阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是老年人中最常见的中枢神经系统退行性疾病, 全世界超过3 700万人罹患AD^[1]。阿尔茨海默病中β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)理论在过去的20年一直受到科学界的认可和关注, 不断开发出许多的药物来消除Aβ斑块, 抑制Aβ聚集和沉积, 或通过抑制γ-分泌酶和β-分泌酶来降低脑内Aβ的生成, 但这些治疗策略在临床试验中均以失败而告终^[2]。目前, 以拮抗tau蛋白磷酸化为靶点的药物研究越来越引起关注^[3-5]。

Tau蛋白是脑内一种微管相关蛋白, 其磷酸化受蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的调节维持平衡。蛋白磷酸酯酶2A (protein phosphatase 2A, PP2A)是促进tau蛋白去磷酸化的主要调节酶, 在抑制AD患者脑中tau蛋白过度磷酸化方面起关键作用, 研究发现, 在AD患者脑中PP2A活性明显下降^{[6, 7]}。研究PP2A激活剂成为目前AD药物研究的新策略^{[8, 9]}。

山茱萸环烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside, CIG)是我室从山茱萸中提取的主要有效部位。在前期研究中发现, CIG能够改善拟AD大鼠模型的学习记忆功能^{[10, 11]}, 并且在PP2A抑制剂冈田酸(okadaic acid, OA)拟AD细胞模型上能够抑制tau蛋白过度磷酸化, 保护微管结构, 减少细胞凋亡, 能够通过抑制PP2A催化亚基C (PP2Ac)的去甲基化而恢复PP2A的活性^{[12, 13]}。

有研究报告, PP2Ac的翻译后修饰除了甲基化以外, 还包括磷酸化^[14]。酪氨酸激酶Src的活化能够促进PP2Ac的磷酸化^[15]。本实验的目的是研究CIG对OA拟AD细胞模型PP2Ac磷酸化及其调节酶Src的影响, 以进一步明确CIG恢复PP2A活性的机制。

药物  CIG由本室自行研制。山茱萸为市售(产地:浙江), 经提取和分离获得CIG, 纯度为70% (其中主要成分为莫诺苷和马钱苷), 达到国家中药、天然药物5类新药的要求。CIG为棕黄色粉末, 水溶性好。实验中采用干粉剂量, 溶解于蒸馏水, 制成药液应用。

试剂  OA、aprotinin、leupeptin、多聚赖氨酸和Triton X-100 (美国Sigma-Aldrich公司); DMEM基础培养液、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(美国Gibco BRL公司); Opti-MEM (美国Invitrogen公司); RC-DC蛋白测定试剂盒(500-0122-MSDS, 美国Bio-Rad公司); PP2A活性测定试剂盒(美国Promega公司)。主要抗体详见表 1。

表1(Table 1)

Table 1 Primary antibodies used in this study. Poly-: Polyclonal; Mono-: Monoclonal; PP2Ac: Protein phosphatases 2A catalytic subunit C; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Antibody name Class Clone Action site Company pS 199/202 Poly- p-Tau Ser 199/202 Invitrogen pS 396 Poly- p-Tau Ser 396 Invitrogen Tau-5 Mono- Total tau Calbiochem p-PP2Ac Poly- p-PP2A Tyr 307 Santa cruz PP2Ac Poly- PP2A Santa cruz p-Src Poly- Tyr 416 Invitrogen Src Poly- Cell signaling GAPDH Mono- GAPDH ZSGB-BIO

Table 1 Primary antibodies used in this study. Poly-: Polyclonal; Mono-: Monoclonal; PP2Ac: Protein phosphatases 2A catalytic subunit C; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

主要仪器  二氧化碳培养箱(Tc2323型, 美国SHELL/JB公司); 全波长酶标仪(Multiskan Spectrum, 法国巴德斯公司); 低温高速台式离心机(Beckman 22R, 美国Beckman公司); 电泳仪、垂直型电泳槽、转膜仪和凝胶电泳分析系统(美国Bio-Rad公司)。

细胞培养  人神经母细胞瘤细胞株(SK-N-SH细胞)在5% CO₂、37 ℃培养箱内进行培养, 每2~3天更换1次培养基。细胞生长至60%~70%丰度时, 传代或用于实验。细胞接种于12孔、24孔或96孔培养板中, 备用。

细胞模型的制备及药物处理  将不同浓度CIG (50、100、200 μg·mL^-1)与SK-N-SH细胞预孵育24 h后弃去药液, 加入OA (20 nmol·L^-1)处理6 h后, 收集细胞并进行裂解。

Western blot法检测蛋白质表达  SDS-PAGE电泳分离蛋白, 溴酚蓝到达分离胶底部时, 结束电泳。安装湿转装置, 在转移槽的阴极铺2层滤纸, 小心将胶平铺于滤纸上, 并在胶上铺硝酸纤维素膜, 将剩余2层滤纸铺在膜的上方。接通电源, 设定100 V, 90 min。转膜后, 硝酸纤维素膜用Tris buffered saline with Tween 20 (TBST)轻轻漂洗, 然后置于5%脱脂奶粉封闭液中, 4 ℃过夜; 弃去封闭液, TBST洗膜1次。加入适当浓度的第一抗体(抗特异蛋白质的抗体, 表 1), 置于摇床上摇动, 室温下2 h; 倾去一抗, TBST洗膜3次。加入相应的二抗, 置于摇床上摇动, 室温下1 h; 弃去二抗, TBST洗膜3次。在暗室将荧光剂A液和B液等量混合, 立即加到膜上, 每张膜1 mL, 滚匀液体, 反应1 min, 然后吸去多余荧光剂, 采用化学发光仪进行图像采集及分析。

PP2A活性测定  按照PP2A活性测定试剂盒说明书进行操作。在含有40 mmol·L^-1 Tris-HCl (pH 8.5)、20 mmol·L^-1 β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol, β-ME)、0.2 mmol·L^-1 CaCl₂和15 mmol·L^-1 MgCl₂的缓冲液中, 用磷酸化酶b中和0.5 mmol·L^-1 [γ-32P] ATP和10 mg·L^-1磷酸化酶激酶, 经30 min孵育, 一部分被γ-32P ATP标记的、由磷酸化酶b转变的磷酸化酶a, 经Sephadex G-50柱层析出, 收集含γ-32P ATP标记的磷酸化酶a (标记率 > 70%), 作为PP2A底物, 根据PP2A催化的、γ-32P标记的磷酸化酶a所释放γ-32P的释放量, 判定PP2A的活性。反应总体积为20 μL, 含50 mmol·L^-1 Tris-HCl (pH 7.0)、10 mmol·L^-1 β-ME、0.1 mmol·L^-1 EDTA、7.5 mmol·L^-1 cafreine、7.5 mg·L^-1 [γ-32P]磷酸化酶a、0.06 g·L^-1细胞提取物和抑制因子-1 (PP-1的特异性抑制剂), 用20%三氯乙酸终止反应, 取7 μL反应混合物至层析纸上, 释放出γ-32P在5%三氯乙酸(0.2 mol·L^-1 NaCl溶解)层析液中通过上行色谱法与底物分离, 经Cerenkov闪烁液进行闪烁计数分析。

统计学方法  用SPSS16.0软件分析实验数据, 数据以均数±标准误(x± s)表示, 组间样本比较应用单因素方差分析(one-way ANOVA), 以P < 0.05为差异有显著统计学意义。用Origin 8将数据转换为图表。

OA是PP2A的特异性抑制剂。本实验将CIG与人神经母细胞瘤细胞株(SK-N-SH细胞)预孵育24 h后换液, 加入OA处理, 6 h后收集细胞, 应用Western blot法检测tau蛋白的磷酸化水平。结果显示, OA能够显著增高细胞内tau蛋白在Ser 199/Ser 202 (S 199/202)位点及Ser 396 (S 396)位点的磷酸化(P < 0.01); CIG (100和200 μg·mL^-1)能够明显降低模型细胞内tau蛋白在S 199/202位点及S 396位点的磷酸化水平(P < 0.01); CIG (100 μg·mL^-1)对正常细胞无明显影响(图 1)。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Effect of cornel iridoid glycoside (CIG) on tau hyper- phosphorylation in okadaic acid (OA)-induced cells, cells were exposed to OA for 6 h after incubation with CIG (50, 100, 200 μg·mL-1). A: The levels of tau phosphorylation at different sites were detected by Western blot. pS 199/202: Tau phosphorylation at Ser 199/Ser 202; pS 396: Tau phosphorylation at Ser 396; Tau 5: Total 5. B: Quantitative analysis of tau phosphorylation. n = 3, x± s. ##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs model group

采用试剂盒检测各组细胞内PP2A活性。结果显示, OA与SK-N-SH细胞孵育6 h后, 细胞内PP2A活性显著降低(P < 0.05); CIG (50和100 μg·mL^-1)预孵育24 h能够明显恢复OA模型细胞内PP2A活性(P < 0.05); CIG对正常对照细胞PP2A活性无影响(表 2)。

表2(Table 2)

Table 2 The effect of CIG on protein phosphatases 2A (PP2A) activity. The PP2A activity of control group was set as 100%. n = 3, x± s. #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs model group Group Relative activity of PP2A /% Control 100.00 ± 5.00 Control + CIG 100 μg·mL-1 94.52 ± 1.24 Model 78.09 ± 10.35# Model + CIG 50 μg·mL-1 104.30 ± 9.15*             100 μg·mL-1 98.90 ± 9.44*

Table 2 The effect of CIG on protein phosphatases 2A (PP2A) activity. The PP2A activity of control group was set as 100%. n = 3, x± s. #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs model group

PP2Ac在Tyr 307位点的磷酸化水平增高能降低PP2A的活性^[15-18]。为了明确CIG恢复PP2A活性的机制, 本实验采用Western blot方法检测磷酸化PP2Ac (p-PP2Ac)和总PP2Ac的表达。结果显示, SK-N-SH细胞经OA处理后, 细胞内PP2Ac在Tyr 307位点的磷酸化水平明显增高(P < 0.05); CIG (50和100 μg·mL^-1)预孵育24 h能显著降低模型细胞PP2Ac的磷酸化水平(P < 0.05, 图 2)。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 The effect of CIG on phosphorylation of PP2Ac in OA-induced cells, cells were exposed to OA for 6 h after the incubation with CIG (50, 100, 200 mg·mL-1). A: The levels of PP2Ac and phosphorylated PP2Ac (p-PP2Ac) at Tyr 307 site were detected by Western blot; B: Quantitative analysis of PP2Ac and p-PP2Ac. n = 3, x± s. #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs model group

酪氨酸激酶Src在Tyr 416位点的磷酸化能够使酶激活, 从而促进PP2Ac的磷酸化^[14]。为了进一步探讨CIG抑制PP2Ac磷酸化的作用机制, 本实验采用Western blot方法测定细胞内Src在Tyr 416位点的磷酸化(p-Src-tyr 416)及总Src的表达。结果显示, SK-N-SH细胞经OA处理后, Src在Tyr 416位点的磷酸化水平明显增高(P < 0.05); CIG (100和200 μg·mL^-1)预孵育24 h能够显著降低模型细胞Src在Tyr 416位点的磷酸化水平(P < 0.05, P < 0.01), 见图 3。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 The effect of CIG on phosphorylation of Src in OA-induced cells, cells were exposed to OA for 6 h after the incubation with CIG (50, 100, 200 mg·mL-1). A: The levels of Src and phosphorylated Src (p-Src) at Ser 416 site were detected by Western blot; B: Quantitative analysis of Src and p-Src. n = 3, x± s. #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model group

AD患者主要病理特征之一是在脑中出现大量由过度磷酸化tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结, 其含量与AD患者的痴呆严重程度密切相关^[19], 表明过度磷酸化的tau蛋白在AD的发病机制中起重要作用。正常微管相关蛋白tau主要分布于细胞轴突及树突中, 具有促进管蛋白聚集成微管和维持微管结构的功能^{[20, 21]}。本实验发现, CIG能够抑制OA诱导的tau蛋白过度磷酸化, 提示CIG可能通过保护微管而起到改善AD认知障碍的作用。

PP2A能够很大程度地使tau蛋白去磷酸化, 并能恢复tau蛋白促进微管组装的能力^{[22, 23]}。为了明确CIG拮抗tau蛋白过度磷酸化的机制, 本实验采用PP2A特异性抑制剂OA制备拟AD细胞模型^[24-26], 观察CIG对PP2A的影响。结果发现, CIG能够明显恢复OA模型细胞内PP2A的活性, 这可能是CIG拮抗tau蛋白异常过度磷酸化的重要机制。

PP2A由结构亚基A、调节亚基B及催化亚基C构成, C亚基独具PP2A的催化活性^[27]。PP2Ac翻译后修饰异常可造成PP2A活性下降, PP2Ac的翻译后修饰主要包括磷酸化和甲基化^[14]。作者前期研究发现, CIG能通过抑制PP2Ac的去甲基化而恢复PP2A的活性, 进而拮抗tau蛋白异常过度磷酸化^[13]。本实验通过研究CIG对PP2Ac的磷酸化影响进一步揭示CIG恢复PP2A活性的机制。有研究报告, PP2Ac在Tyr 307位点的磷酸化增高能够抑制PP2A的活性^[18]。AD脑中PP2Ac在Tyr 307位点的磷酸化明显增高, 且在皮层及海马的神经原纤维缠结中有大量磷酸化PP2Ac存在^[16], 提示PP2Ac的磷酸化和tau蛋白磷酸化与AD密切关系。本实验发现, OA诱导PP2Ac在Tyr 307位点的磷酸化水平增高, 而CIG能够抑制模型细胞内PP2Ac在Tyr 307位点的过度磷酸化, 这可能是CIG增高PP2A活性的另一机制。

Src是一种位于细胞质的非受体酪氨酸蛋白激酶, 是Src家族中的一员^{[17, 28, 29]}。Src在Tyr 416位点的磷酸化能够增加Src的活性, 从而促进PP2Ac的磷酸化^[15]。本实验结果显示, OA诱导Src在Tyr 416位点的磷酸化水平增高, 而CIG能够抑制模型细胞内Src在Tyr 416位点的过度磷酸化, 提示可能减低Src的活性, 这可能是CIG抑制PP2Ac磷酸化的机制。

综上所述, CIG能够抑制OA诱导的tau蛋白异常过度磷酸化; 其作用机制为CIG通过抑制Src在Tyr 416位点的磷酸化减低其活性而降低PP2Ac的磷酸化, 从而恢复PP2A活性, 促进tau蛋白的去磷酸化(图 4)。本研究进一步阐明了CIG拮抗tau蛋白过度磷酸化的作用机制, 也为研发有效治疗AD的药物提供了实验数据。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Schematic diagram of CIG inhibiting tau hyper-phosphorylation. PP2A consists of a dimeric core enzyme composed of the structure A and catalytic subunit C, and a regulatory subunit B