2017, Vol. 52
氯氮平 (clozapine, CLZ) 属于苯二氮类药物, 是第一个非典型的抗精神病药物, 于1958年在瑞典首先被发现, 1972年在奥地利和瑞典上市[1, 2]。此后我国引进该药, 因其抗精神病作用强、作用谱广、起效快, 尤其是锥体外系不良反应少、价格便宜而在精神科广泛使用[3]。但其风险和疗效并存, 临床观察发现其诱发肝脏损伤的发生率高达37%, 主要临床表现为转氨酶水平升高[4, 5]。因此, 有效防治氯氮平的肝毒性是其临床使用亟需解决的问题。大量研究表明, 氯氮平主要通过活性代谢产物 (reactive metabolites, RMs) 引发肝脏毒性 (图 1)。氯氮平可在细胞色素P450酶 (cytochrome P450, CYP450) 作用下, 产生活性代谢产物胺正离子[6, 7]: ①其具有自由基特征, 可致细胞内氧化还原水平失衡, 发生氧化应激损伤, 继而诱发不良反应[6]; ②该胺正离子还可与内源性蛋白质结合形成具有免疫原性的自身抗原, 导致特异质不良反应[7]。值得注意的是, 该胺正离子可在谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 作用下与谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 结合, 发生代谢解毒。因此, 增加胺正离子的清除能力和提高机体抗氧化应激损伤能力是减轻氯氮平肝毒性不良反应的途径之一。
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Figure 1 The mechanism of adverse reactions of clozapine (CLZ) |
转录因子NF-E2相关因子 (NF-E2-related factor2, Nrf2) 是细胞抗氧化反应的中枢调节者, 通过与抗氧化反应元件 (antioxidant response element, ARE) 相互作用上调抗氧化酶[如过氧化氢酶 (CAT) 和过氧化物歧化酶 (SOD)]和Ⅱ相代谢酶 (如GST) 的表达, 增强细胞清除氧自由基 (reactive oxygen species, ROS) 的能力, 使细胞维持氧化还原平衡状态, 降低氧化损伤[8]。因此, Nrf2/ARE抗氧化系统传导通路可能是极具临床意义的氯氮平肝毒性防护靶点。五味子乙素 (schizandrin B, Sch B, 图 2) 是从中药五味子中分离出的主要保肝活性成分之一。研究显示其可通过激活Nrf2/ARE信号通路[9, 10], 上调GST、醌氧化还原酶[NAD (P) H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]和血红素氧合酶1 (heme oxygenase 1, HO-1) 等抗氧化酶的表达, 起到清除ROS和抑制脂质过氧化, 进而发挥肝保护作用[11]。本文建立了氯氮平诱导小鼠慢性肝损伤模型, 旨在研究Sch B能否缓解CLZ引起的肝损伤, 并探讨其保护作用机制是否与Nrf2/ARE信号通路相关, 为减轻氯氮平临床使用中的不良反应提供新的研究思路。
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Figure 2 Chemical structure of schizandrin B (Sch B) |
实验材料 五味子乙素购自中国食品药品检定研究院, 纯度 > 99%。氯氮平购自江苏云阳集团药业有限公司, 纯度 > 99%。谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)、碱性磷酸酶 (ALP)、SOD、GSH及丙二醛 (MDA) 测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所; Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司; PrimeScript® RT Reagent Kit和SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ购于大连宝生物工程有限公司; Real-time PCR引物由上海生工生物工程公司合成; Nrf2抗体和山羊抗兔IgG二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司, 其他试剂为分析纯。
实验动物与饲养条件 SPF级雄性昆明小鼠, 体重 (20±2) g, 50只, 购自重庆中药研究院, 生产许可证号: SCXD (渝) 2013-0006。在恒温 (21~23) ℃、恒湿 (45%~65%), 各12 h明暗周期的饲养室, 普通饲料喂养, 自由进食和饮水。
实验设计 动物随机分组, 分别为control组 (0.9%生理盐水)、CLZ (25 mg·kg-1)、CLZ (25 mg·kg-1) + Sch B (25 mg·kg-1)、CLZ (25 mg·kg-1) + Sch B (50 mg·kg-1)、CLZ (25 mg·kg-1) + Sch B (100 mg·kg-1) 组。各组连续灌胃 (ig) 给药3周, 于末次给药晚上动物禁食不禁水, 24 h后摘眼球取血, 供测定血清生化指标。另外取肝组织固定于福尔马林液, 用于做病理切片和免疫组织化学染色。其余的肝组织用锡箔纸包好后, 液氮速冻, 转移到-80 ℃冰箱保存, 备用。
血清生化指标的检测 使用全自动生化分析仪及配套检测试剂测定各组动物的血液生化指标: ALT、AST和ALP。
肝组织生化指标的检测 称取适量的肝组织, 按重量体积比 (组织:生理盐水=1:9) 加入冰冷的生理盐水, 剪碎, 冰上匀浆, 3 000 r·min-1离心10 min, 制成10%肝组织匀浆。SOD、GSH、MDA及蛋白定量按照试剂盒说明书操作。
组织病理检查 将固定于福尔马林的部分肝大叶先用石蜡包埋, 然后进行切片, 通过常规苏木素-伊红 (hematoxylin-eosin, HE) 染色后, 在光学显微镜下观察组织病理变化。
免疫组织化学染色检测Nrf2蛋白表达 采用免疫组化S-P法, 将肝组织石蜡切片加入稀释后的Nrf2一抗4 ℃孵育24 h, 过氧化物酶 (HRP) 酶标二抗室温孵育2 h, 二氨基联苯胺显色15 min, 显微镜下观察肝组织中Nrf2表达情况。
Western blotting检测Nrf2蛋白表达 将药物处理后的细胞置于冰上, 采用蛋白提取试剂盒提取蛋白。Bradford法测定蛋白浓度, 每孔上样100 μg蛋白。12% SDS-PAGE分离样品, 转膜, 封闭。将膜溶于5% BSA中的一抗 (兔抗Nrf2单克隆抗体), 4 ℃过夜。洗膜, 将膜浸入以1:10 000稀释的二抗稀释液中, 室温孵育1 h。加入ECL试剂, 曝光、显影、定影、分析。
实时荧光定量PCR检测mRNA表达 称取适量肝组织, 剪碎, 加入Trizol 1 mL, 冰上匀浆, 提取总RNA。按逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应, 制成cDNA。所得cDNA进行实时荧光定量PCR反应, 检测HO-1和NQO1 mRNA水平的表达。引物序列均由上海生工生物工程公司合成 (表 1)。
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Table 1 The primer sequence of real-time PCR |
统计学分析 数据统计分析采用统计软件SPSS 19.0。多组间比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA), 组内两两比较采用LSD法。
结果 1 Sch B对慢性肝损伤小鼠血清ALT、AST和ALP的影响如图 3所示, 与control组相比, CLZ组小鼠的血清中ALT、AST、ALP浓度均明显升高约1.5倍。与CLZ组相比, Sch B (25和50 mg·kg-1) 治疗组实验小鼠血清中的ALT、AST和ALP浓度均有所降低。其中, 在Sch B (25 mg·kg-1) 组小鼠中, ALT浓度降低至 (33.67±4.68) U·L-1(P < 0.05), AST浓度降低至 (102.00±17.50) U·L-1(P < 0.01), ALP浓度降低至 (180.00±16.79) U·L-1(P < 0.05);在Sch B (50 mg·kg-1) 组中, ALT、AST和ALP浓度持续降低, 且与control组相当。此外, 与CLZ组相比, Sch B (100 mg·kg-1) 治疗组小鼠血清中的ALT浓度无显著性变化, AST浓度略有降低但无显著性差异, 仅ALP浓度[(158.60±17.28) U·L-1, P < 0.01]呈极显著性降低。
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Figure 3 Effects of Sch B on the activity of ALT, AST and ALP induced by CLZ in mice serum. A: Serum ALT activity; B: Serum AST activity; C: Serum ALP activity. n=8-10, x±s. #P < 0.05, ##P < 0.01; *P < 0.05, **P < 0.01. ALP: Alkaline phosphatase; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase; CLZ: Clozapine |
上述结果提示, CLZ (25 mg·kg-1) 连续给药3周后, 可引起小鼠肝脏转氨酶水平升高, 显示出肝脏毒性, 低 (25 mg·kg-1)、中剂量 (50 mg·kg-1) Sch B对CLZ导致的小鼠肝损伤具有保护作用, 而高剂量 (100 mg·kg-1) Sch B对CLZ导致的小鼠肝损伤未显示出保护作用。
2 Sch B对慢性肝损伤小鼠肝组织氧化应激指标的影响如图 4所示, 与control组相比, CLZ组小鼠的肝脏中GSH、SOD浓度均降低, 而MDA浓度升高。与CLZ组相比, 25和50 mg·kg-1 Sch B治疗组小鼠肝脏中的GSH、SOD浓度均有所升高, MDA浓度下降。其中, 在25 mg·kg-1 Sch B组实验小鼠中, GSH浓度升高至 (1.52±0.10) μg·mg-1(P < 0.01), SOD浓度升高至 (275.48±4.53) U·mg-1(P < 0.05), MDA浓度降低至 (70.78±5.65) nmol·mg-1(P > 0.05);在50 mg·kg-1 Sch B组实验小鼠中, GSH浓度持续升高至 (1.63±0.05) μg·mg-1(P < 0.01), MDA浓度持续降低至 (40.56±5.49) nmol·mg-1 (P < 0.01), 而SOD浓度并未出现持续升高。在100 mg·kg-1 Sch B组实验小鼠中, GSH和SOD均未出现剂量依赖性升高, MDA浓度也并未出现剂量依赖性降低。
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Figure 4 Effects of Sch B on GSH, SOD and MDA in liver tissue of mice caused by CLZ. A: GSH activity; B: SOD activity; C: MDA activity. n=8-10, x±s. #P < 0.05; *P < 0.05, **P < 0.01. GSH: Glutathione; MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase |
上述结果提示, CLZ (25 mg·kg-1) 连续给药3周后, 可引起小鼠肝脏中MDA水平升高, GSH和SOD水平下降, 表现出氧化应激损伤。低 (25 mg·kg-1)、中剂量 (50 mg·kg-1) Sch B可改善CLZ所引起的氧化应激水平变化, 而高剂量 (100 mg·kg-1) Sch B虽也能改善氧化应激水平, 但无明显剂量依赖性。
3 肝组织病理观察如图 5所示, 在control组中 (5A), 可见肝小叶结构清晰, 小叶内肝细胞基本正常, 门管区结构清晰, 门管区及其周围未见小胆管及纤维组织增生; 在CLZ组中 (5B), 可见肝小叶结构模糊, 小叶内肝细胞水肿, 小叶内肝细胞呈片状坏死, 并伴有炎细胞浸润和充血; 在25 mg·kg-1 Sch B组中 (5C), 可见肝小叶结构较清晰, 小叶内局部有充血, 并伴有少量炎细胞浸润; 在50 mg·kg-1 Sch B组中 (5D), 可见肝小叶结构基本清晰, 肝细胞形态正常; 在100 mg·kg-1 Sch B组中 (5E) 可见肝小叶结构基本清晰, 门管区充血且伴有少量炎细胞浸润, 小叶内炎细胞浸润明显。
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Figure 5 Liver histological evaluation of CLZ-treated mice. A: Control; B: CLZ (25 mg·kg-1); C: CLZ (25 mg·kg-1) + Sch B (25 mg·kg-1); D: CLZ (25 mg·kg-1) + Sch B (50 mg·kg-1); E: CLZ (25 mg·kg-1) + Sch B (100 mg·kg-1).   |
上述结果提示, 25 mg·kg-1 CLZ连续给药3周后, 可引起小鼠肝细胞坏死和肝小叶充血等损伤。低 (25 mg·kg-1)、中 (50 mg·kg-1) 剂量Sch B可改善CLZ所引起的损伤, 恢复肝细胞基本结构。而高剂量 (100 mg·kg-1) Sch B并未显示出更好的肝细胞保护功能, 反而出现门管区充血及炎细胞浸润等损伤。
4 Nrf2免疫组化染色与Western blotting结果免疫组化结果显示, 在control组中 (图 6A) 可见Nrf2在肝细胞浆中有少量表达; 在CLZ组中 (图 6B), Nrf2在小鼠肝门管区表达量增加, 胞浆呈浅黄, 同时可见部分细胞核呈浅黄, 为Nrf2阳性表达; 在Sch B (25、50和100 mg·kg-1) 组中 (图 6C~E), Nrf2在小鼠肝细胞中表达量呈递增趋势, 且主要集中在门管区, 同时可见部分肝细胞核中呈阳性表达。
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Figure 6 Nrf2 immunohistochemical staining analysis of the liver of mice. A: Control; B: CLZ (25 mg·kg-1); C: CLZ (25 mg·kg-1)
+ Sch B (25 mg·kg-1); D: CLZ (25 mg·kg-1) + Sch B (50 mg·kg-1); E: CLZ (25 mg·kg-1) + Sch B (100 mg·kg-1); F: The results of Western blotting.  |
Western blotting法进一步检测Nrf2在肝组织中的蛋白表达 (图 6F), 与control组相比, CLZ组中的Nrf2蛋白相对表达量增加了1.82倍 (P < 0.01)。与CLZ组相比, 25和50 mg·kg-1 Sch B治疗组中的Nrf2蛋白相对表达量持续增加到2.62倍 (P < 0.01) 和3.47倍 (P < 0.01)。100 mg·kg-1 Sch B治疗组中的Nrf2蛋白相对表达量虽未呈剂量依赖性增加, 但与CLZ组相比也存在显著性差异 (3.33倍, P < 0.01)。
5 Sch B对肝组织NQO1和HO-1 mRNA表达的影响由图 7可知, 各实验组中NQO1和HO-1基因相对表达量的变化为:与control组相比, CLZ组中的NQO1、HO-1基因相对表达量分别为1.63倍 (P < 0.05) 和4.40倍 (P < 0.01)。Sch B 25和50 mg·kg-1治疗组中的NQO1基因相对表达量持续增加, 并显著高于CLZ组 (5.28倍, P < 0.05; 6.33倍, P < 0.01)。而HO-1基因相对表达量仅在Sch B剂量为50 mg·kg-1时极显著高于CLZ组 (7.65倍, P < 0.01)。100 mg·kg-1 Sch B治疗组中的NQO1、HO-1基因相对表达量未呈剂量依赖性增加。
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Figure 7 Analysis of the relative gene expression of NQO1 and HO-1. n=8-10, x±s. #P < 0.05, ##P < 0.01; *P < 0.05, **P < 0.01 |
上述结果提示, CLZ在诱发肝损伤的同时可反馈上调Nrf2信号通路下游的NQO1和HO-1基因, 25和50 mg·kg-1 Sch B治疗组均可进一步上调NQO1和HO-1基因的表达, 发挥肝脏保护作用。而100 mg·kg-1 Sch B治疗组虽能上调NQO1和HO-1基因, 但无明显剂量依赖性。
讨论氯氮平通过选择性阻断中脑边缘系统的多巴胺受体发挥抗精神病作用。大量研究表明, 氯氮平主要通过RMs引发肝脏毒性。药物经代谢酶产生亲电性RMs, 其具有自由基特征, 可通过与细胞膜磷脂质的不饱和脂肪酸结合发生脂质过氧化反应, 造成细胞器膜功能损害, 致使线粒体损伤、细胞坏死[12]。RMs还可作为半抗原, 与内源性蛋白质结合形成具有免疫原性的自身抗原, 诱导产生特异质药物不良反应[12, 13]。
血清中转氨酶、肝匀浆中GSH、SOD等抗氧化酶活性及脂质过氧化产物MDA含量是反映肝细胞氧化损伤的重要检测指标。本实验CLZ组中, 小鼠肝组织匀浆中脂质过氧化终产物MDA含量升高的同时, RMs清除剂如SOD和GSH有所减少, 说明CLZ诱导的肝损伤存在自由基代谢紊乱。此外, CLZ组小鼠的血清中ALT、AST、ALP含量较正常组均明显升高约1.5倍。而25和50 mg·kg-1 Sch B组的小鼠肝组织匀浆中ALT、AST和ALP含量均比CLZ组低, MDA含量较CLZ组有所降低, 且SOD和GSH活性有所升高。此结果表明, 较低剂量 (25和50 mg·kg-1) Sch B能保护肝细胞, 减少肝细胞损伤后酶的逸出, 提高机体抗氧化酶的活性, 在一定程度上起到了保护肝脏的作用。
氧化和化学应激的防御性转导通路—Nrf2/ARE是近年新发现的机体抵抗内外界氧化和化学等刺激的防御性转导通路。生理条件下, Nrf2在细胞质中与Keap1结合处于非活性、易降解的状态。在内外界自由基和化学物质刺激时, Keap1的构象改变或者Nrf2直接被磷酸化, 导致Nrf2与Keap1解离而活化。活化的Nrf2进入细胞核, 与ARE结合, 启动ARE下游基因[包括Ⅱ相解毒酶 (如GST)、抗氧化蛋白 (如CAT和SOD)、抗炎因子 (如HO-1)]等的转录和表达, 以抵抗内外界的有害刺激[14]。研究显示, 五味子乙素能通过激活Nrf2/ARE信号通路上调各种抗氧化酶的表达, 清除大量的自由基, 进而保护肝脏细胞免受自由基损伤[15-17]。
Nrf2核转位考察结果显示, 25和50 mg·kg-1 Sch B治疗组中Nrf2在小鼠肝细胞浆和细胞核中表达量呈递增趋势, NQO1和HO-1基因相对表达量分别呈递增趋势。这两组实验小鼠肝组织匀浆中MDA含量较CLZ组有所降低, SOD和GSH活性水平有所升高。该结果表明Sch B对CLZ诱导的小鼠肝损伤的防治机制与其提高机体抗脂质过氧化能力有关, 其通过激活Nrf2/ARE信号通路, 上调抗氧化酶 (如CAT和SOD), 起到清除自由基和抑制脂质过氧化的作用, 进而发挥保护肝脏的作用, 与文献[15-17]中的报道结果一致。
本研究还发现, 与control组相比, 100 mg·kg-1 Sch B治疗组小鼠血清中的ALT、AST浓度有所升高, ALP浓度降低。与Sch B (25 mg·kg-1和50 mg·kg-1) 治疗组相比, 100 mg·kg-1 Sch B治疗组中的NQO1和HO-1基因相对表达量略有减少。此现象提示高剂量 (100 mg·kg-1) Sch B对CLZ导致小鼠肝损伤的保护作用不佳。经检索文献发现, Zhang等[18]证实五味子提取物和Sch B长期给药可诱导小鼠产生肝损伤作用, 而这是否与高浓度Sch B较差的肝保护作用相关, 还有待进一步研究。
综上所述, Sch B可以通过激活Nrf2/ARE信号通路, 提高机体抗氧化应激损伤能力, 发挥对CLZ肝毒性的保护作用。Sch B在一定剂量范围内 (25~50 mg·kg-1) 对CLZ引起小鼠肝损伤具有保护作用, 而较高剂量 (100 mg·kg-1) Sch B对CLZ引起小鼠肝损伤的肝保护作用不佳。本研究结果为减轻CLZ临床使用中的不良反应提供了新的研究思路。
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