2018, Vol. 53
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种严重危害人类健康的常见病, 是冠心病、脑梗死和外周血管病等缺血性心脑血管病的主要病理基础[1]。迄今为止, AS的发病机制尚未完全阐明, 存在多种学说, 其中炎症学说是最受认可的学说之一。该学说认为各种危险因素造成的动脉内膜损伤是动脉粥样硬化的始动环节。在这一过程中, 活化的血管内皮细胞分泌一些黏附分子, 如血管细胞黏附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、细胞间黏附分子-1 (inter cellular adhesion molecule-1, ICAM-1)等。这些黏附分子介导了内皮细胞与白细胞、血小板间的起始黏附, 促进单核细胞在组织中的游走, 增加与细胞间的相互作用, 促使病损进一步发展, 最终形成动脉粥样硬化斑块[2-5]。
研究表明, 巨噬细胞参与了动脉粥样硬化病理进程中的多个重要环节。在AS起始过程中, 巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor)以及其他的分化因子驱使单核细胞分化成巨噬细胞; 而在AS发展进程中, 巨噬细胞促进斑块的形成、稀释纤维帽和坏死核心成分, 由此导致炎性应答的增加和斑块内白细胞等凋亡信号的增强。在AS病理进程中, 巨噬细胞膜表面蛋白发挥着重要作用。研究表明, 巨噬细胞表面已知的蛋白大概有1 000多种, 其中有458种是经基因本体注释(the gene ontology annotation)的膜蛋白, 包括CD11b、CD14、CD18、CD40、CD86、CD44和CD16等[6], 这些蛋白功能各异。如CD40可以通过与可溶性CD40配体结合, 调节多种细胞因子、趋化因子、黏附分子和生长因子等表达, 促进AS相关炎症、免疫反应, 诱导AS斑块发生进展, 增加斑块的易损性[7]; C-反应蛋白(C-reactive protein)可以促进VCAM-1、ICAM-1、E-选择素及单核细胞趋化蛋白(monocytes chemoattractant protein-1)表达, 促进炎症反应的发生, 是AS发展中的重要炎性标志物[8]。
近年来, 应用细胞膜包裹纳米粒这一仿生策略在多种疾病的靶向递药研究中取得较大进展[9, 10]。细胞膜包裹纳米粒是将细胞膜包覆在纳米颗粒表面所制备而成的一种新型药物递送载体和仿生纳米材料, 将细胞膜与纳米粒结合, 不仅能增加纳米粒的生物相容性, 还可以通过选择不同种类细胞的细胞膜, 如血细胞、干细胞或细菌细胞等, 使得纳米粒“穿衣”后获得原细胞的部分功能。文献[11-14]报道, 巨噬细胞膜包裹的仿生纳米递药系统, 已被用于构建靶向肺转移乳腺癌的仿生递药系统, 体现出用于病灶精准治疗的良好潜力。本研究拟设计一种以巨噬细胞膜包裹的纳米粒作为药物载体, 通过巨噬细胞膜上整合素a4β1与动脉粥样硬化血管黏附分子VCAM-1的特异性识别, 实现在动脉粥样硬化病灶部位的高度蓄积。
材料与方法药品与试剂 胰酶、DMEM、RPMI1640、胎牛血清(Gibco公司); 尼罗红(Nile)、DiR碘化物(DiR) (阿拉丁试剂有限公司); 四甲基噻唑蓝(MTT)、脂多糖(LPS) (Sigma公司); a4、β1、VCAM-1等一抗及相应的二抗(Proteintech公司); 血清总胆固醇(TC)检测试剂盒、甘油三酯(TG)检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司)。
细胞与动物 RAW264.7巨噬细胞(RAW264.7)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自中国科学院细胞库。ApoE-/-小鼠及C57BL/6小鼠, SPF级, 雄性, 6周龄, 北京华阜康生物科技股份有限公司提供, 生产许可证号: SCXK (京) 2014-0004。
主要仪器 激光粒度及zeta电位分析仪(Nano ZS, 英国马尔文公司); FEI Tecnai G20高分辨透射电镜(美国FEI公司); BLO-RAD MODEL 680酶标仪(北京成志科为生物科技有限公司); 荧光倒置显微镜(IX-73, 日本奥林巴斯公司); NovoCyte流式细胞仪(艾森生物有限公司); 小动物活体成像系统(IVIS lumina Ⅱ, 美国PerkinElmer公司); Nikon Eclipse E100正置光学显微镜(日本尼康公司)。
细胞培养 RAW264.7和HUVEC细胞培养于37 ℃、5% CO2中。RAW264.7用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养(含双抗), HUVEC细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养(含双抗)。取对数生长期的RAW264.7和HUVEC细胞进行实验, 96孔板和24孔板接种细胞数分别为1×104和5×104个/孔, 培养过夜。
巨噬细胞膜仿生纳米载体的制备与表征巨噬细胞膜的提取 参考Cao等[15]的制备方法。收集巨噬细胞, 加入4 ℃ TM buffer (pH 7.4, 0.01 mol·L-1 Tris和0.001 mol·L-1 MgCl2)重悬, 调整细胞数为每毫升2.5×107个, 用微型均质机来回挤压破碎细胞膜(20次), 加入适量1 mol·L-1蔗糖与细胞匀浆混合, 使蔗糖终浓度为0.25 mol·L-1。接着进行如下操作: ① 4 ℃, 2 000 ×g离心10 min, 取上清液; ② 4 ℃, 3 000 ×g离心30 min, 弃去上清液; ③加入4 ℃含0.25 mol·L-1蔗糖TM buffer重悬, 4 ℃, 3 000 ×g离心30 min, 弃去上清液。管底沉淀物即为巨噬细胞膜, 用BCA蛋白定量试剂盒测定细胞膜蛋白含量, -20 ℃保存。
纳米粒的制备 采用沉淀法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)空白纳米粒, 精密称定PLGA 10 mg, 丙酮1 mL溶解, 搅拌下逐滴注入纯水中, 继续搅拌2 h, 30 ℃减压旋转蒸发1 h至丙酮完全除去, 得到空白纳米粒(PLGANPs), 4 ℃保存。荧光素标记纳米粒的制备过程与空白纳米粒类似, 取上述溶解后的PLGA 1 mL, 精密吸取1 mg·mL-1相应的荧光素(Nile、DiR)溶液10 μL, 充分混匀后按照上述方法制备得到荧光素标记的纳米粒, 4 ℃保存[16]。
巨噬细胞膜仿生纳米载体的制备与表征 采用纳米膜挤压法[17], 将巨噬细胞膜用微型均质机反复挤压, 制成巨噬细胞膜囊泡。然后以0.28 mg蛋白含量的巨噬细胞膜囊泡与PLGANPs (1 mg·mL-1) 0.5 mL混合, 依次通过400、200 nm的聚碳酸酯(PC)滤膜反复挤压制成巨噬细胞膜纳米载体(MPLNPs)。用激光散射粒度仪测定纳米粒的粒径及其分散情况, 并用透射电镜(TEM)观察纳米粒的外观形态。
人脐静脉内皮细胞炎症损伤模型建立的条件摸索 取对数生长期的HUVEC细胞, 以每孔每毫升1×104个接种于96孔板, 每孔加入100 µL, 过夜贴壁; 吸出培养基, 加入无血清培养基饥饿12 h, 分别给予不同浓度LPS (终质量浓度为0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100和200 μg·mL-1), 每组3个复孔, 置于CO2培养箱中继续培养; 24 h后每孔加入MTT溶液(5 g·L-1) 20 μL, 4 h后每孔加入二甲基亚砜150 μL, 37 ℃振荡30 min后用酶标仪在490 nm波长处测定吸光度(A)值。
α4β1及VCAM-1蛋白表达检测 收集各组细胞, 加入细胞裂解液提取总蛋白。按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作, 测定蛋白浓度。分别取蛋白60 μg加入蛋白上样缓冲液, 煮沸10 min; 10%聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳后, 电转移至PVDF膜上, 5%脱脂奶粉封闭后依次加入一抗和二抗, 室温孵育2 h; TBST缓冲液洗涤5次, 每次10 min, 凝胶成像系统获取图像。
细胞摄取实验 将HUVEC细胞接种于24孔板中, 培养过夜后, 分别以包载荧光素Nile的PLGANPs、MPLNPs及blocked MPLNPs (即用特异性抗整联蛋白α4β1单克隆抗体封闭后的MPLNPs), 避光条件下加入各孔中, 每组8孔; 避光培养2 h后, 弃去培养基, PBS洗3次。同组实验中前4孔用4%多聚甲醛在37 ℃固定30 min, PBS洗3次, DAPI染色, PBS洗3次, 荧光倒置显微镜下观察; 后4孔用胰酶溶液消化后, 直接以流式细胞仪测定(Nile, 激发波长为488 nm, 发射波长为580 nm)。
动脉粥样硬化模型建立和评价 雄性SPF级ApoE-/-基因敲除小鼠及C57BL/6J小鼠, 分别给予高脂饲料(78%基础饲料+ 21%脂肪+ 1.25%胆固醇)喂养12周。取造模小鼠, 腹腔注射3%戊巴比妥钠(60 mg·kg-1)。待小鼠麻醉后将其放至冰袋上并解剖开胸腔, 从左心室快速取血0.8~1 mL, 迅速转移置EP管中, 4 ℃, 3 500 ×g离心15 min, 分离血浆, 4 ℃冰箱保存备用。用预冷的PB缓冲液及4%多聚甲醛充分灌流后(流速2 mL·min-1), 借助解剖显微镜、微型手术剪刀和镊子将胸主动脉取出(从心脏根部开始至双侧髂动脉分支处)。小鼠的全身灌注及主动脉剖离均在冰上操作。
小鼠胸主动脉血管横截面HE染色 将分离出的胸主动脉血管用OCT包埋剂(optimal cutting temperature compound, OCT)包埋并于冰冻切片机(-20 ℃)切片, 自主动脉根部起行横截面冰冻连续切片, 切片厚度为10 μm。将主动脉切片于室温放置30 min, 4%多聚甲醛固定5 min后, 蒸馏水冲洗, 将切片浸入Mayer苏木素染液染色5 min, 蒸馏水淋洗2次; 1%盐酸酒精分化数秒, 蒸馏水冲洗; 0.6%氨水返蓝, 蒸馏水冲洗; 伊红染液中染色1 min, 蒸馏水浸泡2~3 min; 之后将切片依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇I、无水乙醇Ⅱ各30 s脱水, 二甲苯I、二甲苯Ⅱ各2 min进行切片透明, 中性树胶封片。染色后的切片放置于NIKON显微镜下观察拍照。
小鼠血脂水平测定 取出4 ℃保存的血清, 用生化试剂盒测定血清中的总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)含量。
体内靶向性考察 将造模小鼠分为3组, 分别给予包载荧光探针DiR的PLGANPs、MPLNPs及blocked MPLNPs 100 μL。4 h后腹腔注射3%戊巴比妥钠(60 mg·kg-1)麻醉, 将胸主动脉取出, 用活体生物荧光成像技术检测制剂靶向性; 另取给予包载荧光探针Nile制剂的小鼠胸主动脉OCT包埋切片后进行免疫荧光共定位(IF)考察制剂靶向性。
免疫荧光共定位检测靶向性 将主动脉切片室温放置30 min, 4%多聚甲醛固定5 min后, PBS洗涤3次, 每次5 min; 3%牛血清白蛋白(BSA) 4 ℃封闭过夜, 依次加入一抗和二抗, 室温孵育2 h, PBS洗涤3次; 滴加DAPI, 染色5 min后, PBS洗涤3次; 滴加1滴荧光淬灭封片剂于盖玻片中央, 翻过载玻片放于盖玻片上, 将载玻片置工作台上, 用铝箔覆盖避光放置30 min, 使荧光淬灭封片剂凝结。显微镜下观察结果, 并采用Image-Pro Plus 6.0计算荧光强度值, 载玻片贮于-20 ℃。
统计学处理 数据用均数±标准差(x±s)表示, 采用SPSS 20.0软件进行统计分析, 以P < 0.01表示有显著性差异。
结果与讨论 1 巨噬细胞膜仿生纳米载体的制备与表征MPLNPs的制备过程分为以下3个步骤: ① PLGANPs的制备; ②巨噬细胞膜的提取; ③巨噬细胞膜包裹PLGANPs。可见PLGANPs (图 1A)和MPLNPs (图 1B)的平均粒径均小于150 nm, 多分散指数(PDI)值分别为0.128和0.149。表明本方法制得的纳米粒粒径大小适宜、分散性好。经透射电镜观察发现PLGANPs (图 1C)形态圆整、分布均匀; MPLNPs (图 1D)具有明显的核/壳蛋黄状结构, 与激光粒度仪检测结果一致。
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Figure 1 The characterization of nanoparticles (NPs). The particle size and distribution of polylactic acid-glycolic acid copolymer nanoparticle (PLGANPs) (A) and macrophage membrane-coated polylactic acid-glycolic acid copolymer nanoparticle (MPLNPs) (B) determined using Zetasizer Nano ZS. Transmission electron microscopy image of PLGANPs (C) and MPLNPs (D), macrophage membranes are marked by white arrows (bar = 50 nm) |
研究表明, 巨噬细胞可以通过膜上α4β1与VCAM-1结合。为了证实巨噬细胞膜和MPLNPs上保留着α4β1, 本文通过Western blot检测α4β1在巨噬细胞膜及MPLNPs上的表达情况。结果显示, PLGANPs上无明显蛋白表达(图 2A), 而巨噬细胞、巨噬细胞膜及MPLNPs上均表达了α4β1 (图 2B)。
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Figure 2 The protein expression of PLGANPs, MPLNPs, macrophage membranes and macrophage. A: Protein profiles in the PLGANPs, macrophage membrane, and MPLNPs determined by SDS-PAGE electrophoresis assay. B: Integrins α4β1 in macrophage, macrophage membrane, and MPLNPs determined by Western blot assay. The protein signals of β-actin were performed as a control |
HUVEC人脐静脉内皮细胞株是常用的血管内皮细胞模型, LPS诱导后其能高表达VCAM-1受体[18, 19]。本实验以LPS诱导建立人脐静脉内皮细胞损伤模型以模拟动脉粥样硬化血管损伤。MTT结果表明, 人脐静脉内皮细胞被LPS干预后, 细胞生长会受到明显抑制, 且该抑制作用存在浓度依赖性(图 3A)。优化条件后, 最终选定造模所用LPS质量浓度为25 µg·mL-1, 孵育时间为24 h。进一步通过Western blot表征发现, 未经LPS处理的内皮细胞无明显的VCAM-1表达, 而经不同浓度LPS孵育后, HUVEC上的VCAM-1表达水平显著升高并呈剂量依赖性(图 3B)。显微镜下观察可见:对照组HUVEC细胞呈梭形或不规则三角形, 大部分细胞贴壁生长, 核清晰, 有些细胞鱼贯状相连(图 3C); 而LPS处理组细胞形态有明显改变(图 3D), 胞体变圆、边缘不清、细胞发生皱缩。
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Figure 3 The characterization of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). A: The growth inhibition of lipopolysaccharide on HUVEC detected by MTT assay. B: Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in HUVEC determined by Western blot assay. Morphology of HUVEC before (C) and after (D) treatment by lipopolysaccharides (LPS, 25 µg·mL-1) (bar = 50 μm) |
本实验以LPS诱导人脐静脉内皮细胞损伤作为动脉粥样硬化血管损伤模型, 以其对递药系统的摄取情况初步评价载体的体外靶向性。除MPLNPs及PLGANPs组外, 还特别设置了阻断组(blocked MPLNPs)。分别经流式细胞术定量和荧光显微镜定性检测, 结果显示, LPS-HUVEC (图 4A)对MPLNPs的摄取显著高于PLGANPs (前者摄取量为后者的2.05倍), 这表明经巨噬细胞膜包裹制备得到的MPLNPs能有效介导靶细胞摄取, 而当MPLNPs中α4β1整联蛋白被相应抗体中和后(即blocked MPLNPs), 细胞摄取明显减少; 而正常HUVEC (图 4B)对MPLNPs、PLGANPs及blocked MPLNPs的摄取均无明显差异。上述结果初步证明, MPLNPs在体外具有较好的主动靶向性, 且该功能是基于α4β1整联蛋白与VCAM-1的特异性识别。
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Figure 4 Evaluation of in vitro targeting ability. A: Fluorescence images of NPs uptake by LPS-HUVEC cells (bar = 50 μm). B: Fluorescence images of NPs uptake by HUVEC cells (bar = 50 μm). Flow cytometric analysis of NPs uptake by LPS-HUVEC cells (C) and HUVEC cells (D) |
载脂蛋白E (apolipoprotein E, ApoE)是一种多态性蛋白, 参与脂蛋白的转化与代谢过程, 其基因可以调节许多生物学功能, 与动脉粥样硬化发生发展密切相关[20]。研究表明, ApoE-/-小鼠可在高脂饲料喂养下产生严重的高胆固醇血症, 并自发形成动脉粥样硬化斑块, 其斑块分布及病理特征与人类AS斑块极为相似, 是研究AS理想的动物模型[21]。本实验以ApoE-/-小鼠通过高脂饲料喂养建立动脉粥样硬化模型, 对其进行病理评价及制剂靶向性研究。结果显示:与正常组相比, 模型组血清TC、TG含量显著升高(P < 0.01) (表 1); 模型组小鼠的胸主动脉血管壁较正常组厚, 且模型组小鼠血管内皮增厚、大量泡沫细胞堆积、内皮细胞迁移和形成胆固醇结晶(图 5A), 表明AS模型构建成功。在此基础上进行体内活体成像(图 5B), 结果显示MPLNPs在动脉粥样硬化血管的蓄积程度明显高于PLGANPs和blocked MPLNPs; 进一步进行主动脉切片免疫荧光共定位(图 5C), 可见PLGANPs及blocked MPLNPs在病灶部位的荧光信号微弱, 而MPLNPs具有较强的红色荧光信号, 并与VCAM-1的绿色荧光较好地重叠; 通过对荧光强度进行定量分析(图 5D), MPLNPs的荧光强度为PLGANPs的5.07倍, 表明MPLNPs在病灶部位有效蓄积。
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Table 1 Results of the serum lipid profile in mouse models of atherosclerosis. TC: Total cholesterol; TG: Triglyceride; HDL-C: High-density lipoprotein cholesterol; LDL-C: Low-density lipo protein cholesterol.n = 3, x± s. **P < 0.01 vs control group |
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Figure 5 Evaluation of in vivo targeting ability. A: HE staining of the aorta cross-section. The vascular wall was marked by red circles. B: In vivo fluorescence imaging of NPs in the aorta from ApoE-/- mice treated by PLGANPs, blocked MPLNPs and MPLNPs (from left to right) at the indicated time points. Fluorescence imaging (C) and quantitative results (D) for monitoring the colocalization of VCAM-1 (green) and Nile red loaded NPs (red). The aorta cross-section was denoted as cell clusters with blue stained nuclei (bar = 100 μm). n = 3, x± s. **P < 0.01 vs PLGANPs |
本文基于巨噬细胞膜上α4β1整联蛋白与VCAM-1的高度亲和性, 设计并应用膜挤压法制备了一种具有靶向动脉粥样硬化病灶的核/壳纳米粒细胞膜仿生递药系统, 实验结果表明, MPLNPs对靶受体VCAM-1具有较强的亲和力, 能有效识别靶细胞及体内靶组织; 所用巨噬细胞膜不仅可以包裹聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒, 还有望包裹脂质体等其他递药系统, 而相应制剂可负载小分子、生物大分子药物及示踪探针等, 实现疾病的诊断及治疗, 为后续抗动脉粥样硬化研究奠定了良好基础。
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