1 研制与外周血管形成相关的多重激酶抑制剂

肿瘤发生和生长需要形成新生血管以提供氧和营养物, 抑制血管生成可使肿瘤萎缩, 因而是药物治疗实体瘤的重要环节。血管内皮生长因子 (VEGF) 引起其受体VEGFR的信号转导, 在血管形成过程中起关键作用, 因而最先成为肿瘤药物治疗的靶标, 已经上市的小分子药物索拉菲尼 (1, sorafinib) 和舒尼替尼 (2, sunitinib) 就是VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。另一个与血管生成相关的靶标是血小板来源的生长因子 (PDGF) 及其相应受体 (PDGFR), 通过调控血管周细胞的增殖促进血管形成和稳定化。

第三个与血管形成相关的重要环节是成纤维细胞生长因子 (FGF) 及其相应受体FGFR。当肿瘤细胞的VEGFR通路受到抑制, 会采取逃逸机制, 将VEGFR通路转轨到FGFR通路, 以继续存活。所以单打一的策略对肿瘤的抑制有局限性, 而同时抑制VEGFR、PDGFR和FGFR的多靶标化合物, 会是更强效且不易产生耐药的抗肿瘤药物。勃林格殷格翰公司研究的初期只是以VEGFR为靶标, 后来拓展成基于3个受体激酶的多靶标抑制剂。

2 评价活性的模型

用于通量筛选和初筛的体外模型, 是用VEGFR-2胞浆内激酶的结构域797~1335片段克隆到与谷胱甘肽-S转移酶 (GST) 融合的pFastBac蛋白上, 表达于SF-9昆虫细胞中, 经提取构建成筛选模型, 测定化合物对酶提取液的抑制活性 (IC₅₀值)。对细胞的抑制活性是用VEGF刺激人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 测定半数抑制浓度 (IC₅₀值)。实验表明, 化合物抑制HUVEC细胞增殖的活性与抑制VEGFR的活性具有相关性, 提示对HUVEC细胞的抑制是由于抑制VEGFR-2激酶而引起的。

3 先导化合物

通过高通量筛选公司的化合物库, 并对曾是为了研发依赖于细胞周期蛋白4 (CDK4) 激酶抑制剂而合成的、但未呈现CDK4抑制活性的化合物进行筛选, 发现母核为吲哚啉酮的化合物3对VEGFR2有较高的抑制活性, IC₅₀ = 763 nmol·L^-1, 抑制HUVEC细胞的活性IC₅₀ = 342 nmol·L^-1。化合物3对CDK4没有抑制作用, 对其他激酶的活性也非常弱, IC₅₀ > 10 μmol·L^-1。因为对VEGFR-2激酶较强的特异性抑制作用, 被确定为先导化合物。

3.1 先导物的结构特征分析

粗略地看化合物3与2相当类似:共有的吲哚啉酮母核, 经反式双键连接的芳香环, 后者引出碱性端基。但仔细分析3的结构与2有异同。相同处是吲哚啉酮的内酰胺经两个氢键结合于铰链区; 不同处是6位的氨酰基可能处于一个特异性腔内, 履行选择性结合的职能; 未取代的苯环可能结合于ATP核糖所处的腔内; 哌啶环未必在结合腔内。这些估计, 后经分子模拟和合成-测定-构效分析得到了验证, 深化认识了各个部位结构的作用。图 1是这些分析和验证的示意图。

3.2 6-氨酰基的特异性作用

去除6-氨酰基的化合物活性降低2倍。将氨基更换为取代的苯胺, 活性都显著降低。若将氨酰基由6位移至5位, 失去活性, 这些提示6-氨酰基吲哚啉酮似乎是不可改动的。

3.3 分子模拟:化合物3的结合特征

为了揭示化合物3与激酶的结合方式和其中6-氨酰基的结合特征, 采用了分子模拟和计算化学方法。由于当时尚未解析VEGFR-2结构, 用同源模建方法由已知VEGFR-1的结构构建了VEGFR-2三维结构, 并根据多数激酶的杂环占据活性中心ATP的嘌呤环所处的位置, 定位了3的吲哚啉酮的位置和取向。分子模拟的结果如下: ① 吲哚啉酮环与疏水性氨基酸Lys868、Val919和Phe1047构成的疏水腔发生疏水-疏水相互作用; ② 1, 2位内酰胺与激酶铰链区的氨基酸发生两个氢键结合: C=O与Cys919的NH以及NH与Glu917的氧原子形成氢键; ③ 6-氨酰基进入ATP所处的疏水腔内, 该特异性疏水腔由Val916和Lys868把守门户, Lys8686与酰基形成氢键结合; ④ 末端的哌啶环未与激酶接触, 处于水相介质中。图 2是化合物3与VEGFR2激酶分子模拟的示意图。以上提示1, 2和6位形成多个氢键以及亲脂性母核有利于提高活性和选择性; 末端的碱性基团可以变换以调整物化性质。

4 先导物的优化—构效关系研究 4.1 6位氨酰基的变换

前述的6位氨酰基对活性影响很大, 分析H₂NCO-片段具有亲水性 (π =-1.49), 却处于疏水腔内, 应是不适宜的, 为了增加亲脂性, 氨基上连接烷基以探究对活性的影响, 合成了化合物4~7, 结果活性显著减弱, 可能是由于体积增大, 该特异的疏水腔容纳不下, 产生位阻的缘故。将6-氨酰基“调转方向”成乙酰氨基 (π =-0.97), 化合物8完全失去活性。变换成乙酰基 (9, π =-0.55) 活性仍然很低, 再增加脂溶性, 如6-羧甲酯 (10, π =-0.01) 和6-羧乙酯 (11, π = 0.51), 活性提高, 超过了化合物3, 推测是亲脂性提高而体积并未加大, 还保留了氢键接受体C=O基团。此外, 氯或比较简单的基团如氨基或氰基化合物 (12~14) 的活性都强于3, 6-硝基化合物 (15) 活性最强。表 1列出了变换6位取代基化合物的结构和活性。

综合分析表 1这些有代表性的化合物的构效关系, 提示6位取代基对活性的影响含有多种因素:基团尺寸、疏水性、氢键形成能力等对结合力有多重复杂影响, 构成“陡峭”的构效关系。但6位的电性效应对活性的影响较小, 推论6位的推拉电子效应对1和2位的氢键形成没有显著变化。

其中两个活性最强的是化合物15和10, 对VEGFR2的IC₅₀分别是7和36 nmol·L^-1, 抑制HUVEC细胞的活性IC₅₀分别是60和103 nmol·L^-1。然而15和10都有缺点, 硝基在体内可发生多种代谢产物, 有潜在的不良反应; 羧酸酯可能发生水解作用, 都涉及药代的成药性问题。氯取代的化合物12抑制细胞活性较强, 但对其他激酶有脱靶作用 (off-targeting), 故不可取。

10优于所有合成的化合物在于对于PDGFR和FGFR激酶也有强效抑制活性, IC₅₀分别是54和71 nmol·L^-1, 但对其他23种激酶没有抑制作用, 提示6位酯基取代选择性较强。虽然化合物10存在发生水解的羧酸酯基, 但灌胃小鼠的药代实验结果尚可 (灌胃50 mg·kg^-1, C_max 952 ng·mL^-1, t_1/2 3.5 h, AUC 5 246 ng·3 h·mL^-1), 因此确定化合物10作为新一轮优化的先导物。

4.2 新一轮的优化

继续进行结构优化的目标是对3个靶标VEGFR、PDGFR和FGFR激酶都要有较高抑制活性, 而对其他激酶 (off-target) 没有或低活性, 还需有良好的物理化学性质和药代动力学性质。优化的策略是以化合物10为起始物, 变换连接于苯胺对位的碱性片段 (哌啶环) 和连接基 (亚甲基), 与双键连接的苯基保持不变。

分子模拟显示哌啶环处于活性部位以外的水相中, 由于没有与激酶结合, 可以对该片段做较大的变换, 合成了长度不同的碱性链16~20。这些化合物对3种酶和对细胞的抑制活性都比较高。化合物21没有碱性氮原子仍然有高活性, 提示侧链上带有碱性基团并不是呈现活性的必要前提 (但对成盐性和调整物化性质很重要)。化合物23和24的侧链尺寸较小, 活性显著降低或失去活性。侧链上有含氮杂环的化合物25~27都呈现活性, 活性强弱的结构差异在下节讨论。表 2列出了变换碱性侧链的化合物及其活性。

4.3 候选化合物的确定——尼达尼布的上市

综合分析表 1和表 2所列的有代表性化合物的构效关系, 可以归纳出的规律性结论较少, 即或经分子模拟的微观分析, 也难以对多数化合物的活性强弱 (或有无) 做出理性的解释, 何况同时对3个靶标的作用。一方面说明影响这些靶标的结构因素的复杂性, 也说明现阶段的计算生物学存在局限性, 回顾性解释多于前瞻性的预测。

上述高活性化合物群中存在一个现象就是化合物20、21和22之间以及25和26之间的的构效关系。当与苯胺环相连的4位为叔氮原子, 活性显著高于相应的仲氮相连的化合物, 如20和21强于22; 25强于26。叔氮原子引出的侧链与苯胺的环平面呈垂直取向, 仲氮原子连接的侧链与苯胺的共面性几率较大, 推论侧链在空间的取向对活性是有影响的, 侧链与环系呈垂直取向的活性强于侧链与环的共面性。

这样, 候选化合物的选择更集中在20和25, 不仅是由于对VEGFR、PDGFR和FGFR激酶以及HUVEC细胞的高抑制活性, 而且对常见的23种激酶的活性很弱, 预示有较少的脱靶作用。20和25可抑制多种移植人肿瘤的裸鼠肿瘤生长, 小鼠灌胃也有良好的药代动力学性质。

化合物25还对Src家族的激酶有抑制作用, 对Flt-3激酶的IC₅₀ = 26 nmol·L^-1, 预示可能对急性髓细胞白血病有治疗效果。全面综合考虑, 确定25为候选药物, 公司代码为BIBF1120, 通用名为尼达尼布 (nintedanib)。

尼达尼布大鼠和猕猴的口服生物利用度 (F) 分别为12%和24%, 半衰期t_1/2分别为4和7.1 h。口服生物利用度低的原因主要是首过效应酯水解缘故 (Roth GJ, Heckel A, Colbatzky F, et al. Design, synthesis, and evaluation of indolinones as triple angiokinase inhibitors and the discovery of a highly specific 6-methoxycarbonyl-substituted indolinone (BIBF 1120). J Med Chem, 2009, 52: 4466-4480)。

该项目自1998年启动, 2001年即确定尼达尼布为候选化合物, 经临床前和临床研究, 长时间大规模的一波三折的临床研究, 说明了创新药物的艰辛与风险, 直到2015年FDA批准上市, 目前的适应症是治疗非小细胞肺癌和特质性肺纤维化病 (IPF), 后者是FDA首次同年批准的两个治疗IPF小分子药物之一 (另一个药物是吡非尼酮) (Roth GJ, Binder R, Colbatzky F, et al. Nintedanib: from discovery to the clinic. J Med Chem, 2015, 58: 1053-1063)。

5 尼达尼布与VEGFR的结合特征和持续的抑制作用

X-射线研究与VEGFR2复合物单晶结构表明, 尼达尼布结合于ATP结合位点, 定位于激酶的N末端和C末端结构域之间的裂隙处 (图 3), 连接有甲酯基的吲哚啉酮环处于疏水性氨基酸构成的疏水腔内, 内酰胺的-CO-NH-分别与铰链上的氨基酸Cys919和Glu917残基形成氢键, 这与前面叙述的分子模拟的结果相一致。甲基哌嗪环的位置与前述的哌啶环相同, 进入到水相中, 只是4位氮原子与Glu850的羧基的两个氧原子形成二齿性离子键, 距离分别为3.2和3.3 ,增加了结合强度, 这一点在分子模拟中因化合物3是哌啶环, 不可能预测到这种结合。

尼达尼布与激酶结合的另一个特征是持续性抑制作用。用VEGFR2转染的细胞脉冲追踪 (pulse-chase) 实验证明, 细胞暴露于尼达尼布1 h后彻底洗除药物, 继续温孵细胞8、24和32 h, 之后用VEGF刺激细胞, Western印迹分析表明, VEGFR2受体的磷

酸化一直处于被抑制状态 (32 h以上)。推测是尼达尼布在细胞内酯基被水解, 游离酸难以穿越细胞膜逃逸, 被封闭在胞内。由于游离酸活性也很高 (IC₅₀ = 62 nmol·L^-1), 这或许是其持续性抑制的原因之一 (Hilberg F, Roth GJ, Krssak M, et al. BIBF1120: triple angiokinase inhibitor with sustained receptor blockade and good antitumor efficacy. Cancer Res, 2008, 68:4774-4782)。笔者认为也可能有其他因素。一是尼达尼布与酶的强力结合 (IC₅₀ = 5 nmol·L^-1), 几乎成为不可逆状态, 类似于共价键结合导致的持续抑制状态。也可能由于生成的酶-尼达尼布复合物具有慢离解速率常数, 即或介质中已不存在药物, 因药物有较长的驻留时间 (residence time) 使酶分子持续处于与抑制剂结合状态。这需要结合动力学实验证明。