黄原胶(xanthan gum, XG)是经发酵产生的微生物胞外杂多糖。其基本结构为重复的五碳糖单位, 由主链与侧链组成, 主链为由D-葡萄糖以1-4糖苷键连接成的类纤维素结构, 侧链为由α-甘露糖、β-甘露糖和β-葡糖醛酸组成的三糖单位, 侧链反向缠绕主链形成双螺旋的二级结构, 再由二级结构形成网状的三级结构^[1] (图 1)。XG的独特结构赋予了其自身独特的性质——高稳定性(耐高温、耐高盐、耐酸和耐碱)、良好的水溶性、假塑流变性(黏弹性)和安全性等^[2]。由于XG与玻璃酸钠(sodium hyaluronate, SH)都属于多糖类药物, 性质相近, 黏弹性高, 关节腔注射XG也可起到润滑和缓冲作用, 降低组织间摩擦。而且XG侧链反相缠绕主链进而保护主链的特殊结构决定其主链不易被破坏, XG的稳定性更好, 在关节腔存留时间更长, 可减少给药次数。因此, XG有可能成为治疗关节炎(osteoarthritis, OA)新药。本研究拟通过前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction, ACLT)建立OA模型, 并给予XG干预, 评价XG对OA模型中软骨损伤的保护作用, 并探讨XG对OA软骨中caspase-3和Bax表达的影响。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 The chemical structure of xanthan gum (XG)

动物  健康新西兰大耳白兔70只, 普通级, 检疫合格后挑选60只用于本实验, 6~8月龄, 均为雄性, 体重2.5~2.8 kg, 由锦州医科大学动物实验中心提供, 合格证号: JZMU20160604。实验过程经锦州医科大学伦理委员会评定批准。单笼饲养。饲养条件:温度16~26 ℃, 日温差≤4 ℃; 湿度: 40%~70%;换气次数:每小时≥8次; 照明时间:昼夜明暗交替时间12 h/12 h。

药品与试剂  黄原胶粉末(山东省药学科学院); 玻璃酸钠粉末(山东福瑞达医药集团); 鼠抗兔Bax单克隆抗体、鼠抗兔caspase-3单克隆抗体、兔抗鼠二抗、反应停止液、苯甲基磺酰氟、四氮唑蓝(美国Cell Signaling Technology公司); BCA总蛋白测定试剂盒(武汉博士德生物工程公司); 无水乙醇等其他试剂(国产分析纯)。

实验仪器  -80 ℃冰箱(日本三洋公司); XSP-4C显微镜(上海彼爱姆光学仪器有限公司); 电泳仪、转膜机、湿式电转移槽凝胶成像仪、显色仪(美国Bio Rad公司); 酶标仪(美国Thereto公司); 微量移液器(Thermosystems公司)。

OA模型制备与药物治疗  参考文献^[3], 将60只兔按随机数字表法分为6组[正常对照组(control)、模型组(model)、XG-0.6 mg·kg^-1、XG-1.2 mg·kg^-1、XG-2.4 mg·kg^-1治疗组和SH-1.2 mg·kg^-1治疗组], 每组10只, 随机选取1组为control, 剩余5组右膝采用ACLT建立OA模型。于实验前1天, 对所有家兔进行剔除膝关节毛发并消毒备皮处理。行ACLT的5组家兔耳缘静脉注射水合氨醛(10%, 3 mL·kg^-1)进行麻醉, 于每只家兔的右腿膝关节内侧做纵形切口, 切口长度约2 cm。钝性分离关节囊处筋膜使髌骨显露, 将髌骨向膝关节外侧脱位, 曲屈膝关节使前交叉韧带较大程度地暴露出来, 用眼科剪剪断前交叉韧带, 行抽屉实验确认交叉韧带已完全剪断, 确认后用生理盐水(NS)冲洗切口, 逐层缝合筋膜、表皮。手术后, 对所有家兔恢复手术前饲养条件, 并允许各组家兔自由活动, 另外自手术结束起, 对进行手术的家兔每天肌肉注射抗生素头孢唑啉(1.0 mg·kg^-1), 1次/天, 持续3天。术后第4周, 对家兔进行治疗干预, model组和control组兔右膝关节腔注射0.1 mL·kg^-1NS, 1次/周, 连续5周; XG-0.6 mg·kg^-1、XG-1.2 mg·kg^-1和XG-2.4 mg·kg^-1组兔右膝关节腔分别注射XG 0.6 mg·kg^-1、1.2 mg·kg^-1和2.4 mg·kg^-1, 1次/周, 连续5周; SH-1.2 mg·kg^-1组兔右膝关节腔注射1.2 mg·kg^-1 SH, 1次/周, 连续5周。所有家兔于术后第9周处死。

生理指标监测  自手术处理第1周起, 用游标卡尺每天测量、记录每只家兔的膝关节宽度, 膝关节宽度测量位置为股骨和胫骨相接处, 用红外测量仪每天测量、记录家兔膝关节温度。

大体形态学观察及HE染色  药物干预至第9周末结束治疗, 每组随机选取6只家兔, 耳缘静脉注射空气处死, 对尸体立即进行解剖, 取出右膝关节处的股骨髁和胫骨平台。观察股骨髁和胫骨平台的表面平整度、光泽度和颜色, 参照参考文献^[4]对大体形态进行评分。稍作清理后用10%福尔马林进行固定, 72 h后经脱钙、脱水、石蜡包埋, 然后切片, 显微镜下观察软骨细胞的形态结构改变, 并根据参考文献^[5]对结构改变进行评分。评分标准见表 1和表 2。

表1(Table 1)

Table 1 The gross scoring criteria for articular cartilage surfaces Score Surface morphology of articular cartilage 0 Surface smooth and complete with bright color 1 Surface rough, with minor defects and matt or darker glossiness 2 Surface erosion, damage extending into the superficial or middle layers 3 Surface forms ulceration and damage extending into the deep layers 4 Complete cartilage erosion with subchondral bone exposed

Table 1 The gross scoring criteria for articular cartilage surfaces

表2(Table 2)

Table 2 The histopathological scoring criteria of articular cartilage Item Score Description Structure 0 Normal 1 Surface irregularities 2 Surface and vessel irregularities 3 Fissures extending into transitional zone 4 Fissures extending into radio zone 5 Fissures extending into calcification zone 6 Most of the structures defect Cell 0 Normal 1 More diffuse cells 2 Local cells increase 3 Few cells Matrix staining 0 Normal 1 Severe staining 2 Moderate staining 3 Slight staining 4 Unstained Tidemark’s integrity 0 Complete 1 Vessel destroyed

Table 2 The histopathological scoring criteria of articular cartilage

Western blot检测软骨细胞中Bax和caspase-3含量  参考文献^{[6, 7]}, 将软骨于液氮中研磨成粉末, 加入现配的裂解液, 将组织用超声波破碎仪粉碎30 s (冰上操作), 冰上放置30 min, 4 ℃、12 000 r·min^-1离心20 min, 提取上清液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细胞中总蛋白浓度。根据所测结果确定上样量和PBS的用量, 进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 根据目的蛋白的大小, 参照蛋白Mark的指示适时终止电泳。采用半干法转膜, 封闭, 洗膜, 按照对应分子质量切割后分别置于1:1 000稀释的caspase-3和Bax等一抗溶液中, 4 ℃杂交过夜, 第2天用洗膜液漂洗后加入1:1 000稀释的二抗, 摇床上杂交1 h, 取出用洗膜液冲洗, 然后加ECL显色剂进行显色, 检测。

统计学处理  使用SPSS 17.0软件进行数据分析, 计数资料以(x±s)表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行比较。P < 0.05, 具有统计学差异。

家兔膝关节宽度随时间的变化见图 2。Control组家兔膝关节宽度在整个实验过程中无较大波动, 始终维持在实验起始阶段水平。与control组相比, 接受手术的各组家兔在第1周膝关节宽度均有明显增加, 第2周起逐渐恢复。Model组家兔膝关节宽度与XG-0.6 mg·kg^-1组始终无显著性差别(P > 0.05), 第4周进行治疗干预, 除XG-1.2 mg·kg^-1组家兔膝关节宽度于第6周和model组无显著性差别(P > 0.05) 外, 自第6~9周治疗结束, model组家兔膝关节宽度均高于其他药物干预组(XG-1.2 mg·kg^-1、XG-2.4 mg·kg^-1和SH-1.2 mg·kg^-1组) (P < 0.05), XG-1.2 mg·kg^-1、XG-2.4 mg·kg^-1和SH-1.2 mg·kg^-1组间家兔膝关节宽度无显著性差别(P > 0.05)。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Changes of knee joint width with time in rabbits. SH: Sodium hyaluronate. n = 10, x±s. *P < 0.05 vs model group

与Control组比较, 接受手术各组家兔膝关节温度在手术操作后迅速上升, 于第1周达到最高水平, 并在第2~4周维持在较高水平, 无明显波动; 于第4周进行治疗干预后, 接受手术各组家兔膝关节温度呈逐渐下降趋势, 但model组和XG-1.2 mg·kg^-1组家兔膝关节温度一直保持在较高的水平, 且两组间无显著性差别(P > 0.05), 两组自第5周实验结束时其膝关节温度高于其他药物干预组(P < 0.05); XG-1.2 mg·kg^-1、XG-2.4 mg·kg^-1和SH-1.2 mg·kg^-1组间家兔膝关节温度无显著性差别(P > 0.05) (图 3)。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Changes of knee joint temperature with time in rabbits. n = 10, x±s. *P < 0.05 vs model group

Control组股骨髁和胫骨平台肉眼观察表面平滑、完整, 呈白色, 光泽度较好, model组股骨髁和胫骨平台表面局部呈凹凸不平状, 颜色显示浅黄色, 有缺损和裂隙, 光泽度偏暗, 并在股骨髁表面发现有骨赘生成(图 4A, G)。XG-0.6 mg·kg^-1、XG-1.2 mg·kg^-1、XG-2.4 mg·kg^-1和SH-1.2 mg·kg^-1组股骨髁和胫骨平台表面基本保持完整, 呈白色, 没有发现骨赘和缺损, 光泽度也较好(图 4C, I; 图 4D, J; 图 4E, K; 图 4F, L)。XG-1.2 mg·kg^-1、XG-2.4 mg·kg^-1组和SH-1.2 mg·kg^-1组大体形态学观察评分明显低于model组(P < 0.01), XG-2.4 mg·kg^-1组和SH-1.2 mg·kg^-1组大体形态学观察评分低于XG-0.6 mg·kg^-1组(P < 0.05), XG-2.4 mg·kg^-1组和SH-1.2 mg·kg^-1组相比, 大体形态学观察评分无显著性差别(P > 0.05) (表 3)。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Observation of gross morphology of osteoarthritis cartilage in rabbits as following: femoral condyle (A-F) and tibial plateau (G-L). A, G: Control group; B, H: Model group; C, I: XG-0.6 mg·kg-1 group; D, J: XG-1.2 mg·kg-1 group; E, K: XG-2.4 mg·kg-1 group; F, L: SH-1.2 mg·kg-1 group

表3(Table 3)

Table 3 Gross score of cartilage. n = 6, x±s. **P < 0.01 vs model group; △P < 0.05 vs XG-0.6 mg·kg-1 group group Group Femoral condyle Tibial plateau Control 0.3 ± 0.32 0.2 ± 0.37 Model 3.0 ± 0.27 2.7 ± 0.25 XG-0.6 mg·kg-1 2.8 ± 0.25 2.5 ± 0.14 XG-1.2 mg·kg-1 1.6 ± 0.47** 1.7 ± 0.25** XG-2.4 mg·kg-1 0.9 ± 0.21**, △ 1.2 ± 0.34**, △ SH-1.2 mg·kg-1 1.1 ± 0.11**, △ 1.3 ± 0.31**, △

Table 3 Gross score of cartilage. n = 6, x±s. **P < 0.01 vs model group; △P < 0.05 vs XG-0.6 mg·kg-1 group group

Control组HE染色显示软骨组织完整, 表面平整, 细胞有序排列, 潮线较深且连续(图 5A)。Model组HE染色显示软骨细胞明显减少, 表面缺损, 组织完整性破坏, 细胞无规则排列, 潮线较浅且不连续(图 5B)。XG-0.6 mg·kg^-1组HE染色显示软骨细胞表面基本保持完整, 细胞排列无规则, 组织间出现裂隙, 潮线保持完整(图 5C)。XG-1.2 mg·kg^-1、XG-2.4 mg·kg^-1和SH-1.2 mg·kg^-1组HE染色显示软骨组织完整, 表面较为平整, 软骨细胞排列规则, 潮线较深且连续(图 5D~F)。XG-1.2 mg·kg^-1、XG-2.4 mg·kg^-1和SH-1.2 mg·kg^-1组的组织病理学评分明显低于model组(P < 0.01)。XG-2.4 mg·kg^-1组和SH-1.2 mg·kg^-1组组织病理学评分低于XG-0.6 mg·kg^-1组(P < 0.05), XG-2.4 mg·kg^-1组和SH-1.2 mg·kg^-1组相比, 组织病理学评分无显著性差别(P > 0.05) (表 4)。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Histological observation of rabbit osteoarthritis cartilage. A: Control group; B: Model group; C: XG-0.6 mg·kg-1 group; D: XG-1.2 mg·kg-1 group; E: XG-2.4 mg·kg-1 group; F: SH-1.2 mg·kg-1 group

表4(Table 4)

Table 4 Histological score of articular cartilage. n = 6, x±s. **P < 0.01 vs model group; △P < 0.05 vs XG-0.6 mg·kg-1 group Group Score Control 0.24 ± 0.38 Model 8.10 ± 0.99 XG-0.6 mg·kg-1 7.58 ± 0.25 XG-1.2 mg·kg-1 3.80 ± 0.63** XG-2.4 mg·kg-1 3.20 ± 0.84**, △ SH-1.2 mg·kg-1 3.49 ± 0.64**, △

Table 4 Histological score of articular cartilage. n = 6, x±s. **P < 0.01 vs model group; △P < 0.05 vs XG-0.6 mg·kg-1 group

与control组相比, model组和XG-0.6 mg·kg^-1组家兔膝关节软骨细胞中Bax和cleaved caspase-3水平明显增加(P < 0.01), model组和XG-0.6 mg·kg^-1组家兔膝关节软骨细胞中Bax和cleaved caspase-3水平无显著性差别(P > 0.05) 且明显高于XG-1.2 mg·kg^-1和XG-2.4 mg·kg^-1组(P < 0.01), XG-2.4 mg·kg^-1和XG-1.2 mg·kg^-1组家兔骨关节软骨细胞中cleaved caspase-3水平无显著性差别(P > 0.05), XG-2.4 mg·kg^-1组家兔骨关节软骨细胞中Bax水平低于XG-1.2 mg·kg^-1组(P < 0.05) (图 6)。

Figure 6

Figure 6

Figure 6 Effect of XG on the expression of cleaved caspase-3 and Bax in rabbit osteoarthritis. n = 6, x±s. **P < 0.01 vs model group; #P < 0.05 vs XG-1.2 mg·kg-1 group

目前, 我国OA的患病人数占总人口的15%, 为2亿左右, 已成为世界上OA患病人数最多的国家之一。OA给中老年人带来了极大的疼痛和经济负担, 已成为导致人类残疾的主要疾病之一, 被称为“不死的癌症”^[8]。因此, 开发有效的防治OA的方案具有重要的应用价值和社会效益。OA的治疗主要包括运动疗法、物理因子疗法、辅助器具与矫形器疗法及药物治疗^[9]。研究表明, SH对OA具有疗效, 已成为临床治疗早中期OA的常用药物, 但SH易被体内的酶降解且易被自由基氧化, 半衰期短, 患者需连续给药(临床治疗方案: 1周/1次, 连续5周为1个疗程)^[10]。因此, 寻找一种与其结构和功能相似, 但更稳定、给药间隔周期更长的药物具有重要意义。

在XG的相关研究中, Han等^{[11, 12]}通过制备XG注射液建立了注射用XG的质量控制标准, 并对关节腔内注射XG的安全性和XG对兔关节软骨细胞的细胞毒性进行了评价, 结果表明XG用于关节腔注射时对动物局部和全身无明显毒性, 对体外培养兔软骨细胞亦无明显毒性。在此基础上, 通过关节腔注射木瓜蛋白酶建立OA体内模型和用白介素-1β诱导体外培养软骨细胞建立软骨细胞体外损伤模型, 以此研究XG对OA损伤模型中软骨细胞的保护作用, 结果表明, XG可以在体内和体外有效地保护关节软骨细胞, 且体内实验结果表明XG比SH给药周期更长的情况下依然可以达到相同的治疗效果^{[1, 11, 13]}。Shao等^[14]通过碘乙酸诱导的OA模型研究了XG对实验性OA引起的疼痛的缓解作用, 结果显示黄原胶可以明显地缓解实验性OA引起的疼痛。以上研究均为XG成为治疗OA的新药提供了依据。

建立OA模型的方法有多种, 包括手术诱导、药物诱导和关节制动诱导^[15]。其中手术诱导较为常用, 包括半月板摘除术、ACLT和后交叉韧带切断术(PCLT)等, 其中ACLT是被广泛认可的一种, 故本研究选择使用ACLT诱导兔膝关节OA模型^[16]。在建立OA模型的过程中, 提高家兔的生存率是获得较全面数据、顺利进行实验的重要因素, 这就要求手术过程中选用恰当的手术药物并于术后对家兔进行合理的护理, 此外, 为了避免不同实验人员进行手术的操作差异, 提高建立模型的稳定性, 本实验对所有家兔进行的ACLT均由同一实验人员完成。

OA的发生与多种因素有关, 包括力学因素如机械磨损, 生物学因素如软骨细胞凋亡、免疫异常等^[17]。其中关节软骨细胞凋亡在OA的发生过程中起着重要的作用^[18], 而caspase-3和Bax对细胞凋亡具有重要的调控作用^{[19, 20]}。Bax蛋白水平的升高可诱发线粒体途径的细胞凋亡^{[21, 22]}, caspase-3为细胞凋亡的执行蛋白, 其表达的增加可加速细胞的凋亡进程^{[23, 24]}。本实验对软骨细胞中caspase-3和Bax的表达水平进行检测, 以期探讨XG对保护作用的机制。实验结果显示, XG可以通过降低软骨细胞中caspase-3和Bax水平抑制细胞凋亡, 进而保护软骨细胞。

骨关节炎病程中伴有疼痛和关节肿胀等症状, 这些症状的表现强弱往往也间接反映了骨关节炎的严重程度。其中, 骨关节炎兔的膝关节宽度可以反映关节处炎症的严重程度, 膝关节越宽, 表明关节处越肿胀, 关节炎症越严重^[25-28]。膝关节温度亦可以反映骨关节炎的严重程度^[29], 膝关节处温度越高, 表示骨关节炎病情越严重。本实验通过测量膝关节宽度和关节局部温度, 作为一种辅助指标, 观察了不同组别兔关节炎的严重程度, 从而达到辅助研究黄原胶药效的目的。

本实验采用ACLT建立兔OA模型, 并以此研究了XG对该模型关节软骨的保护作用及其作用机制。实验结果显示, 对兔膝关节进行0.6、1.2和2.4 mg·kg^-1剂量的XG膝关节注射具有保护关节软骨的作用; 并且, 该保护作用可能是通过抑制软骨细胞中凋亡因子caspase-3和Bax的表达实现的。在OA的进程中, 由于细胞凋亡所涉及的信号通路较为复杂, 所以XG保护OA中软骨细胞的机制仍需进一步探讨。