rg1 in BDL-induced liver fibrosis mice. a: Representative MPO staining results of BDL-induced mice treated with Rg1; b, c: Inhibitory effect of Rg1 on pro-inflammation cytokines levels, including IL-1β and TNF-α by Western blot. n=4-6, x± s. **P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 vs BDL-14d group. Scale bar=100 μm

肝纤维化的高发病率和高致死率给社会带来沉重的负担, 因而引发全世界广泛关注。然而, 目前临床上无有效的可治愈肝纤维化的药物, 开发有效治疗肝纤维化药物迫在眉睫。肝纤维化是肝硬化和肝癌早期的病理特征, 是由慢性肝损伤所引发^[19]。人参皂苷Rg1是一种具有广泛药理活性天然产物, 在体内外和临床研究中发现, Rg1对酒精性肝损伤^{[9, 10]}、药物性肝损伤^[11]、CCl₄诱导的肝损伤^[14]和肝衰竭都有护肝作用^[8]。但是Rg1在胆汁淤积性肝纤维化中的研究却很少见。在本文中, 通过BDL建立胆汁淤积性肝纤维化模型, 研究发现Rg1降低BDL诱导的慢性肝损伤中AST、ALT、TBA和T.Bili水平, 改善肝功能和缓解胆汁淤积现象, 可见Rg1预防BDL诱导的慢性肝损伤具有良好的效果。Rg1明显降低MPO阳性细胞数, 减少中性粒细胞浸润肝脏, 降低IL-1β和TNF-α的蛋白水平, 缓解炎症反应。同时, Rg1减少此模型小鼠肝脏中α-SMA的表达, 抑制HSC的活化, 从而缓解肝纤维化。深入研究发现, Rg1显著抑制BDL诱导的肝纤维化肝脏中VCAM-1的表达, 并抑制细胞核中NF-κB蛋白水平的升高, 因而Rg1可能通过抑制NF-κB/VCAM-1信号通路, 进而减少炎性细胞浸润肝脏, 缓解BDL诱导的肝纤维化。由于前期报道发现Rg1治疗肝损伤的有效剂量为10~160 mg·kg^{-1 [8, 9, 14]}, Rg1治疗缺血性脑损伤的有效剂量也在此范围^[21]。因而, 本文选用了40 mg·kg^-1剂量对胆汁淤积性肝纤维化进行实验。

前期研究表明, Rg1可改善化学性等外源性物质诱发的肝损伤和血清生化指标。其最主要是由于Rg1的抗氧化活性, 通过调控Keap1-Nrf2-ARE信号通路^{[8-11, 14]}。但是Rg1对BDL导致的胆汁淤积性肝纤维化的影响尚未见报道。BDL诱发的肝病可良好地模仿胆汁淤积性肝病。BDL引发胆汁排泄受阻, 严重造成肝内胆管血管损伤, 如胆管扩张、血管内溶血, 管壁通透性升高, 甚至导致肝纤维化和肝硬化^[22]。本文研究了Rg1对BDL诱导的肝纤维化的影响, 发现长期给予Rg1可以有效改善AST和ALT, 能有效地抵抗胆汁淤积诱发的肝损伤。

慢性炎症驱动肝纤维化的进程^[23]。因而抗炎治疗可有效地削弱这种驱动力, 并可预防或逆转肝炎和肝纤维化。Rg1可有效地增强机体免疫力和抗氧化能力。Rg1通过抑制NF-κB信号通路的激活及其下游TNF-α和IL-1β等炎性因子的表达, 发挥抗炎护肝作用^[9]。另外, Rg1能抵抗四氯化碳诱发的急慢性肝炎^{[7, 14]}。本研究显示, BDL诱导的肝纤维化中炎性因子水平升高, 而给予Rg1治疗后可下调损伤肝内TNF-α和IL-1β等炎性因子的表达, 这表明Rg1可减弱BDL诱导的胆汁淤积性肝损伤中炎症反应。VCAM-1是一种在免疫系统中具有重要作用的免疫球蛋白分子^[24]。其主要表达于内皮细胞在内的多种细胞上, 能够介导白细胞跨越内皮向炎症部位聚集^[25]。可溶性血管细胞黏附分子-1 (soluble vascular cell adhesion molecule-1, sVCAM-1)作为肝硬化的不同阶段检测的潜在标志物^[26]。VCAM-1可通过与α4β1结合促进淋巴细胞存活, 加剧慢性肝炎症状^[27]。另外, 特发性肺纤维化患者外周血中VCAM-1显著升高, 并且其参与了成纤维细胞增殖, 促进肺纤维化的进程^[28]。本文研究发现, Rg1可显著降低肝纤维化组织中VCAM-1的蛋白水平。BDL诱导的肝纤维化中中性粒细胞数目增加, 而给予40 mg·kg^-1 Rg1治疗后可有效地减少VCAM-1分泌, 降低中性粒细胞的浸润数目。另有报道显示, Rg1可显著减少受损脑区中性粒细胞数量^[29], 与本文结果一致。

本文利用胆汁淤积模型, 探讨了VCAM-1在肝纤维化过程中的表达变化规律及Rg1对其调控机制。BDL对小鼠肝功能的影响随着给予BDL时间的延长而加重, 在BDL-14d出现明显的纤维化。VCAM-1主要表达在肝组织坏死区的肝细胞、血管内皮细胞和胆管上皮细胞, VCAM-1在BDL-1d表达上调, 至BDL-7d达到高峰, BDL-14d表达有所下降, 与对照组相比仍有高表达。Marx等^{[21, 30]}研究表明抑制NF-κB易位可降低VCAM-1启动子活性, 减少白细胞黏附和抑制随后的跨内皮细胞迁移。为研究Rg1对VCAM-1的调控机制, 本研究检测了VCAM-1的上游NF-κB在细胞核内的含量变化情况。结果表明, Rg1治疗可明显降低核NF-κB蛋白水平。如图 6所示, Rg1可抑制NF-κB异位, 减弱VCAM-1启动活性, 抑制炎症反应, 从而减轻胆汁淤积性肝纤维化。然而Rg1如何调节NF-κB表达或异位活性, 以及其对肝纤维化的治疗效果及作用机制仍有待进一步研究。

Figure 6

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Figure 6 Schematic of Rg1 mechanism of preventing BDL-induced liver fibrosis through NF-κB signal pathway