2017, Vol. 52
2. 江苏恩华药物研究院, 江苏 徐州 221100
2. Jiang Su Enhwa Drug Research Institution, Xuzhou 221100, China
钙激活氯通道(calcium-activated chloride channel, CaCC)作为人体阴离子通道, 广泛分布于呼吸道、消化道等具有分泌功能的腺上皮细胞中, 也存在于视网膜、背根神经节及平滑肌细胞中, 参与多种细胞生理活动, 例如分泌蛋白及盐的跨上皮转运、神经信号传导、动作电位复极、平滑肌收缩等[1-5]。迄今为止, 发现的CaCC分子基础主要有CLCA (chloride channel accessory)[6]、tweety (hTTHY1 and hTTYH3)[7]、bestrophins[8]和anoctamins[9]。
Anoctamin 1 (ANO1), 也被称为TMEM16A (transmembrane protein 16A), 是一类具有8次跨膜结构的膜蛋白。ANO1最初被发现在部分肿瘤组织中特异性高表达, 如胃肠道间质瘤[10]、口腔鳞状细胞癌[11]、头颈部鳞状细胞癌[12]等, 而在相同起源的正常组织低表达或不表达。ANO1抗体能够作为检测胃肠道间质瘤的一种敏感的特异性标志物[13]。2008年, ANO1蛋白首次被确认为CaCC的分子基础, 在体外可表现完整的钙激活氯电流特征[14-17]。
理论上, 如果对ANO1蛋白进行调控, 可能产生一系列与离子通道功能相关的药效作用, 例如Lee等[18]在小鼠中使用干扰RNA将ANO1敲低后, 小鼠对针刺和热刺激产生明显痛觉钝化现象; Namkung等[19]使用离体肠平滑肌组织进行肠蠕动力监测, 发现ANO1抑制剂TMEM16Ainh-A01可以显著降低肠蠕动舒张力和收缩力, 但不改变蠕动节律。此外, ANO1也具有肿瘤相关的调控功能, 具有明显的抑制肿瘤增殖和迁移的作用[20], 例如Liu等[21]在前列腺癌细胞中使用shRNA对ANO1进行沉默, 显著抑制了肿瘤的增殖和迁移。
针对ANO1蛋白的小分子调节剂研究还处于起步阶段, 数量少、活性低是当前存在的主要问题。文献报道较强的ANO1特异性抑制剂IC50值在1 μmol·L-1以上, 较低的活性一定程度上制约了ANO1蛋白的基础研究工作。
ANO1特异性抑制剂主要有CaCCinh系列[22], TMEM16Ainh-A系列[23]、MONNA系列[24]、Ani9系列[25]和部分天然化合物[26], 以上化合物普遍对ANO1稳转细胞系中的CaCC电流具有明显抑制作用, 但是对具有CaCC电生理特征的正常人体组织细胞抑制作用存在明显差异; 此外, 以上抑制剂对于ANO1相关的肿瘤增殖抑制效果也存在差异, CaCCinh-A01和tannic acid具有明显抑制作用, 而其余抑制剂则无效。目前ANO1激动剂只有Eact系列[27], 其可在无Ca2+环境下直接激动ANO1蛋白, 产生离子通道功能。
本文将从以ANO1为靶点的钙激活氯通道调节剂的测活方法、结构及构效关系和潜在应用方向进行论述。
1 钙激活氯通道调节剂的生物活性测试方法目前对于ANO1蛋白调节剂的测活方法, 主要围绕ANO1蛋白的钙激活氯通道特性, 即转运阴离子, 且通道开闭受到细胞内Ca2+浓度和细胞膜电位的双重影响。当通道开放时, 细胞膜电阻显著下降, 并出现跨细胞膜的阴离子流, 这种电流可以被电极检测到, 不同的开放程度产生的跨细胞膜电流不同。因此, 通过调整细胞内Ca2+浓度或改变膜电位来控制通道开放程度, 检测调节剂对跨膜电流的影响, 是大多数ANO1蛋白调节剂测活方法的基本原理; 与此同时, 也可通过使用对阴离子敏感的荧光指示蛋白, 检测阴离子浓度变化的方式来进行间接检测。ANO1蛋白调节剂的测活方法主要有黄色荧光蛋白-碘离子荧光淬灭法、短路电流法、全细胞膜片钳法和电压钳法, 以下分别阐述。
1.1 黄色荧光蛋白-碘离子荧光淬灭法该方法使用ANO1和黄色荧光蛋白(yellow fluoresence protein, YFP)共转染的FRT细胞, 或YFP转染的内源性表达CaCC的人体组织细胞。YFP的黄色荧光可以被碘离子淬灭。当细胞外液加入卡巴胆碱(CCh)或ATP时, 细胞内钙库会释放钙离子, 使钙离子浓度升高, 从而激活CaCC通道。而CaCC通道可以将细胞外碘离子转运进入细胞内部, 因而在不加入调节剂时细胞内的YFP荧光会被淬灭, 在酶标仪检测下, 荧光值会显著降低。如图 1所示, 当加入CaCC抑制剂时, 荧光值降低的速度会减慢; 反之, 当加入激动剂时, 荧光值降低速度会加快, 通过比较荧光值的下降速率, 可间接评价调节剂的活性。
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Figure 1 Yellow fluoresence protein (YFP) florescence quenching assay. (A) Experiment method of YFP florescence quenching assay; (B) Changes of yellow fluorescence in response to different CaCCinh-A01 concentration[22] |
短路电流法(short circle current)使用经典的尤斯室装置, 如图 2所示, 上皮组织或单层细胞接种在基底上, 形成具有极性的紧密连接, 将两个小室完全隔离开。在基底上下两侧通过电极连接一个电压表, 用于测量细胞外侧和基底侧之间的电压。两个小室内装有不同盐溶液, 通过盐桥串联一个外接电源和电流表。在离子通道开放状态下, 基底细胞会自发在两个小室之间转运离子, 产生转运电流和转运电压, 转运电压会被基底层两侧连接的电压表记录下来。此时外接电源给予一个与转运电流大小相同、方向相反的电流, 将转运电压抵消至0 mV, 电流表记录此时给予的外接电流的大小, 即为转运电流的大小。当加入ATP时, 促进细胞内钙库释放钙离子, 进一步激活ANO1通道, 转运电流上升。若再向其中加入ANO1抑制剂, 通道关闭, 此时转运电流会急剧下降。不同强度的抑制剂, 电流的下降幅度不一, 因此可判断抑制剂强弱。
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Figure 2 Ussing chamber. (Ⅰ) Epithelial tissue or cells; (Ⅱ) The two half chambers with ringer solution; (Ⅲ) (Ⅳ) Agar-Ringer bridges; (Ⅴ) Amperemeter; (Ⅵ) Voltmeter |
膜片钳实验被称为离子通道研究领域的“金标准”。全细胞膜片钳使用特制的中空玻璃电极吸住并吸破细胞表面, 使细胞膜和电极之间形成封闭回路, 电极可检测全细胞膜的离子转运电流。通过中空电极向细胞内液中加入钙离子, 激活ANO1通道。此时电极上外加梯度电压, 检测电流变化情况。当细胞外液加入抑制剂后, 通道闭合, 电阻升高, 在相同的梯度电压下, 相比不加药的空白组离子转运电流降低; 激动剂反之。由此可评估调节剂对离子通道的影响。
1.4 电压钳法本方法在CaCC通道检测方面的应用是由Oh等于2008年提出[28]。电压钳与膜片钳的基本原理相似, 但装置有所区别。电压钳更有利于间接测定在某一特定膜电位下, 细胞膜电阻值, 即离子通道开放程度。装置由两根电极刺入细胞, 其中一根电极连接电压计和指令电压装置, 设定好某一指令电压后, 判断电路会判断膜电压和指令电压值之间的差距, 而后命令外接电源通过另一根电极向细胞内输入一定电流, 使膜电位和指令电压大小相等, 方向相反, 此输入电流会被电流计记录下来。在一定指令电压和钙离子浓度下, 抑制剂活性越强, ANO1通道开放程度越小, 膜电阻越大, 意味着要使膜电位和指令电压相等, 需要输出的电流越小。因此通过比较输入电流, 可间接反映抑制剂活性强弱。
2 ANO1调节剂CaCC抑制剂根据作用选择性可分为非特异性和特异性两类。最初发现的CaCC抑制剂都属于非特异性类, 其选择性较差, 抑制活性弱, 例如niflumic acid (NFA)[29], 能在非洲爪蟾卵母细胞中以10 μmol·L-1的剂量阻断CaCC[30]。曾经人们一度认为NFA是一种特异性阻断剂, 甚至将其用于在不同组织的阴离子电流中识别CaCC电流。然而, NFA有时也能提高钙激活氯电流[31]。NFA除阻滞CaCC外, 还能对许多离子通道进行抑制, 例如电压门控阴离子通道(VRAC)[32]和钾离子通道[33, 34]。此外, NFA对Ca2+电流也有影响[34, 35]。
以下分别详述以ANO1为靶点的CaCC特异性抑制剂。
2.1 天然产物该系列化合物由Namkung等[26]于2010年发表, 代表结构主要有digallic acid (1, IC50 3.6 μmol·L-1)、dichlorophene (2, IC50 4.5 μmol·L-1)、tannic acid (3, IC50 6.1 μmol·L-1)、candesartan (4, IC50 3.7 μmol·L-1)、gossypol (5, IC50 6.1 μmol·L-1)和gambogic acid (6, IC50 3.7 μmol·L-1) (图 3)。在ANO1稳转的FRT细胞上对3 200种天然产物进行基于黄色荧光蛋白-碘离子荧光淬灭模型测试后筛选出以上化合物。其中, tannic acid (3)对ANO1稳转FRT细胞、内源性高表达ANO1的肠T84细胞、支气管上皮细胞均具有良好的CaCC抑制作用。同时其对囊性纤维化跨膜转导因子相关氯通道(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)、上皮细胞钾通道(epithelial sodium channel, EnaC)等离子通道均无抑制作用, 亦不影响细胞内钙离子浓度。
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Figure 3 Calcium-activated chloride channel (CaCC) inhibitor natural products |
CaCCinh-A01 (7)是第一个特异性CaCC抑制剂, 其起效迅速, 抑制能力较强。该系列化合物由Namkung等[22]于2008年发表并申请专利。由于ANO1蛋白作为CaCC的分子基础直到2008年才被揭示, 因此Namkung等进行CaCCinh-A01系列研究时并未使用ANO1蛋白稳转细胞系, 而使用人结肠癌细胞HT-29 (内源性CaCC高表达)构建黄色荧光蛋白-碘离子荧光淬灭模型。对50 000种类药化合物进行高通量筛选获得了CaCCinh-A (7)、CaCCinh-B (8)两类化合物。二者在抑制CaCC通道同时, 不影响细胞内钙浓度, 同时对CFTR无抑制作用。
如图 4所示, 对CaCCinh-A (7a)系列18个类似物分子进行构效关系研究发现, n为1 (即噻吩并环己烷母核)活性最高, n为2 (即噻吩并环庚烷母核)次之, 而n为0 (即噻吩并叔丁基环戊烷母核)活性消失; R1部分为叔丁基有利于活性提升; R2部分为OH (即噻吩甲酸)时活性最高, 为甲氧基(即噻吩甲酸甲酯)或乙氧基(噻吩甲酸乙酯)时活性次之, 为取代氨基时(即噻吩酸酰胺)活性消失; R3部分对活性影响较弱, 为2-呋喃甲酰基或(trans)-C=OC=CCO2H时活性最高, 为取代苯基或-C=O(CH2)2CO2H时活性次之。
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Figure 4 The series of CaCCinh inhibitors |
对CaCCinh-B (8a)系列14个类似物进行构效关系研究发现, R1部分为4位取代甲基或乙基活性最好, 3位取代活性消失; R2部分为正丙基、乙酸基或氢时活性最高, 为苯基时活性消失; R3分别为2, 3, 4位取代苯基活性均可。
由于ANO1蛋白在肿瘤组织中高度表达, 使用siRNA对ANO1进行沉默会导致相应ANO1高表达肿瘤细胞增殖抑制, 因此使用ANO1抑制剂进行肿瘤相关研究也是学界的研究热点之一。2014年诺华生物医学研究中心的Hall等[36]发表文章, 发现CaCCinh-A01系列分子在抑制肿瘤增殖方面具有一定活性, 同时此种活性是通过促进ANO1蛋白降解而产生的。分别在ANO1内源性高表达癌细胞(Te11和Fadu)和ANO1低表达的癌细胞上测试, ANO1特异性抑制剂CaCCinh-A01 (7)、TMEM16Ainh-A01 (9)、ANO1天然抑制剂tannic acid (3)和digallic acid (1) 4种化合物的作用并不一致。只有CaCCinh-A01和tannic acid在ANO1高表达癌细胞上具有增殖抑制活性, 并且对ANO1低表达细胞增殖抑制活性较低; 其余两种抑制剂对ANO1高、低表达的细胞均无增殖抑制活性。对CaCCinh-A01衍生物进行测试发现, 此种增殖抑制效果与化学结构密切相关, 如图 4所示n = 1时, R1叔丁基和R2羟基对增殖抑制活性为必需基团, 当R1变为氢原子或R2部分成酯后, 增殖抑制活性消失, 但仍具有CaCC通道抑制活性。Hall等又将CaCCinh-A01羧酸形态和钙离子共孵育结晶, 进行X-射线晶体衍射发现, 6个CaCCinh-A01分子的羧酸部分与3个钙离子形成稳定的配位, 而R2部分成酯的CaCCinh-A01衍生物则无法形成稳定配位, 猜想肿瘤增殖抑制活性可能是由抑制剂与ANO1钙结合区的钙离子配位引起的。进而使用10种钙配位剂进行增殖抑制测试, 均无活性, 而后使用EGTA-AM (即EGTA的可透膜形式)进行增殖抑制测试, 发现其具有的增殖抑制活性与ANO1的表达量无关。因此提出与钙离子的配位能力可能是肿瘤增殖抑制活性的必要条件, 但不是充分条件。
2.3 TMEM16Ainh-A01该系列化合物由Namkung和Verkman等[23]于2011年通过高通量筛选发现。对商业化合物库10万个分子进行基于黄色荧光蛋白-碘离子黄色荧光淬灭实验发现, TMEM16Ainh-A01 (9, IC50 1.8 μmol·L-1)、B01 (10, IC50 4.4 μmol·L-1)、C01 (11, IC50 8.4 μmol·L-1)、D01 (12, IC50 4.4 μmol·L-1) (图 5) 4个分子在ANO1稳转的FRT细胞中表现出良好的抑制活性, 同时不影响细胞内钙浓度。随后在短路电流实验中发现, TMEM16Ainh系列分子以及ANO1天然抑制剂digallic acid (1)仅对唾液分泌腺上皮细胞中的CaCC通道有抑制作用, 而对支气管和肠上皮细胞中的CaCC通道抑制作用微弱; 与此相比, CaCC经典抑制剂CaCCinh-A01 (7)和天然抑制剂tannic acid (3)则对上述唾液腺细胞、肠上皮细胞、支气管上皮细胞均有良好的抑制作用。在对唾液腺上皮细胞和支气管上皮细胞进行Western blot检测后发现, 唾液腺细胞ANO1蛋白表达量远高于支气管上皮细胞。白细胞介素4 (interleukin-4, IL-4) 可以显著提高ANO1蛋白含量, 在对支气管上皮细胞进行IL-4孵育后, Western blot结果表明其ANO1蛋白含量也并未出现显著增加。以上实验表明:在支气管上皮细胞中, ANO1介导的CaCC电流只占小部分; CaCCinh-A01和tannic acid除抑制ANO1蛋白外, 还能够抑制其他CaCC的分子基础。
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Figure 5 The series of TMEMinh inhibitors |
Namkung等[23]还进行了ANO家族另一亚型ANO2通道的相关抑制试验(此前有报道表明其也是CaCC的分子基础之一, 主要分布于中枢神经系统), 结果表明上述CaCCinh-A01 (7)、TMEM16Ainh-A01 (9)、digallic acid (1)和tannic acid (3)均同时抑制ANO1及ANO2通道。
在对TMEM16Ainh-A系列18个衍生物进行的构效关系分析表明, R1部分对活性影响显著, R1为小疏水基团取代的苯基时活性最好, 例如3, 4, 5位甲基或乙基取代的苯基; R1为亲水基团取代的苯基时活性较差, 例如多氨基、多羟基取代苯基; 连接芳基取代的苯基时活性消失。R2部分对活性影响较小, 氢、甲氧基、氟、氯取代时活性相差不大。
2.4 MONNAMONNA系列分子是Oh和Lee于2013年发表[24], 该系列使用Oh等[28]在2008年建立的非洲蟾蜍卵母细胞电压钳模型进行生物活性测试, 通过合成优化的手段获得MONNA (13, IC50 0.08 μmol·L-1, 电压钳) (图 6) 分子。该研究中未将MONNA和其他ANO1特异性抑制剂进行比较, 只与非特异性CaCC抑制剂NFA等进行比较。MONNA (13)在全细胞膜片钳实验中IC50为1.27 μmol·L-1, 在数据上与ANO1抑制剂TMEM16Ainh-A01 (9)相近。MONNA系列分子对bestrophin-1和CFTR等通道均无明显抑制作用。
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Figure 6 The series of MONNA inhibitors |
在对MONNA系列72个类似物分子进行构效关系研究后表明(13a) (图 6), R1为5取代硝基时活性最强, 吸电子基团有利于活性提高。R2为2-萘环有助于活性提升, 其中4-甲氧基-2-萘基时活性最强。
2.5 Ani9该系列由Seo和Namkung在2016年发表[25], 是目前抑制能力最强的选择性ANO1蛋白抑制剂。Namkung等在ANO1稳转FRT细胞上使用黄色荧光蛋白-碘离子荧光淬灭法对54 000个分子进行高通量筛选, 使用短路电流实验进行验证, 筛选出Ani9 (14, IC50 0.107 μmol·L-1) (图 7) 系列分子。该系列化合物对ANO1具有很强的选择性, 在短路电流实验中, 该分子对ANO2、CFTR、VRAC等均无明显抑制作用, 在ANO1高表达的FRT细胞、PC-3细胞、Capan-1细胞及IL-4孵育的NHNE (normal human nasal epithelial)细胞中, Ani9 (14)均具有良好抑制作用。
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Figure 7 The series of Ani9 inhibitors |
Ani9系列分子没有进行衍生合成, 对其现有9个类似物进行测试表明(14a) (图 7), R1为2-甲基-4-氯苯基时活性最强, 特别是2位甲基取代对活性提升帮助较大。R2部分进行了甲氧基取代苯基和羟基取代苯基类似物的测活, 其中2-甲氧基苯基取代时活性最强。
2.6 激动剂: Eact和Fact该系列分子由Namkung在2011年发表[19], 通过黄色荧光蛋白-碘离子荧光淬灭实验筛选和短路电流实验验证, 对Chemdiv和Asinex商业化合物库10万个合成分子以及7 500个天然分子进行测试, 获得了Eact (15, EC50 3 μmol·L-1)和Fact (16, EC50 37 μmol·L-1) (图 8) 两个代表分子。其二者在ANO1稳转的FRT细胞中, 激动CaCC通道的同时不影响细胞内钙浓度。二者激动的CaCC电流可被ANO1抑制剂TMEM16Ainh-A01 (9)抑制。
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Figure 8 The series of Eact agonists |
在全细胞膜片钳实验中, Eact (15)可在细胞内、外钙离子浓度极低的情况下, 轻度激活ANO1通道, 但Fact (16)则不具有此种功能; 在Eact和Fact联合给药试验中, 二者呈现明显的协同作用: 1 μmol·L-1 Eact激动能力小于20%, 1 μmol·L-1 Fact激动能力小于5%, 而各1 μmol·L-1的二者联用, 激动能力超过40%; 1 μmol·L-1 Eact和3 μmol·L-1 Fact联用, 激动能力则高达80%。
Namkung等[19]合成了17种Eact类似物(15a) (图 8), R1为芳环或醚链, R2部分则替代为不同取代位置的苯环。其中, R1部分的取代基对活性影响较小, 芳烃或环状烷烃利于活性提升; R2为无取代苯基或卤代苯基、甲氧基取代苯基、4-哌啶基活性相近; 仅当R1为2-甲氧基乙基, 且R2为3, 6-二甲氧基苯基或4-哌啶基时无活性, 但是当R1为其他芳烃或环烷烃时, R2为上述两种取代基时有活性。
3 ANO1调节剂构效关系比较以ANO1为靶点的特异性钙激活氯通道抑制剂结构差异较大, 但可能具有相似的药效团特征。如图 9 (A), 以CaCCinh-A01模板, 比较分析TMEM16Ainh-A01、MONNA、Ani9、dalligic acid、Eact、Fact等调控分子, 可见分子基本骨架由芳环-连接链-芳环体系组成, 连接链两侧芳环中心距离6.2Å 左右, 在TMEM16Ainh-A01和Ani9中, 硫醚的硫原子或醚链的氧原子到左侧芳环中心的距离在7Å 左右。在MONNA中, 右侧萘环与1-硝基苯环中心距离7.5Å 左右, 与TMEM16Ainh-A01中硫苯和噻唑中心距离7.8Å 相近。
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Figure 9 SAR of ANO1 modulators. (A) Comparing with ANO1 modulators, different colours means different structural features; such as CaCCinh-A01, red means aromatic rings (Ar) or conjugated functional group bonding to amide nitrogen, purple means Ar which attaching to amide carbonyl, orange means hydrophobic functional group bonding to thiophene; And in TMEM16Ainh-A01, blue means aromatic ether attaching to amide carbonyl, green means Ar bonding to 4 position of thiophene; (B) left: CaCCinh-A01 and K01, right: alignment CaCCinh-A01 to K01 conformation from KSP-K01 complex crystal structure, and the distance between two Ar centrals which bonding to amide carbonyl and amide nitrogen is 6.2Å ; (C) Alignment many ANO1 inhibitors in (A) method, the angle between Ar plate and amide plate is approximately 45°; the distance of S or O, in TMEM16Ainh-A01 and Ani9, to the Ar central which bonding to amide nitrogen is approximately 7Å |
在上述分子中, 连接链与两侧芳环可能并不处于平面共轭状态。如图 9 (B)左图, 观察CaCCinh-A01的类似物——K01, 其是纺锤体驱动蛋白(kinesin spindle protein, KSP)的非共价抑制剂分子(kinesin-like蛋白与ANO1蛋白完全不相关, 仅其抑制剂分子K01和ANO1抑制剂分子CaCCinh-A01结构相近)。选取K01共晶结构(PDB ID:2PG2) 中的活性构象, 将CaCCinh-A01与之叠合, 如图 9 (B)右图所示, 酰胺键N侧的芳环平面与酰胺键平面呈约45度夹角。而将CaCCinh-A01与K01进行叠合, 而后将所有调节剂分子与CaCCinh-A01进行叠合, 如图 9 (C), 可发现图 9 (A)中相同的结构特征部分叠合较好, 说明ANO1系列调节剂具有一定的相似性。
结合文献[19, 22-26, 36]报道的调节剂构效关系, 可以猜想: ANO1调节剂可能结合于一狭长口袋之中, 长度在16Å 范围内, 口袋内部较为疏水。以TMEM16Ainh-A01分子为例, 4-取代苯基噻唑结合于口袋右侧, 而芳香硫醚基团结合于口袋左侧。口袋内部右侧为弱的氢键给体, 与TMEM16Ainh-A01苯环上的甲氧基形成弱氢键; 结合口袋中部可能有含正电荷的氨基酸残基与CaCCinh-A01的羧基形成静电相互作用或氢键, 而口袋左侧则较为疏水, 是否存在氢键还不得而知。在CaCCinh-A01中存在的叔丁基可能暴露在口袋外侧, 以疏水作用将分子推入口袋内部; 而TMEM16Ainh-A01芳香硫醚和Ani9中芳香醚一般与主链形成弯折, 可能固定于口袋外部较为疏水的区域。以上猜想是基于构效关系的综合分析, 对于TMEM16Ainh-A01和Ani9等分子, 口袋左侧芳香醚部分的改变对于活性影响不大; 而几乎所有调节剂分子, 右侧芳环改变或芳环取代基改变可以显著影响活性。
4 以ANO1为靶点的CaCC调节剂潜在应用ANO1在包括气管和肠上皮细胞、平滑肌细胞、肠起搏细胞、感觉神经元和许多肿瘤细胞在内的多种细胞中具有重要作用[16, 37], 并参与到多种病理过程中[12, 38-40]。抑制ANO1蛋白将有助于多种疾病的治疗, 例如肿瘤、痢疾、哮喘、高血压、疼痛等。ANO1高度表达于多种人类肿瘤细胞中, 包括头颈部鳞状细胞癌、胃肠道恶性间质细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌细胞等[39-41], 抑制ANO1蛋白可以显著降低上述肿瘤细胞的生存能力[12, 39, 42, 43]。在轮状病毒引起的痢疾中, 通常认为轮状非结构蛋白4 (rotavirus nonstructure protein 4, NSP4) 作为一种肠毒素, 是通过激活CaCC而引起痢疾[44], 使用小分子对CaCC进行抑制可以减少轮状病毒介导的肠液流失。在卵清蛋白(oval albumin, OVA)介导的小鼠哮喘模型中, ANO1高度表达于气管黏蛋白分泌细胞和气管平滑肌细胞中。抑制ANO1导致气管上皮细胞黏液分泌抑制, 同时也会导致平滑肌收缩抑制[45]。最近, ANO1蛋白在血压调节中的作用逐渐被揭示出来, ANO1在原发性高血压患者的动脉中高度表达, 使用ANO1抑制剂TMEM16Ainh-A01可以明显降低血压(动物实验), 并且使用siRNA对ANO1进行敲低可以预防原发性高血压的出现[46]。此外, 在使用野百合碱(monocrotaline, MCT)介导的肺高压大鼠模型中ANO1 mRNA和蛋白水平均出现上调; 在五羟色胺相关肺高压中, 抑制ANO1可以明显降低肺动脉收缩[47]。ANO1还在痛觉传导中扮演重要角色, 例如, ANO1高度表达于痛觉相关的背根神经节(DRG)细胞中, 在DRG中阻断或敲低ANO1蛋白可显著降低小鼠在疼痛模型中的痛觉反应[37]。此外, 辣椒素引起的痛觉相关模型中, 痛觉行为可以被ANO1抑制剂TMEM16Ainh-A01降低[48]。
5 总结和展望ANO1特异性调节剂的发展自2008年开始已经走过9个年头, 包括CaCCinh-A01、TMEM16Ainh-A01、MONNA、tannic acid、Eact、Ani9在内的众多分子已经为ANO1基础研究提供了极大帮助。
但是ANO1蛋白作为CaCC通道的分子基础之一, 与其他分子基础之间的关系并没有得到阐明。特别是在ANO1抑制剂研究中, 各型ANO1抑制剂对支气管上皮细胞、肠上皮细胞中的CaCC通道抑制作用并不一致, 鉴于各种上皮细胞中的ANO1表达量不尽相同, 现无法确定抑制作用差异现象是由ANO1蛋白表达量引起, 还是由抑制剂在各CaCC通道分子基础之间选择性引起。与此同时, CaCCinh-A01抑制活性可能与ANO1的Ca2+激活特性有关, 其对其他钙激活离子通道也具有一定作用, 目前难以确定ANO1调节剂的各种药理作用是否只与ANO1蛋白有关。
此外, ANO1蛋白与其他蛋白的相互作用机制也未得到阐明, 在ANO1参与的多种生理功能中, 可能存在多种调控通路。使用ANO1调节剂治疗某种疾病时, 是否会因此产生其他不良反应, 目前仍缺少证据。
虽然ANO1研究中存在许多问题亟待解决, 但在疾病的治疗中ANO1调节剂存在的巨大应用潜力仍然极具“诱惑”[18, 48-56]。特别是对于疼痛治疗, 目前还未出现任何一种针对阴离子通道的镇痛药物或麻醉药物, 以ANO1为靶点的药物, 有望开启新的镇痛治疗模式。未来, 相信在结构生物学、化学生物学研究的帮助下, 人们对于ANO1蛋白的研究会越发明朗, 也会有更多高选择性的抑制剂出现, 为众多疾病的治疗带来曙光。
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