苯丙烷代谢途径可以合成包括黄酮、木质素和香豆素等在内的多种植物次生代谢产物, 是植物一条重要的次生代谢途径, 在植物的生长发育、机械支持、防御反应 (抗逆、抗病等) 以及花色形成中起着重要作用^{[1, 2]}。苯丙烷代谢途径起源于苯丙氨酸, 苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanine ammonia-lyase, PAL) 的作用下生成反式肉桂酸, 反式肉桂酸在肉桂酸-4-羟化酶 (cinnamate-4-hydroxylase, C4H) 催化下生成香豆酸, 香豆酸在4-香豆酸辅酶A连接酶 (4-coumaroyl CoA ligase, 4CL) 的作用下生产香豆酰辅酶A, 然后进入黄酮、木质素、芥子酸酯等化合物的下游合成途径 (图 1)^[3]。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 The general phenylpropanoid pathway[3]

C4H催化苯丙烷代谢途径的第二步反应, 植物中C4H基因最早从豌豆苗的顶芽中发现, 具有催化反式肉桂酸苯环第4位碳原子上形成羟基的功能^[4], 属于细胞色素P450氧化酶 (cytochrome P450, CYP450) 家族, 是CYP73亚家族成员之一^[5]。随后C4H基因从绿豆^[6]、菊芋^[5]、拟南芥^[7]、烟草^[8]和番茄^[9]等植物中被克隆, 在拟南芥中AtC4H蛋白由单拷贝基因编码, 在拟南芥生长发育以及应对环境信号中起作用^[10], 拟南芥AtC4H基因与AtPAL1、At4CL基因在mRNA水平具有类似表达模式, 不仅组织表达特异性类似, 都是在茎中表达量最高, 根和长角果次之, 叶和花中表达量最低, 而且在应对光照、机械损伤和诱导子处理时表达模式也类似, 此外AtC4H基因的启动子中也包含了AtPAL和At4CL基因的3个顺式作用元件^[7]。在番茄中同源正义超表达C4H基因, 降低了番茄茎中木质素的含量却增加了番茄果实中黄酮类化合物的含量^[9]。在逆境胁迫下, 苦荞、矮牵牛和茶树等植物中C4H基因的表达量和黄酮含量之间具有显著的相关性^[11-13]。所以, C4H是苯丙烷代谢途径中一个调节点, 在植物的次生代谢过程中起重要作用。

独行菜 (Lepidium apetalum Willd.) 是十字花科独行菜属植物, 其干燥成熟的种子称为“北葶苈子”, 是中医临床常用的泻肺平喘、利水消肿的传统中药, 对心血管、高血脂等疾病有显著的药理作用^[14]。通过对独行菜药效物质基础及作用机制进行研究, 目前已从独行菜中分离得到硫苷类、强心苷类、生物碱类、黄酮类、香豆素类等多种成分^[15], 其中黄酮类成分以槲皮素、异鼠李素、山柰酚为主^[14], 黄酮类成分具有抗心脑血管疾病、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等药理作用, 是独行菜重要的药效物质基础之一^[16]。目前独行菜的研究多集中在化学成分的分离、药理作用以及低温胁迫等方面, 且已有良好的研究基础, 但是关于独行菜黄酮类化合物的生物合成途径及关键基因研究较少, Zhou等^[17]利用转录组高通量测序分析了可能参与独行菜次生代谢产物合成和代谢的基因, 其中参与苯丙氨酸代谢途径的unigene有92个。目前已见报道独行菜基因克隆有种皮黏液质基因MUM4、TTG1基因^{[18, 19]}, 以及植物低温胁迫相关的CBF (C-repeat binding factor) 基因^[20]等, 独行菜次生代谢产物生物合成途径中关键基因的克隆报道较少, Ma等^[21]克隆了独行菜二萜类化合物生物合成途径的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶 (geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPS) 基因, 并对LaGGPS基因进行了生物信息学分析和原核表达。目前, C4H基因已从拟南芥等多种植物中克隆, 而独行菜中C4H基因还未见报道, LaC4H基因的表达量与独行菜黄酮含量的相关性也有待研究。本研究从独行菜中克隆了参与黄酮类化合物生物合成途径C4H基因的cDNA序列, 命名为LaC4H, 进行了生物信息学分析, 原核表达、纯化和组织特性分析, 还分析了独行菜在茉莉酸甲酯 (methyl jasmonate, MeJA) 诱导下LaC4H的表达水平与总黄酮含量变化趋势的相关性, 这为进一步研究LaC4H基因在独行菜黄酮类化合物生物合成中的功能奠定了基础。

材料 独行菜种子采自河南省伏牛山自然保护区, 由河南中医药大学董诚明教授鉴定为十字花科独行菜属植物独行菜干燥成熟的种子, 将种子在人工气候箱中培养, 培养条件为16 h/23 ℃光照, 8 h/20 ℃黑暗。种子萌发培养45天待独行菜开花后, 采集独行菜的根、茎、叶和花, 液氮速冻, 保存于-80 ℃冰箱, 用于组织特异性分析。种子萌发培养30天后, 喷洒MeJA诱导, MeJA工作浓度为50 μmol·L^-1, 分别于诱导后4、12、24、48和72 h取独行菜叶片, 样品经液氮速冻后保存于-80 ℃, 用于诱导表达分析。

试剂 植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化公司。反转录试剂盒、大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物公司。DNA Taq酶、限制性核酸内切酶、pMD19-T Vector、T4 DNA ligase购自TaKaRa公司。引物合成、样品测序由北京三博远志生物公司完成。原核表达载体pET-32a由本实验室保存, 其他试剂均为国产分析纯。

RNA提取及cDNA的合成 使用植物总RNA提取试剂盒提取独行菜根、茎、叶、花的总RNA, 以及MeJA诱导后不同时间点独行菜叶片的总RNA, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用反转录试剂盒, 以得到的独行菜各组织的总RNA为模板, oligo (dT)₂₀为引物, 反转录合成得到独行菜各组织的cDNA和MeJA诱导后不同时间点独行菜叶片的cDNA。

LaC4H基因克隆 通过分析实验室前期获得的独行菜转录组数据中C4H基因序列信息, 用Primer 5设计一对LaC4H基因的特异性引物: LaC4H-F (5'-TT CTGCTTGTTATTCATTCGG-3') 和LaC4H-R (5'-AG TCATTTACTTTCTTGGCTT-3'), 以反转录得到的叶片cDNA为模板, 进行PCR扩增, PCR程序为: 95 ℃ 2 min; 95 ℃ 10 s, 54.9 ℃ 15 s, 72 ℃ 1 min 42 s, 35个循环; 72 ℃延伸8 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 切胶回收与预期大小一致的条带, 通过T-A克隆将其连接到pMD19-T载体上, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 均匀涂布在LB平板 (含氨苄青霉素) 上, 37 ℃倒置培养12 h, 经菌落PCR检测后挑选阳性克隆进行测序。

LaC4H基因的生物信息学分析 将测序得到的LaC4H基因的序列信息提交到NCBI网站, 通过blastp与蛋白质非冗余数据库进行序列比对, 然后通过NCBI ORF Finder查找开放阅读框 (open reading frame, ORF)。使用ExPASy提供的ProtParam tool预测LaC4H蛋白的理化性质, 使用InterPro Scan预测保守结构域, PredictProtein预测蛋白质的二级结构, SWISS-MODEL进行蛋白质的三维同源建模, 使用SignalP 4.0 Server进行蛋白质信号肽预测, TargetP 1.1 Server进行蛋白亚细胞定位预测, 通过TMHMM Server v.2.0预测蛋白跨膜区。使用DNAMAN软件对不同植物C4H蛋白的氨基酸序列进行多序列比对分析, 使用MEGA5软件相邻连接法 (neighbor-joining) 构建系统进化树, bootstrap检验的重复次数为1 000次。

pET-32a-LaC4H原核表达载体的构建 根据LaC4H基因的测序结果和生物信息学分析结果, 设计一对LaC4H基因的原核表达引物: LaC4H-Exp-F (5'-CGGAATTCATGGACCTTCTCTTGTT-3', 下划线部分为EcoR I切位点), LaC4H-Exp-R (5'-CCGCTCGAGTTAAACGGCTCTTGGTT-3', 下划线部分为Xho I酶切位点), 以测序正确的pMD19-T-LaC4H质粒为模板, 用PrimeSTAR HS Taq扩增LaC4H基因的ORF序列, PCR程序为: 95 ℃ 2 min; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 1 min 36 s, 30个循环; 72 ℃延伸8 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 用DNA产物纯化试剂盒回收纯化目的基因, 然后用EcoR I和Xho I分别对原核表达载体pET-32a和PCR纯化产物进行双酶切, 回收载体片段和目的基因片段, 用T4 DNA ligase将双酶切后的载体片段和目的基因片段在16 ℃过夜连接, 然后将连接产物转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 均匀涂布在LB平板 (含氨苄青霉素) 上, 37 ℃倒置培养12 h, 挑单克隆摇菌提取质粒, 用EcoR I和Xho I对得到的质粒进行双酶切鉴定, 酶切鉴定正确的克隆送公司测序。

LaC4H重组蛋白的诱导表达与纯化 将测序正确的单克隆 (含pET-32a-LaC4H质粒) 接种于LB液体培养基 (含氨苄青霉素) 中, 37 ℃培养过夜后, 第2天按照1:100比例接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中, 在37 ℃、220 r·min^-1条件下培养至对数生长期 (OD₆₀₀至0.6~0.8), 加入IPTG使其终浓度为0.4 mmol·L^-1, 然后继续在28 ℃、150 r·min^-1条件下培养8 h, 诱导独行菜LaC4H重组蛋白的表达, 诱导完成后, 用SDS-PAGE (5%浓缩胶和12%分离胶) 检测重组蛋白的表达。

根据LaC4H重组蛋白的诱导条件, 大量培养大肠杆菌BL21 (DE3) 菌株 (含pET-32a-LaC4H质粒), 诱导完成后在4 ℃、8 000 × g条件下离心5 min收集菌体, 经PBS缓冲液洗涤后, 在冰浴中超声破碎大肠杆菌细胞, 大肠杆菌裂解液在4 ℃、10 000 × g条件下离心10 min, 分别收集上清液和沉淀, 将沉淀重悬于含8 mol·L^-1尿素的结合缓冲液 (20 mmol·L^-1 Tris-HCl、5 mmol·L^-1咪唑、0.5 mol·L^-1 NaCl、8 mol·L^-1尿素) 中, 使包涵体充分溶解, 10 000 × g条件下离心20 min, 收集上清液, 经0.45 µm滤膜过滤后, 利用Ni²⁺亲和色谱, 使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化LaC4H重组蛋白, 用不同咪唑浓度 (50、100、200、300和500 mmol·L^-1) 洗脱目的蛋白, 经SDS-PAGE检测后确定最佳咪唑洗脱浓度, 收集单一条带的目的蛋白样品, 经过透析和超滤, 得到纯化的LaC4H重组蛋白。

LaC4H组织特异性表达、诱导表达分析和独行菜叶片总黄酮含量测定 独行菜各组织的cDNA和MeJA诱导后不同时间点独行菜叶片的cDNA, 稀释10倍作为荧光定量PCR (Real-time PCR) 反应模板, 以EF-1α基因^{[22, 23]}为内参检测LaC4H基因在独行菜各组织的表达量 (正向引物: 5'-CAAGAGGCCATCA GACAAGC-3';反向引物: 5'-TACCTGTCTCAACAC GTCCC-3'), LaC4H基因RT-PCR正向引物 (5'-GA AGCTGTCCCGGGATCATA-3')、反向引物 (5'-AGC TCGAAGTTCTGGACCAA-3'), 每个样品重复3次, RT-PCR反应体系为: 10 μL 2 × QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN)、正反向引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL、加ddH₂O至20 μL, 反应程序为: 95 ℃预变性3 min, 95 ℃变性10 s, 56 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循环, 根据熔解曲线判断RT-PCR产物的特异性, 相对定量分析采用2^-ΔΔCt方法^[24], 实验数据用统计分析软件SPSS 16.0进行单因素方差分析, 分析LaC4H基因组织特性表达时以独行菜叶片Ct值的平均数设为l, 分析LaC4H基因诱导表达时以0 h叶片Ct值平均数设为l。

参照Zheng等^[25]的方法, 采用紫外分光光度法测定MeJA诱导后48 h和72 h独行菜叶片总黄酮含量, 以芦丁为标准品绘制标准曲线并计算回归方程, 测定样品中总黄酮含量 (mg·g^-1 DW), 每个样品重复3次, 实验数据用SPSS 16.0进行单因素方差分析。

通过分析本实验室前期获得的独行菜转录组数据, 发现一个注释为肉桂酸-4-羟化酶 (C4H) 的转录本, 长度为1 639 bp, 利用NCBI ORF Finder分析显示其包含一个完整的ORF, 根据该基因的序列信息, 设计一对特异性引物, 以独行菜叶片cDNA为模板, 进行PCR扩增, PCR产物约为1 600 bp, 与预期大小相符, 电泳结果如图 2所示。将PCR产物连接到pMD19-T载体上, 测序后获得独行菜LaC4H基因的cDNA序列, 大小为1 639 bp, 包含LaC4H基因完整的ORF序列, 大小为1 518 bp, 位于90~1 607 bp区域, 编码505个氨基酸, LaC4H基因cDNA的序列信息已提交到NCBI Genbank, 登录号为KX064050, LaC4H基因cDNA的核苷酸序列及对应氨基酸序列如图 3所示。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 PCR amplification of LaC4H gene. M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of LaC4H gene

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Nucleotide sequence and amino acid sequence of LaC4H gene cDNA. The marker "*" represents termination codon, the left number indicates nucleotide position, the right number indicates amino acid position, the bold italic lowercase letters represent cloning primer sequences of LaC4H gene

使用ExPASy Proteomics Server的在线软件ProtParam tool预测LaC4H蛋白的分子质量为57.73 kD, 等电点是9.04, 分子式为C₂₆₂₂H₄₁₅₀N₇₁₄O₇₂₁S₁₆, 带负电荷的残基 (Asp+Glu): 61, 带正电荷的残基 (Arg+Lys): 68, 不稳定系数为43.13, 说明该蛋白属于不稳定蛋白。

使用InterProScan预测的LaC4H蛋白的保守结构域为细胞色素P450结构域 (cytochrome P450) (IPR001128), 此外LaC4H蛋白还有1个保守位点, 位于多肽链C端的细胞色素P450保守位点 (440~449位氨基酸残基, IPR017972), 说明LaC4H蛋白属于细胞色素P450超家族成员。

使用SignalP预测LaC4H蛋白有信号肽的概率是0.296, 在第20位和21位氨基酸之间断裂的概率为0.303, 但是未达到阈值。利用在线软件TargetP预测LaC4H蛋白的亚细胞定位, 结果表明LaC4H蛋白属于分泌途径, 可能定位于内质网, 同时预测结果也显示LaC4H蛋白的N末端有20个氨基酸组成的一段疏水性α-螺旋结构, 可以将其锚定在内质网膜上。利用TMHMM预测LaC4H蛋白的跨膜区, 结果表明LaC4H蛋白在N末端1~20位氨基酸组成一个跨膜区。

用PredictProtein对LaC4H蛋白的二级结构进行预测, 结果显示在该蛋白中α-螺旋和无规则卷曲是其主要结构元件, α-螺旋占50.50%, 无规则卷曲占41.19%, β-折叠占8.32%。用SWISS-MODEL预测LaC4H蛋白的三维结构, 以人的细胞色素P450 2A6 (human cytochrome P450 2A6) (PDB ID: 3EBS) 为模板, 序列一致性为25.22%, 在第30~503位氨基酸建模, 模型覆盖率90%, 根据预测结果, LaC4H蛋白可能以单体的形式发挥作用 (图 4)。

Figure 4

Figure 4

图 4 Prediction of three-dimensional structure of LaC4H protein

将LaC4H蛋白的氨基酸序列提交NCBI网站通过blastp比对nr非冗余蛋白数据库, blastp比对结果显示LaC4H蛋白与其他植物的C4H蛋白有广泛的同源性, 与拟南芥 (Arabidopsis thaliana, AtC4H, AAC99993.1)、油菜 (Brassica napus, BnC4H, XP_013748807.1)、烟草 (Nicotiana tabacum, NtC4H, ABC69413.1)、丹参 (Salvia miltiorrhiza, SmC4H, AJD25173.1)、马铃薯 (Solanum tuberosum, StC4H, ABC69046.1)、亚洲棉 (Gossypium arboreum, GaC4H, AAG10196.1) 等植物C4H蛋白氨基酸序列的一致性分别为96%、95%、88%、88%、87%、87%。将独行菜LaC4H蛋白与这6种植物C4H蛋白的氨基酸序列进行多序列比对, 结果见图 5, 可以看出LaC4H蛋白与其他植物的C4H蛋白一样, 具有P450保守序列, 如PFGVGRRSCPG (血红素结合域, 含有保守的FxxGxRxCxG序列) 和PPGPMPIP [富含脯氨酸的保守区, (P/I) PGPx (G/P) xP序列], 同时LaC4H具有CYP73A1的6个特征性底物结合位点 (substrate recognition sites, SRS) 的5个 (SRS1、SRS2、SRS4、SRS5和SRS6)^[26]。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Multiple sequence alignment of LaC4H and C4H from other plant species. The P450 conserved sequences are boxed in black and the underlined regions represent the 5 SRSs; At: Arabidopsis thaliana; Bn: Brassica napus; Ga: Gossypium arboreum; Nt: Nicotiana tabacum; Sm: Salvia miltiorrhiza; St: Solanum tuberosum

从NCBI blastp的比对结果中选取来源于其他植物的20条C4H蛋白质序列, 包括药用植物丹参、银杏等, 模式植物拟南芥、水稻、玉米等, 以及苔藓植物小立碗藓和蕨类植物卷柏等绘制系统进化树 (图 6)。从图 6中可以看出LaC4H与来源于十字花科植物的拟南芥和油菜的C4H处于同一分支上, 亲缘关系较近, 然后与丹参、亚洲棉、烟草、马铃薯、葡萄等植物的C4H聚为一类, 都是被子植物的双子叶植物 (图 6Ⅰ); 水稻、玉米、小麦和高粱等禾本科植物的C4H聚为一类, 都是被子植物的单子叶植物 (图 6Ⅱ); 银杏、北美云杉、海岸松和火炬松的C4H聚为一类, 属于裸子植物 (图 6Ⅲ); 小立碗藓和香鳞毛蕨、江南卷柏在生物进化上较为原始, 这3种植物的C4H聚为一类, 分别属于苔藓植物和蕨类植物 (图 6Ⅳ和Ⅴ)。

Figure 6

Figure 6

Figure 6 Phylogenetic tree analysis of LaC4H protein with other plant C4H proteins. Ⅰ: Dicots; Ⅱ: Monocots; Ⅲ: Gymnosperms; Ⅳ: Mosses; Ⅴ: Ferns. The accession numbers are showed after the name of species, bootstrap values of the nodes represent the percentage drawn from the bootstrap test

用EcoR I和Xho I分别对原核表达载体pET-32a和带有酶切位点的PCR纯化产物进行双酶切, 利用重组DNA技术, 构建原核表达载体pET-32a-LaC4H, 然后转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 挑单克隆经菌落PCR鉴定后, 提取质粒用EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定, 结果见图 7, 电泳结果显示有6 000 bp左右的载体条带和1 500 bp左右的目的基因条带。将双酶切鉴定正确的单克隆送测序公司测序, 结果显示重组质粒pET-32a-LaC4H中LaC4H的序列与目的基因LaC4H的ORF序列一致, 未发生碱基突变、插入和缺失突变, 说明原核表达载体pET-32a-LaC4H成功。

Figure 7

Figure 7

Figure 7 Identification of prokaryotic expression vector pET-32a-LaC4H with double digestion. M: DL10000 DNA marker; 1: Double digestion results by EcoR I and Xho I

将测序正确的pET-32a-LaC4H质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 后, 当大肠杆菌生长至OD₆₀₀为0.6~0.8时, 在28 ℃、0.4 mmol·L^-1 IPTG、150 r·min^-1条件下诱导培养8 h, 对诱导前后的大肠杆菌总蛋白进行SDS-PAGE分析。含pET-32a-LaC4H质粒的表达菌株经IPTG诱导后, 在约75 kD处出现目的蛋白条带 (图 8A), 因为LaC4H蛋白在进行原核表达时, 其N-末端融合了pET-32a载体的标签序列 (Trx-Tag、His-Tag和S-Tag), 分子质量应为77.73 kD。超声破碎菌体后取上清液和沉淀进行蛋白可溶性检查, 结果显示LaC4H重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中 (图 8A)。含pET-32a空载体的菌株经IPTG诱导后, 未在75 kD处出现条带, 而在20 kD处出现条带, 因为pET-32a空载体的标签序列 (Trx-Tag、His-Tag和S-Tag) 在IPTG诱导时也会表达融合蛋白, 大小约为20 kD (图 8B)。结果表明, LaC4H蛋白成功在大肠杆菌BL21 (DE3) 菌株中表达。

Figure 8

Figure 8

Figure 8 SDS-PAGE analysis of recombinant LaC4H protein. A: The solubility analysis of recombinant LaC4H protein (M: Protein marker; 1: Uninduced E. coli containing pET-32a-LaC4H; 2: Induced E. coli containing pET-32a-LaC4H; 3: Soluble protein from induced E. coli containing pET-32a-LaC4H; 4: Insoluble fraction from induced E. coli containing pET-32a-LaC4H. The arrows show the recombinant LaC4H proteins). B: Prokaryotic expression and purification of recombinant LaC4H protein (M: Protein marker; 1: Uninduced E. coli containing pET-32a; 2: Induced E. coli containing pET-32a; 3: Uninduced E. coli containing pET-32a-LaC4H; 4: Induced E. coli containing pET-32a-LaC4H; 5: The purified recombinant LaC4H protein. The arrows show the recombinant LaC4H proteins)

根据LaC4H重组蛋白的诱导条件, 扩大培养体积, 用超声裂解菌体, 裂解液经离心取沉淀, 将沉淀溶于含8 mol·L^-1尿素的结合缓冲液后, 利用Ni²⁺亲和色谱, 采用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化LaC4H重组蛋白, 最终得到纯化的LaC4H重组蛋白 (图 8B)。

利用荧光定量PCR检测LaC4H基因的组织特异性表达, 结果显示LaC4H基因在独行菜所有组织中均有表达, 在茎中表达最高, 叶和花中次之, 根中表达量最低 (图 9A)。MeJA诱导后独行菜叶中LaC4H基因在不同时间的表达水平, 结果见图 9B, 经MeJA诱导后, LaC4H表达量上升, 4 h的表达量是0 h表达量的3.57倍, 随后在12 h和24 h表达量下降, 在诱导后48 h达到最高值, 是0 h表达量的8.30倍, 到72 h LaC4H表达量仅为0 h的1/2。MeJA诱导后LaC4H的表达模式可能与叶中黄酮的积累有关, 通过测定48 h、72 h对照组与MeJA处理组叶中黄酮的含量, 发现对照组在48 h和72 h黄酮含量没有明显变化, 而MeJA处理组在48 h黄酮含量为21.15 mg·g^-1 DW, 比对照组提高了43.40% (P < 0.05), 在72 h MeJA处理组黄酮含量为12 mg·g^-1 DW, 比对照组下降了13.23% (图 9C)。

Figure 9

Figure 9

Figure 9 Relative expression level of LaC4H and flavonoids content. A: Relative expression level of LaC4H in different tissues of L. apetalum. P < 0.05; B: Relative expression level of LaC4H in leaves of L. apetalum after MeJA treatment. P < 0.05; C: Flavonoids content in leaves of L. apetalum at 48 h and 72 h after MeJA treatment. P < 0.05. Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level

黄酮类化合物作为独行菜重要的药效物质基础之一, 具有显著的药理活性, 在植物体内主要通过苯丙烷代谢途径合成, 肉桂酸-4-羟化酶 (C4H) 是植物苯丙烷代谢途径中的第2个关键酶, 该酶在植物中的含量可以影响黄酮、香豆素和木质素等次生代谢产物的合成代谢^[27]。本研究从独行菜幼苗的叶片中克隆了LaC4H基因, 通过保守结构域预测发现LaC4H蛋白含有CYP450的保守结构域以及特征性的底物结合位点^[26], 通过氨基酸序列比对结果发现LaC4H蛋白与其他植物C4H蛋白的序列高度同源, 属于CYP450家族成员。在逆境胁迫下 (如UV-B胁迫), 苦荞和矮牵牛中C4H等基因表达量的增加使得植物组织中黄酮积累量增加, 以应对逆境胁迫^{[11, 12]}。如果在拟南芥中AtC4H基因突变, 会影响苯丙烷代谢途径, 最终导致木质素含量降低, 此外还会引起拟南芥雄性不育、植株矮小等发育问题, 说明AtC4H基因对拟南芥正常的发育过程是必须的^[3]。所以LaC4H蛋白可能在独行菜黄酮类化合物的生物合成过程中发挥作用, 具有重要的研究意义。植物黄酮类化合物的生物合成一般定位于内质网外膜上, 经生物信息学分析, LaC4H蛋白的N末端, 可能由20个氨基酸组成的一段跨膜区, 将C4H和PAL、4CL形成的多酶复合物锚定在内质网外膜上, 参与黄酮类化合物生物合成途径的催化反应^[28]。植物C4H基因的表达具有组织特异性, 拟南芥AtC4H在茎中表达量最高、根中次之、叶和花中最少^[7], 油菜BnC4H在茎、叶和花中表达量较高, 根和种子中表达量较低^[29]。荧光定量PCR结果显示LaC4H在独行菜的所有组织中均有表达, 在独行菜茎中的表达量最高, 叶和花中次之, 根中表达量最低, 这与拟南芥和油菜中的研究结果相符, LaC4H在茎中表达量最高可能和茎中的维管组织需要合成较多的木质素单体最终形成木质素有关, LaC4H在叶和花中表达量次之说明独行菜叶和花会积累较多的黄酮类化合物。

MeJA作为一种在植物体内广泛存在的植物激素, 作为信号分子参与植物的抗逆反应 (如病虫害、机械伤害、低温、干旱等), 还能够提高植物次生代谢水平, 增加黄酮、三萜等次生代谢产物的积累^{[30, 31]}。有报道MeJA能够诱导人参中三萜类化合物的生物合成途径, 增加其药效物质人参皂苷的含量^[31]。在贯叶金丝桃的悬浮培养细胞中加入MeJA, 能够增加悬浮细胞中黄酮的含量^[30]。所以推测MeJA能够诱导独行菜黄酮类化合物的生物合成途径, 提高黄酮的含量, 通过检测MeJA诱导后独行菜叶中LaC4H基因的表达量和黄酮的含量, 发现诱导后LaC4H表达量上升, 随后12 h和24 h表达量有所下降, 到48 h表达量达到最高值, 在48 h MeJA处理组的黄酮含量比对照组提高了43.40%, 而到72 h LaC4H的表达量下降到0 h的1/2, 而且MeJA处理组的黄酮含量比对照组下降了13.23%, 说明独行菜叶片中LaC4H的表达量与黄酮积累量之间呈正相关, 这些结果都说明LaC4H与独行菜黄酮类化合物的生物合成途径相关。

本研究首次在大肠杆菌中表达了独行菜LaC4H蛋白, 希望在蛋白水平研究独行菜LaC4H蛋白的生物学功能。Zhang等^[32]通过构建pET-32a-SmC4H表达载体, 成功诱导表达了丹参SmC4H蛋白, 但是表达的C4H蛋白以包涵体的形式存在。Zeng等^[33]以pET6×HN为载体, 在大肠杆菌Transetta (DE3) 中诱导表达了桂花OfC4H蛋白, 但是表达的OfC4H融合蛋白的溶解度很低, 主要以包涵体形式存在。本研究通过构建原核表达载体pET-32a-LaC4H, 成功在大肠杆菌BL21 (DE3) 菌株中表达了独行菜LaC4H蛋白, 但是重组蛋白LaC4H在表达菌中主要以不溶的包涵体形式存在, 这可能是由于LaC4H蛋白的N末

端含有一段作为锚定信号的跨膜区, 导致错误的蛋白折叠, 最终使LaC4H重组蛋白在大肠杆菌中以不溶的包涵体形式存在^[34], 而且在大肠杆菌表达系统中不存在维持C4H蛋白催化活性必须的NADPH-细胞色素P450还原酶 (cytochrome P450 reductase, CPR), 会造成表达的CYP450蛋白没有活性, 最终导致CYP450蛋白以包涵体的形式存在, 如果要在大肠杆菌中表达有生物学活性的C4H蛋白并且进行功能分析, 就需要构建C4H和CPR融合蛋白, 使这两种酶在大肠杆菌中共同表达, 利用这种方法, 成功在大肠杆菌中表达了长春花C4H蛋白并进行了功能鉴定^[35]。在酵母表达系统中, 酵母具有内源性CPR, 可以使电子向CYP450蛋白传递, 所以CYP450蛋白可以在酵母系统中进行表达并且具有催化功能, 目前利用酵母表达系统成功表达了50个以上的植物CYP450蛋白并进行功能鉴定^[36]。Yao等^[37]利用pYES-CsC4H真核表达载体成功在酿酒酵母中表达了茶树的C4H蛋白并且获得了有生物学活性的茶树C4H蛋白。此外还有利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达CYP450蛋白并且进行功能鉴定, 但是昆虫表达系统操作程序复杂, 对技术要求比较高, 目前酵母表达系统仍然是CYP450蛋白的主要表达系统。下一步研究可以通过包涵体溶解与复性的方法, 或者利用酵母真核表达系统表达LaC4H蛋白, 获得有活性的LaC4H蛋白, 在体外研究其酶学特征及催化活性, 也可以将纯化的LaC4H重组蛋白制备多克隆抗体, 研究LaC4H在独行菜蛋白水平的表达情况, 为进一步研究LaC4H基因在独行菜黄酮类化合物生物合成途径中的功能奠定基础。