2018, Vol. 53
2. 山西大学地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室, 山西 太原 030006;
3. 山西大学体育学院, 山西 太原 030006
2. Shanxi Key Laboratory of Active Constituents Research and Utilization of TCM, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
3. School of Physical Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
抑郁症为一种常见的情感性精神疾病, 具有高发病率、高复发率、高致残率等特点, 其临床主要表现为情绪低落、快感缺失、精力丧失, 世界卫生组织预言其将成为仅次于心脏病的第二大疾病负担[1, 2]。目前, 全世界至少有20%的人受到抑郁症的困扰, 其中男性约为7%~12%, 女性约为20%~25%[3]。在西方, 抑郁症的疾病负担预计到2030年将居于首位[4], 在我国, 抑郁症的发病率约为3%[5], 抑郁症的发生不仅降低了患者的生活质量, 同时给家庭和社会带来了的沉重的负担[2]。抑郁症治疗的药物仍以化学药物为主, 但是一些抗抑郁西药有毒副作用、依从性较差, 而中医药注重整体调节, 毒副作用较少, 对抑郁症的疗效越来越受到重视, 特别是具有疏肝解郁作用的中药柴胡及其复方(如逍遥散、丹栀逍遥散、小柴胡汤、柴胡舒肝散、柴胡加龙骨牡蛎汤等)在临床上广泛使用并取得了较好的效果[6]。
柴胡(Bupleuri radix)为伞形科植物柴胡(Bu pleurum chinense DC.)或狭叶柴胡(Bupleurum scor zonerifolium Willd.)的干燥根, 辛、苦, 微寒; 归肝、胆、肺经; 具有疏散退热、舒肝解郁、升举阳气等作用[7]。柴胡主要成分包括柴胡皂苷和黄酮类等。一般认为柴胡皂苷A和D为其抗抑郁的主要有效活性成分[8], 但其结构不稳定, 在煎煮或炮制的过程中易转化为柴胡皂苷B1、B2, 且仍具有较好的生理活性[9, 10]。柴胡中的黄酮类成分主要为黄酮醇, 如山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、异鼠李素(isor hamnetin)等, 文献报道均具有抗抑郁作用[8, 11-13]。此外, 本课题组前期从柴胡中分离得到的8个多炔化合物在体外单胺类神经递质再摄取抑制实验中, 表现出明显的抗抑郁活性[14-16]。
2007年Hopkins等提出了“网络药理学”的概念, 通过分析药物对疾病网络的干预, 构建“药物-靶点-疾病”网络, 为药物研发提供了新的策略[17, 18]。中药因其成分复杂、系统庞大而不易研究, 网络药理学则为复杂中药系统的研究提供了新的思路和视角[19]。Ding等[20]采用蛋白相互作用网络对肾小球病的关键细胞骨架组分进行了预测。Zhang等[21]通过网络药理学方法对乌头汤治疗类风湿关节炎的关键靶标进行了预测。Chen等[22]通过网络药理学方法对复方柴归方超临界CO2萃取组分抗抑郁作用机制进行了预测。Zhang等[23]通过DRAR-CPI结合文本挖掘对交泰丸抗抑郁作用靶点进行预测, 采用DAVID数据库进行生物功能和通路分析, 探讨了交泰丸的抗抑郁机制。网络药理学研究策略的整体性、系统性与中医学从整体、辨证论治的角度诊治疾病的理论以及中药及其复方的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理不谋而合[24]。
本文采用网络药理学方法从整体性的角度对柴胡的抗抑郁作用机制进行探讨, 为深入研究柴胡及含柴胡的中药复方的抗抑郁作用提供了参考依据。
材料与方法化学成分的获取与活性成分的筛选 从TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/, Version 2.3)中获取柴胡的化学成分。根据柴胡中的化合物含量、相关生物功能(抗抑郁作用)、研究热度并结合本实验室前期的研究基础, 通过大量文献挖掘与整理获取已报道的柴胡的抗抑郁活性成分。
活性成分作用靶点的获取 将上述柴胡活性成分在Chembiodraw Ultra 12.0软件中绘制出各自的结构图, 并以mol2格式存储。利用PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、TCMSP数据库、ChemicalBook (http://www.chemicalbook.com/)对其分子结构进一步确证。
DRAR-CPI (http://cpi.bio-x.cn/drar, update in 2017-7-26)为一种基于反向分子对接的服务器, 它可以将药物分子和蛋白的三维结构特征进行对接, 用基于蛋白-配体相互作用的亲合性打分函数进行打分并排序, 预测出药物的潜在作用靶点[25]。Z-score代表成分与蛋白相互作用的强度, 该服务器建议选取Z-score < -0.5为潜在靶点, 因此, 登陆DRAR-CPI服务器上传柴胡活性成分的mol2格式文件, 选取Z-score < -0.5为柴胡的潜在作用靶点。利用UniProt数据库的UniProt KB (http://www.uniprot.org/uniprot/, update in 2017-6-22)搜索功能, 导入柴胡蛋白靶点的PDB ID号, 限定物种为人, 经过检索和转化操作得到柴胡活性成分的基因靶点。
抑郁症相关作用靶点的筛选 通过在GeneCards数据库(http://www.genecards.org/, Version 4.5.0)和OMIM数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim, update in 2017-7-23)中输入关键词depression、depressive、depressed和antidepressant搜索已报道的、与抑郁症相关的基因, 去除重复基因和假阳性基因, 与上述作用靶点进行匹配, 得到柴胡活性成分抗抑郁的潜在作用靶点。
成分-作用靶点网络构建与分析 将柴胡的活性成分和抗抑郁作用靶点导入Cytoscape Version 3.4.0软件, 构建柴胡活性成分-作用靶点网络。
蛋白相互作用网络构建与分析 String数据库(https://string-db.org/, Version 10.5)[26]是一种包含已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用的数据库, 其中收集了大量的蛋白相互作用关系, 共涉及9 643 763个蛋白, 1 380 838 440个相互作用, 包括实验检测得到的和通过生物信息学方法预测得到的数据。将柴胡的蛋白靶点导入String数据库, 限定物种为人, 获取蛋白相互作用关系, 结果保存成TSV格式, 保留文件中node1、node2和Combined score信息并导入Cytoscape软件绘制相互作用网路, 并对网络进行分析(Cytoscape→Tools→Network analyzer→Network analysis→Analyze network), 保存网络分析结果, 使用Cytoscape中的Generate style from statistics工具(Cytoscape→Tools→Network analyzer→Network analysis→Generate style from statistics)将节点大小和颜色设置用于反映Degree的大小, 边的粗细设置用于反映Combine score的大小, 获得最终的蛋白相互作用网络。
分子对接 Systems Dock Web Site是一个基于网络药理学预测和分析的网络服务器, 可以用于说明配体如何作用于复杂的分子网络。它通过DocK-IN评分的分子对接功能评估蛋白质-配体结合潜力[27]。采用Systems Dock Web Site (http://systemsdock.unit.oist.jp, Version 2.0)对相互作用网络中Degree值靠前的5个分子与柴胡的活性成分进行分子对接验证。保存分子对接结果, 并对其Docking Score进行分析, 用以评价柴胡活性成分与靶点之间的结合活性。
生物过程与通路分析 生物学信息注释数据库(DAVID, https://david.ncifcrf.gov/, Version 6.8)为大规模的基因或蛋白提供系统综合的生物功能注释信息, 能够找出最显著富集的生物学注释[28]。将柴胡的作用靶点导入DAVID数据库, Select Identifier设置为OFFICIAL GENE SYMBOL, List Type设置为Gene List, 限定物种为人, 对柴胡作用靶点进行GO分析和KEGG通路分析, 保存结果。设定阈值P < 0.05, 并按照涉及的靶点数目多少进行排序, 筛选排名靠前的生物过程或通路, 用GraphPad Prism 5.0软件绘图。
作用靶点类型归属 DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu, Version 5.0)是包含与人类疾病相关的基因和变体的平台之一。在基因和疾病关系中, 该数据库一方面可以通过输入基因获取该基因相关的疾病信息, 另一方面还可以通过输入疾病获取与该疾病相关的基因信息。在DisGeNET数据库中选用基因进行检索, 将上述柴胡的作用靶点依次导入数据库中, 获取靶点类型信息(Protein Class)。
通路图绘制 利用UniProt数据库的UniProt KB搜索功能分别获取柴胡50个抗抑郁靶点的Uniprot ID。利用KEGG数据库(http://www.kegg.jp/) KEGG mapping中的KEGG Mapper工具, 将上述柴胡的UniProt ID导入, 限定物种为人, 获取柴胡抗抑郁作用的通路图, 筛选靠前的几条通路并进行整合绘制最终的通路图。
结果 1 柴胡活性成分的筛选TCMSP数据库获得柴胡化学成分349个, 经大量文献挖掘与整理, 根据柴胡各成分的含量、生物学功能、研究热度结合本实验室的研究筛选出具有抗抑郁作用的活性成分15个, 除了8个多炔类成分外, 其余在TCMSP数据库中均有收录。分别为山奈酚、异鼠李素、槲皮素、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B1、柴胡皂苷D、柴胡皂苷A及8个柴胡多炔, 详见表 1。
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Table 1 Main active ingredients in Bupleuri radix. D1: (2Z, 8Z, 10E)-Pentadeca-2, 8, 10-triene-4, 6-diyn-1-ol; D2: (2Z, 8E, 10E)-Pentadeca-2, 8, 10-triene-4, 6-diyn-1-ol; D3: (2Z, 8Z, 10E)-Heptadeca-2, 8, 10-triene-4, 6-diyn-1-ol; D4: Bupleurynol; D5: (2E, 8E, 10E)-Pentadeca-2, 8, 10-triene-4, 6-diyn-1-ol; D6: (2Z, 8E, 10E)-Pentadeca-2, 8, 10-triene-4, 6-diyn-1-yl acetate; D7: (2E, 8E, 10E)-Pentadeca-2, 8, 10-trien-4, 6-diyn-1-yl acetate; D8: (2E, 8E, 10E)-Heptadeca-2, 8, 10-trien-4, 6-diyn-1-ol |
柴胡的15个活性成分在DRAR-CPI服务器中Z-score < -0.5的靶点共有1 131个, 去除重复后得到265个靶点。通过向Uniprot数据库UniProt KB搜索功能中输入蛋白靶点的PDB ID, 共得到264个基因靶点。通过与GeneCards和OMIM数据库中与抑郁症相关的基因进行比对, 筛选出50个可能与柴胡治疗抑郁症相关的作用靶点, 详见表 2。
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Table 2 Information of potential antidepressant targets from Bupleuri radix |
将柴胡活性成分和作用靶点的信息导入Cytoscape软件构建活性成分-作用靶点网络, 详见图 1。图中共涉及65个节点, 561个边。不同颜色和形状的节点分别代表柴胡潜在活性成分和靶点, 蓝色矩形节点代表作用靶点, 绿色菱形节点代表柴胡的活性成分, 边代表活性成分和作用靶点间的相互关联。从图中可看出同一靶点可对应于不同的活性成分, 也可对应于相同的活性成分, 充分体现了柴胡多成分、多靶点的作用特点。
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Figure 1 Components-targets network of Bupleuri radix. The green diamond (  |
将上述作用靶蛋白导入String数据库, 限定物种为人, 获取蛋白相互作用关系, 保存其TSV格式文件, 导入Cytoscape软件绘制相互作用网络, 详见图 2。图中节点表示蛋白, 边表示蛋白之间的关联, 共涉及48个节点, 281个边(其中ADH1C未在数据库中找到, PPIB与其他蛋白没有相互作用, 这两个蛋白不在相互作用网络中体现)。节点的大小和颜色表示Degree值的大小, 节点越大, 颜色由绿变红对应的Degree值越大。边的粗细表示Combine score, 边越粗Combine score值越大。
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Figure 2 Protein interaction network of Bupleuri radix. The size and the color of the node represents the value of the Degree, the thickness of the side indicates the value of the Combine score |
上述相互作用网络中Degree表示某个蛋白具有相互作用的蛋白的数目。一般而言, 在一个网络中, 只有少数的节点具有很高的Degree, 这些节点为“中枢节点”, 在整个网络中占据重要的地位。也就是说, 在蛋白相互作用网络中筛选出的Degree排名靠前的靶蛋白在柴胡抗抑郁过程中发挥着重要的作用。对上述Degree数值排名前5位的重要靶点(表 3)进行分子对接验证。将其PDB ID号导入Systems Dock Web Site分子对接软件并与柴胡的15个成分进行对接, 对接结果详见表 4。分子对接结果显示, Docking Score值大于7.0的有2个(3.3%), 介于7.0~5.0之间的有18个(30%), 介于5.0~4.25之间的有28个(46.7%), 小于4.25的有12个(20%)。一般认为Docking Score值在4.25以上时表示分子与靶点之间有一定的结合活性, 大于5.0表明分子与靶点有较好的结合活性, 大于7.0则说明具有强烈的结合活性[29]。分子对接结果表明, 柴胡15个活性成分与重要靶点的结合活性较好。
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Table 3 Five important targets with big Degree of Bupleuri radix |
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Table 4 Molecular docking of five important targets from Bupleuri radix |
使用DAVID数据库对柴胡活性成分对应靶点进行GO和KEGG分析, 设定阈值P < 0.05, 并筛选靠前的生物过程或通路, 用GraphPad Prism 5.0绘图, 详见图 3~6。
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Figure 3 Enriched gene ontology terms for biological process (BP) of potential antidepressant targets from main active ingre dients of Bupleuri radix |
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Figure 4 Enriched gene ontology terms for cellular component (CC) of potential antidepressant targets from main active ingre dients of Bupleuri radix |
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Figure 5 Enriched gene ontology terms for molecular function (MF) of potential antidepressant targets from main active ingre dients of Bupleuri radix |
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Figure 6 Enriched KEGG pathways of potential antidepressant targets from main active ingredients of Bupleuri radix |
GO富集分析指在某一功能层次上统计蛋白或者基因的数目组成的一个有向无环图, 包括生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞组分(cellular component, CC) 3个分支。其中, BP分析(图 3)中排名靠前的有single-organism process (50个靶点/100%)、metabolic process (50个靶点/100%)、organic substance metabolic process (50个靶点/100%)、primary metabolic process (45个靶点/90%)、biological regulation (45个靶点/90%)。CC分析(图 4)中排名靠前的有cell (50个靶点/100%)、cell part (50个靶点/100%)、intracellular (49个靶点/98%)、intracellular part (49个靶点/98%)。MF分析(图 5)中排名靠前的有protein binding (44个靶点/88%)、catalytic activity (36个靶点/72%)、heterocyclic compound binding (28个靶点/56%)。通路分析结果如图 6所示, 柴胡抗抑郁的靶点主要涉及PI3K-AKT (11个靶点/22%)、MAPK (11个靶点/22%)、Rap1 (11个靶点/22%)、Ras (10个靶点/20%)、FoxO (8个靶点/16%)、neurotrophin (8个靶点/16%)等信号通路。
7 作用靶点类型归属将柴胡的50个作用靶点依次导入DisGeNET数据库, 获取靶点对应的类型, 详见表 5。结果表明柴胡抗抑郁过程中有信号分子、转录因子、受体、蛋白(转运蛋白、载体蛋白、钙结合蛋白等)、酶(氧化还原酶、激酶、磷酸酶、水解酶等)等物质的参与。
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Table 5 The protein class of potential antidepressant targets from main active ingredients of Bupleuri radix |
利用KEGG Mapper工具获取柴胡抗抑郁作用的通路图, 筛选靠前的几条通路并进行整合绘制最终的通路图(图 7)。图中箭头表示促进作用, T-箭头表示抑制作用, 不同颜色箭头表示不同的通路。通路靶点标记为浅蓝色, 柴胡抗抑郁靶点标记为深蓝色。图中显示出了PI3K-AKT、MAPK、Rap1、Ras、FoxO和neurotrophin信号通路, 涉及19个柴胡的抗抑郁靶点(占柴胡抗抑郁靶点的38%)。提示柴胡抗抑郁靶点分散于这几条通路中, 通过调节其中的几个环节发挥作用, 绝大多数靶点在多条通路中发挥作用, 如Ras、B-Raf、AKT和ABL等。
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Figure 7 Antidepressant pathways of potential antidepressant targets from main active ingredients of Bupleuri radix |
柴胡具有疏肝解郁作用, 是治疗郁证的要药, 以其为主要药物的复方在抑郁症治疗中占了绝大比例, 因此, 柴胡的抗抑郁机制的研究具有重要意义。
柴胡中的山奈酚、异鼠李素、槲皮素、柴胡皂苷D、柴胡皂苷A及8个多炔成分均为已报道的具有抗抑郁作用的活性成分。其中柴胡皂苷D和A不稳定, 容易转化成柴胡皂苷B1、B2。Liu等[30]研究表明, 柴胡饮片经水煎煮后柴胡皂苷B2大幅度增加, 柴胡皂苷A和D逐渐减少, 本实验室[31]前期研究表明柴胡醋制后皂苷A和D的含量下降, B1和B2的含量升高, 醋制后保肝作用优于生品, 肝肾毒性略低于生品, 提示可能是B1、B2发挥了作用, 因此, 在本研究中将柴胡皂苷B1、B2考虑在内。网络分析结果显示柴胡皂苷B1、B2连接的靶点数目分别为13、10, 且与重要靶点的分子对接结果均大于5, 提示柴胡皂苷B1、B2可能具有抗抑郁作用。
成分靶点网络显示了柴胡多成分、多靶点的抗抑郁作用特点。蛋白相互作用网络结果显示柴胡靶蛋白间存在着相互关系, 是一个复杂交互的网络而并非单独起作用。分子对接结果显示15个成分与重要靶蛋白之间存在较好的结合活性, 为后续的网络分析奠定了好的基础。
靶点GO分析和靶点归属分析结果表明, 柴胡治疗抑郁症涉及细胞过程、代谢过程和对应激的应答等生物过程, 涉及细胞器、细胞膜和细胞质等细胞组分, 涉及小分子、阳离子、金属离子等分子, 有信号分子、转录因子、受体、蛋白和酶等多种物质的参与, 是一个复杂的过程。靶点通路分析结果显示, 柴胡抗抑郁的靶点主要涉及PI3K-AKT、MAPK、Rap1、Ras、FoxO和neurotrophin等信号通路。
神经营养因子(NTF)是一类由神经支配的组织和星形胶质细胞产生的对中枢和外周神经系统均有营养活性的蛋白, 在抑郁症的发病中也发挥了重要作用, 其中BDNF的研究较多[32]。通路图中显示, 柴胡通过影响神经营养因子(BDNF、NGF和NT3/4)的受体发挥作用。
PI3K-AKT信号通路广泛存在于细胞中, 是介导多种生长因子促存活的重要通路[33], 该通路在抑郁症的发生中, 为一个连接神经递质和抑郁症状的重要纽带。通路图中显示PI3K-AKT通路与Rap1、Ras、FoxO、neurotrophin通路均有关联, 提示该通路在柴胡发挥抗抑郁过程中发挥纽带作用。MAPK信号转
导通路存在于大多数细胞内, 在细胞增殖、分化、转化及凋亡等过程中具有重要的作用[34], 其中ERKl/2通路与抑郁症关系最为密切。在通路图中已显示柴胡对ERK的作用。Ras基因编码一种膜结合型的GTP/GDP结合蛋白, 在进化中相当保守, 广泛存在于各种真核生物, 具有重要的生理功能。Ras相关信号通路功能异常与抗抑郁治疗、抑郁状态、神经可塑性及神经营养因子均有很强的相关性, 在细胞内信号通路调节中起着至关重要的作用[35]。Rap属于Ras家族, 含有Rap1和Rap2两个亚类。通路图中显示, Ras和Rap1通路与PI3K-AKT、MAPK、FoxO、neurotrophin信号通路均有关联。提示Ras和Rap1通路在柴胡抗抑郁过程中发挥纽带作用。FoxO家族是Fox基因家族中的一个亚族, 为细胞核内一种转录因子, 参与调节细胞增殖、分化和凋亡等过程[36]。5-羟色胺可通过影响FoxO3a的活化调节应激状态[37], FoxO3a基因缺陷型小鼠表现出抑郁样行为[38], 表明FoxO3a与抑郁症有紧密关联。靶点通路分析图中显示, 柴胡可作用于FoxO相关的受体/蛋白发挥作用。
综上所述, 网络药理结果显示柴胡的15个活性成分作用于50个靶点, 涉及多种过程、分子和通路, 体现了柴胡多成分-多靶点-多途径的作用特点, 上述结果与文献报道基本一致。本文通过蛋白相互作用网络预测了柴胡抗抑郁作用的5个重要靶蛋白, 并对其进行了分子对接验证, 一方面从某种程度上验证了DRAR-CPI预测靶点的可靠性, 另一方面为后续进一步验证奠定了基础。此外, 本文还对作用靶点的位置进行了归属, 并绘制通路图, 提示PI3K-AKT信号通路、Ras和Rap1通路的枢纽作用, 对柴胡抗抑郁的机制进一步研究提供了方向, 相关的靶点验证实验正在进行中。
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