2018, Vol. 53
急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是以胰腺间质水肿、出血、腺泡细胞空泡变性、坏死及炎症细胞浸润为病理特征的急性炎症性疾病。AP常伴有局部或全身性炎症反应, 约20%发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP), 死亡率高达40%以上。因此, SAP是常见的严重威胁人类健康的重大疾病之一[1-3]。急性胰腺炎相关性肺损伤是SAP最为严重的全身并发症。迄今为止, AP及相关性肺损伤的病理生理机制及影响SAP发生发展的因素尚不清楚。有文献[4, 5]报道胰腺实质中活化的单核巨噬细胞、多核粒细胞释放肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和白细胞介素-6 (IL-6)等多种促炎细胞因子而引发急性胰腺炎局部炎症的形成并引起全身炎症反应, 而全身促炎细胞因子的过度表达又加重了急性胰腺炎的严重程度。
文献[6, 7]报道纳米制剂可以显著提高胰腺炎治疗药物的药效。但是, 血胰屏障的存在导致治疗效果差强人意。近年来, 细胞膜仿生纳米粒作为新型递药系统引起了研究者的广泛关注。红细胞膜纳米粒、血小板膜纳米粒、肿瘤细胞膜纳米粒及白细胞膜纳米粒等被广泛用于小分子药物、疫苗及大分子药物的靶向递送[8-11]。细胞膜仿生纳米粒因继承了细胞膜上的特异性受体或膜蛋白可用于实现特异性靶向递送, 并在肿瘤等疾病模型上显示出较好的治疗效果[10, 12-15]。
巨噬细胞属免疫细胞, 是参与炎症反应的重要细胞之一。巨噬细胞在脊椎动物体内参与非特异性和特异性防卫, 主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行吞噬及消化, 并激活淋巴细胞或其他免疫细胞, 令其对病原体作出反应[16-20]。在病理生理过程中巨噬细胞起着极为重要的作用, 可以向肺组织迁移并释放多种细胞因子如TNF-α、白细胞介素-8 (IL-8)、IL-6和白细胞介素-1 (IL-1)等; 反过来, 这些细胞因子又可趋化中性粒细胞、T细胞和嗜酸性粒细胞等迁移[16, 18]。因此, 若能有效抑制细胞和炎症因子的释放, 则可以有效改善炎症。巨噬细胞膜包裹纳米粒的研究已有文献[10]报道, 但主要用于抗肿瘤治疗的研究。本文首次提出利用巨噬细胞膜修饰PEG-PLGA纳米粒用于炎症靶向治疗的研究。
本研究通过提取小鼠单核巨噬细胞的细胞膜, 挤膜法制备细胞膜包裹的PEG-PLGA纳米粒(RNPs), 进一步构建SAP大鼠模型, 以雷公藤红素(CLT)为模型药物对该载药RNPs的体内靶向性和药效进行了初步考察。
材料与方法试剂和药品 磷酸盐缓冲液(PBS)、RPMI-1640培养基(美国Hyclone公司); 胰蛋白酶溶液、注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素(北京索莱宝生物科技有限公司); 标准胎牛血清(FBS, 上海复蒙生物制品有限责任公司); 牛磺胆酸钠(美国Sigma-Aldrich公司); 大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒、大鼠IL-6 ELISA检测试剂盒(美国R & D公司); MPO测定试剂盒、淀粉酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。其余试剂均为分析纯。
仪器 Zeta Sizer-NanoZS90激光散射粒径分析仪(英国Malvern公司); PEG-PLGA (1:50:50, MW 45 000~75 000, 成都电子科技大学); 脱氧胆酸钠(SDC, 美国Amresco公司); 聚乙二醇硬脂酸脂15 (Solutol HS15, 德国BASF公司); 脂质体挤出仪(美国Avanti Polar Lipids公司); 微量移液器(法国Gilson公司); 涡旋振荡器(德国IKA公司); 电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗器械厂); LDZX-50KB立式压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂); 化学发光仪Varioskan Flash instrument (美国Thermo Scientific公司); 3K15-通用台式冷冻离心机(德国Sigma Aborzentrifugen公司)。
细胞 小鼠巨噬细胞系RAW264.7 (中国科学院上海细胞生物研究所), 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下连续培养, 隔天换液。
动物 Wistar大鼠, 雄性, 重量190~220 g, 购自四川大学华西医学中心实验动物中心。饲养条件:温度(25±2) ℃, 采用标准饲料喂养, 自由饮水及进食。动物实验依据四川大学关于实验动物的饲养和使用准则进行。
巨噬细胞细胞膜的提取 用2 mmol·L-1 EDTA消化培养皿中的RAW264.7, 重旋于PBS中, 2 000 r·min-1离心3 min, 除去上清液, 用配好的Tris低渗溶液重复吹打, 20 000 r·min-1离心2 min, 再用加了蔗糖的低渗溶液重复吹散, 6 000×g离心15 min, 重复2次。探头超声打碎细胞, 6 000×g离心15 min得到的沉淀即是细胞膜。
载药细胞膜纳米粒的制备 将脱氧胆酸钠(SDC) 20 mg和Solutol HS15 (HS15) 20 mg溶于适量水中, 超声溶解; 将模型药物雷公藤红素(CLT)或近红外荧光探针(Did)与PEG-PLGA 20 mg溶于适量氯仿, 超声溶解; 将有机相迅速加入水相, 冰水浴条件下探头超声形成初乳。初乳于40 ℃水浴减压旋转蒸发, 除去有机溶剂, 即得PEG-PLGA纳米粒。将提取的细胞膜通过挤膜器(400 nm), 大概20次后将均匀的细胞膜与纳米粒混合通过挤膜器, 挤膜20次后离心, 即得比较均匀的细胞膜纳米粒。
大鼠SAP模型 参照Aho的方法[21-23], Wistar大鼠经1%戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后, 将其固定于手术板上。常规消毒, 取腹正中切口进腹。切口长约3~5 cm, 暴露胃, 提起胃可看见胰腺及十二指肠, 寻找到胰胆管, 在近肝门处用无损伤动脉夹夹闭胆总管, 用自制的胰岛素针头(针头平面向上), 沿十二指肠乳头逆行穿刺入胆胰管, 并向前推进3~5 mm, 用手夹紧针头。以0.2 mL·min-1匀速向胰胆管内推注3%牛磺胆酸钠0.1 mL/100 g, 约3~5 min后见胰腺组织出血、坏死, 表明SAP模型制作成功, 然后退出针头, 连续缝合关闭腹腔, 并开始计时。动物实验均分为生理盐水组、溶液组、NPs组和RNPs, 荧光素Did的给药剂量是75 mg·kg-1, CLT给药剂量为1 mg·kg-1。均在模型建立后立即给药。
标本采集 各实验组(生理盐水组、原料药组、NPs组和RNPs组)于术后各时间点麻醉后经原切口进腹, 观察胰腺炎症, 分别采集血液标本和组织标本。大鼠处死前经心脏采血3~4 mL, 置于空白试管中, 室温凝固后以3 000 r·min-1离心15 min, 取上层血清置EP管中于-20 ℃保存, 供血清淀粉酶、TNF-α和IL-6测定。大鼠处死后快速切取胰腺和肺组织, 一部分置于液氮中, 于-80 ℃保存备用, 用于组织髓过氧化物酶检测; 另一部分置于4%多聚甲醛固定液中固定, 用于病理学和免疫组化评价。
血清淀粉酶(AMS)含量的测定——碘淀粉比色法 淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精, 在底物浓度已知且过量的情况下, 加入碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物, 根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量, 从而计算出AMS的活力。100 mL血清中AMS, 在37 ℃与底物作用30 min, 水解10 mg淀粉为1个单位。
腹水积液质量的测定 干纱布称量后, 用其蘸干胸腔和腹腔, 再称湿纱布重量。腹水和胸腔积液量(g) =湿纱布重量-干纱布重量。
血清中TNF-α和IL-6测定 均采用双抗体夹心ELISA法检测, 具体操作按照试剂盒说明进行。
组织中髓过氧化物酶(MPO)的测定 胰腺和肺组织MPO活性测定按照试剂盒说明书进行, 应用Beckman DU640型分光光度仪检测。
HE染色 在不同的实验天数处死大鼠, 取胰腺和肺组织块放入预先准备好的10%中性福尔马林固定液中, 固定24 h后使组织的蛋白质变性凝固。HE染色, 组织显微镜下观察。
数据分析 采用Origin 8.5软件进行统计学分析。计量数据用x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA), 组间均数差异采用Student’s t-test进行检验。
结果 1 RNPs的制剂表征取制备的NPs和RNPs用纯水稀释50倍, 于25 ℃下用激光散射粒径分析仪测定, 重复测定3次, 记录粒径均值和zeta电位均值。粒径分布以多分散性指数(PDI)值表示。如表 1所示, 未包膜纳米粒NPs和包膜纳米粒RNPs粒径分别在138.8和178.3 nm左右, zeta电位发生显著变化, 从-23.6 mV上升至接近细胞膜电位的-10.2 mV, 此结果表明细胞膜纳米粒成功制备。此外, 载药纳米粒的包封率在80%以上, 且粒径和电荷均未见明显变化。
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Table 1 Size, polydispersity index (PDI) and zeta potential of nanoparticles (NPs), membrane, and macrophage membrane coated PEG-PLGA NPs (RNPs). n = 3, x±s |
根据前述方法成功建立SAP大鼠模型, 以近红外荧光探针Did为模型化合物考察包膜纳米粒在炎症大鼠模型中的体内分布特征。Did是一种应用很广的近红外探针(λex = 634 nm, λem = 648 nm), 由于它的脂溶性很强, 所以不会发生泄漏, 常常被用于纳米载体的表征[24]。给药分为Did溶液组、NPs/Did组和NNPs/Did组。于造模1和3 h后分别处死大鼠, 取胰腺组织, 在活体成像仪上观察并对荧光强度进行半定量(图 1)。如图 1所示, 在1和3 h时, Did溶液组在胰腺组织几乎无分布, 普通纳米粒NPs/Did在炎症胰腺组织有分布, 而修饰细胞膜后NNPs/Did组在炎症胰腺组织的分布最多; 半定量结果显示NNPs/Did在胰腺组织的聚集量较Did溶液和NPs/Did组显著增加(P＜0.05)。
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Figure 1 Biodistribution in the pancreas of severe acute pancreatitis (SAP) rats in 1 h and 3 h (A). Semiquantitative analysis of fluorescence intensity of pancreas (B). n = 3, x±s. *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs Did; &P < 0.05 vs NPs/Did |
根据上述实验方法采集标本, 主要考察了以下药效指标:血清淀粉酶、腹水重量、TNF-α、IL-6、胰腺MPO、肺MPO及胰腺干湿比。
据文献[25]报道AMS、腹水、干湿比、MPO、TNF-α及IL-6是评价SAP的几个重要指标, 在患病后会发生显著变化。如图 2所示, 模型组与正常大鼠相比, 各指标均显著升高(P＜0.05), 说明大鼠SAP模型造模成功。其次, CLT组相对于模型组明显改善了肝、肺MPO的含量(P＜0.05), 普通纳米粒组相对于溶液组改善了胰腺干湿比、胰腺MPO及血清中TNF-α、IL-6的含量。RNPs相对于普通纳米粒组均改善了以上几种指标的含量(P＜0.05)。由此可见, ① CLT溶液具备一定抗炎作用[26-29]; ②与CLT溶液比较, 载CLT的普通纳米粒NPs/CLT有进一步降低各指标水平的趋势, 如显著降低胰腺干湿比、胰腺MPO和TNF-α水平(P＜0.05); ③在普通纳米粒表面包裹巨噬细胞膜后, 包膜纳米粒RNPs/CLT可以进一步提高CLT对SAP的疗效, 上述各项指标与NPs/CLT组比较均显著降低(P＜0.05)。
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Figure 2 The therapeutic effect of celastrol (CLT), NPs/CLT, and RNPs/CLT on local and systemic inflammation in SAP rats. The serum amylase (AMS) concentrations (A), the weight of ascites (B), the pancreas wet/dry ratio (C), myeloperoxidase (MPO) activity (D), TNF-α (E), lung MPO activity (F), and IL-6 (G) in pancreas or lung was greatly downregulated after various CLT-based treatments. n = 5, x±s. *P < 0.05 vs model; #P < 0.05 vs CLT; &P < 0.05 vs NPs/CLT |
如图 3所示, 胰腺HE染色结果显示模型组和CLT组胰腺间质明显增宽水肿, 炎症细胞浸润明显, 胰腺小叶结构破坏, 有出血和大片坏死; RNPs/CLT组胰腺水肿明显减轻, 炎症细胞浸润较少, 小叶散在性少量出血, 散在腺泡灶性坏死。表明RNPs/CLT处理可有效降低牛磺胆酸钠诱导的大鼠胰腺组织损伤。
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Figure 3 Morphological analysis of pancreatic and lung tissues in each treatment group by hematoxylin-eosin staining. Scale bar = 100 μm |
同时, 肺组织HE染色结果显示正常组肺组织结构清晰, 肺泡大小正常, 肺泡壁完整, 肺间质无明显渗出与出血, 无炎症细胞浸润; 模型组和CLT溶液组大鼠肺组织充血水肿并明显实变, 大量炎症细胞浸润, 肺泡结构破坏, 微血栓形成; RNPs/CLT组预处理后大鼠肺组织间质水肿、出血及炎症细胞浸润等病理变化较模型组和CLT组明显减轻, 肺泡结构基本完整。表明RNPs/CLT预处理可有效降低牛磺胆酸钠诱导的大鼠肺组织损伤。
讨论本研究成功构建了小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞膜包裹的PEG-PLGA纳米递药系统。SAP大鼠模型的体内分布研究表明RNPs可显著提高了药物在炎性胰腺组织中的分布量。以CLT作为模型药物, 体内药效学研究初步表明RNPs/CLT可显著提高CLT对SAP的治疗效果。这可能与细胞膜表面的一些膜蛋白和受体有关, 机制尚待进一步研究。综上, 巨噬细胞膜包裹PEG-PLGA纳米粒的递药策略既保存了纳米粒低毒、长循环等优点, 又赋予纳米粒特异性的炎症靶向特性, 且本研究为利用雷公藤红素治疗SAP提供了重要参考, 在胰腺炎或其他炎症的治疗过程中有很好的前景。
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