不同基原甘草的分子鉴定及市售甘草药材的质量评价

引用本文

YANG Rui, LI Wen-dong, MA Yong-sheng, ZHOU Shan, XUE Yu-tao, LIN Rui-chao, LIU Ying. The molecular identification of licorice species and the quality evaluation of licorice slices[J]. Acta Pharm Sin, 2017, 52(2): 318-326. 复制到剪切板

杨瑞, 李文东, 马永生, 周姗, 薛宇涛, 林瑞超, 刘颖. 不同基原甘草的分子鉴定及市售甘草药材的质量评价[J]. 药学学报, 2017, 52(2): 318-326. 复制到剪切板

不同基原甘草的分子鉴定及市售甘草药材的质量评价

杨瑞¹, 李文东², 马永生¹, 周姗¹, 薛宇涛¹, 林瑞超³, 刘颖¹

1. 北京中医药大学生命科学学院, 北京 100102;
2. 北京市药品检验所, 北京 102206;
3. 北京中医药大学中药品质评价研究中心, 北京 100102

收稿日期: 2016-06-21; 修回日期: 2016-07-27

基金项目: 国家科技重大专项资助项目（2014ZX09304307001）

^*通讯作者: 林瑞超, Tel:86-10-84738653, E-mail:linrch307@sina.com
刘颖, Tel:86-10-84738646, E-mail:liuyliwd@sina.com

摘要: 甘草是我国最常用的大宗中药材之一，在《神农本草经》中被列为上品。2015版《中华人民共和国药典》规定，乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、光果甘草Glycyrrhiza glabra L.及胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.的干燥根及根茎可作为甘草入药。然而不同基原甘草药效差异显著，而通过传统方法对其进行鉴别十分困难。为了快速、准确地对不同基原甘草进行鉴定，本文从全国7省份21居群采集了240株甘草。利用PCR扩增获得了长度为616 bp的ITS序列以及389 bp的psbA-trnH序列；通过DNAMAN比对分析，在ITS序列中找到4个变异位点，并确定了2种ITS单倍型，在psbA-trnH序列中找到3个变异位点，并确定了4种psbA-trnH单倍型；结合ITS及psbA-trnH序列分析，确定了3种基原甘草的分子鉴定方案。利用该方案对来自全国4个主要中药材市场的40份甘草药材进行了准确鉴定，并进一步利用HPLC法测定各药材中2种三萜类有效成分（甘草酸及异甘草酸）及4种黄酮类有效成分（甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷）的含量，应用SPSS 21.0对HPLC结果进行统计学分析，从而对市售甘草药材的质量进行评价。本文为不同基原甘草的准确鉴定提供了分子鉴定方案，并且对甘草药材的流通现状及质量评价具有指导意义。

关键词: 乌拉尔甘草光果甘草胀果甘草 ITS psbA-trnH 分子鉴定 HPLC 质量评价

The molecular identification of licorice species and the quality evaluation of licorice slices

YANG Rui¹, LI Wen-dong², MA Yong-sheng¹, ZHOU Shan¹, XUE Yu-tao¹, LIN Rui-chao³, LIU Ying¹

1. School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China;
2. Beijing Institute for Drug Control, Beijing 102206, China;
3. Traditional Chinese Medicine Quality Evaluation Research Center, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China

Abstract: Licorice is one of the most common herbs in traditional Chinese medicine, and classified as top grade in Shen Nong Ben Cao Jing. There are three different original plants of licorice stipulated in Chinese Pharmacopeia, Glycyrrhiza uralensis Fisch., Glycyrrhiza glabra L., and Glycyrrhiza inflata Bat. However, previous investigation showed that the pharmacodynamic effects of the three licorices were quite different. It is very difficult to identify them by the classical identification methods. In order to establish a fast and effective identification method, we collected 240 licorice plants from 21 populations of 7 provinces, and amplified their ITS and psbA-trnH sequences. ITS sequences with a full length of 616 bp and psbA-trnH sequences with a full length of 389 bp were obtained separately. Using DNAMAN to analyze these sequences, 4 variable sites were found in ITS sequences and 2 ITS haplotypes were determined, and 3 variable sites were found in psbA-trnH sequences and 4 psbA-trnH haplotypes were determined. With the combination analysis of ITS and psbA-trnH sequences, the molecular identification method of original licorice was established. Using this method, 40 samples of licorice slices collected from 4 main herbal material markets in China were identified successfully. Furthermore, the contents of 2 triterpenes, 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid, and 4 flavonoids, liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin, and isoliquiritigenin in these licorice pieces were examined by HPLC and the results were analyzed using SPSS 21.0. This study provides a new method in identification of licorice, which may serve as a guideline for quality control of licorice slices.

Key words: Glycyrrhiza uralensis Glycyrrhiza glabra Glycyrrhiza inflata ITS psbA-trnH molecular identification HPLC quality evaluation

甘草是我国最常用的大宗药材之一, 始载于《神农本草经》, 被列为上品^[1], 在临床方剂中使用频率极高, 素有“十方九草”之称, 有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效^[2]。随着现代研究的不断深入, 从甘草中分离得到了大量的活性成分, 包括三萜类化合物, 如甘草酸、异甘草酸, 黄酮类化合物, 如甘草苷、甘草素, 以及甘草多糖, 发挥着抗癌^{[3, 4]}、抗病毒^{[5, 6]}、抗炎^{[7, 8]}、保肝^{[9, 10]}等多种药理作用。自20世纪80年代以来, 我国甘草的年需求量一直在3.75万吨以上^[11]。

2015版《中华人民共和国药典》^[2]规定, 有3种基原植物的干燥根及根茎可作为甘草入药, 即:乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.) 及胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)。其中, 以乌拉尔甘草分布最广、产量最高。有研究表明, 不同基原甘草存在明显的药效差异^{[12, 13]}, 本课题组前期研究也发现, 不同基原甘草的有效成分含量差异显著, 质量存在很大区别^[14], 对其进行有效鉴定对于保证临床用药的效果及安全性十分必要。然而, 3种基原甘草为同属, 入药部位均为根部, 其显微特征极为相似, 因此, 难以通过传统的性状鉴定和显微鉴定手段对其进行有效区分。

DNA条形码技术是近些年发展起来的物种鉴定新技术, 已被成功应用于多个物种^[15-19], 但在植物中还没有一个可以接受的通用条形码。2009年, 国际条形码工作组提出matK+rbcL作为植物中通用的条形码序列^[20]; 在同年的第三届国际条形码大会上, psbA-trnH和ITS/ITS2被列为matK + rbcL的补充序列; 2011年, 中国条形码工作组通过对中国种子植物中75科141属1 757种共约6 286样本的4个DNA候选条形码片段(rbcL、matK、psbA-trnH和ITS) 进行分析, 认为ITS序列和ITS2序列的物种分辨效率显著高于rbcL+matK, 而psbA-trnH序列被证明鉴定能力优于其他叶绿体基因序列^[21]。因此, 基于前人的研究基础, 本文将ITS序列和psbA-trnH序列作为鉴定3种不同基原甘草的备选DNA条形码。

本文采集了来自新疆、内蒙、甘肃、青海、山西、黑龙江、宁夏7个省区21个居群的240株野生及栽培甘草, 建立了3种基原甘草的分子鉴定方法。利用此方法对40份来自全国4个主要中药材集散中心的甘草药材进行分子鉴定, 同时对市售甘草药材的质量进行调查。《中华人民共和国药典》规定, 甘草酸和甘草苷为甘草的指标性成分, 基于近年来对于甘草活性成分药理作用的报道^[22-34], 为更加全面地对甘草质量进行评价, 本文对甘草酸、异甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素等6个主要成分的含量进行测定, 以期为市售甘草药材的质量评价提供依据。本文的结论对于不同基原甘草的准确鉴定具有重要价值, 且对于掌握市售甘草药材的流通现状以及质量评价具有指导意义。

材料与方法

甘草植物材料 收集来自全国7个省区21个居群的240株野生和栽培甘草样品, 包括乌拉尔甘草样品120份、光果甘草样品60份和胀果甘草样品60份, 由北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定, 用作建立不同基原甘草分子鉴定方案的实验材料, 详细情况见表 1。

Table 1 Licorice plant materials for establishment of molecular original identification method

Population	Species	Location	Longitude and latitude	Wild/Cultivated	Quantity
1	G. uralensis	Erdos, Inner Mongolia	E109°44′37.71″ N39°51′51.07″	Wild	10
2	G. uralensis	Ejina Banner, Inner Mongolia	E101°03′29.96″ N41°57′42.88″	Wild	10
3	G. uralensis	Bayannur, Inner Mongolia	E107°29′42.69″ N40°49′48.40″	Wild	10
4	G. uralensis	Hangjinqi, Inner Mongolia	E108°44′42.99″ N39°50′1.23' '	Cultivated	10
5	G. uralensis	Wuwei, Gansu	E102°32′35.25″ N37°53′25.67″	Wild	10
6	G. uralensis	Dingxi, Gansu	E104°38′42.53″ N35°35′23.04″	Wild	10
7	G. uralensis	Guide, Qinghai	E101°25′23.52″ N36°02′34.75″	Cultivated	10
8	G. uralensis	Yingxian, Shanxi	E113°14′35.40″ N39°35′17.20″	Cultivated	10
9	G. uralensis	Wuzhong Ningxia	E106°14′15.15″ N37°59′22.76″	Wild	10
10	G. uralensis	Yanchi, Ningxia	E107°24′45.44″ N37°47′14.71″	Cultivated	10
11	G. uralensis	Xiamaguan, Ningxia	E106°26′52.32″ N37°07′2.83″	Cultivated	20
12	G. inflata	Alar, Xinjiang	E81°16′56.48″ N40°36′33.12″	Wild	10
13	G. inflata	Hohhot, Inner Mongolia	E111°29′58.17″ N40°52′38.04″	Wild	10
14	G. inflata	Etuoke Front Banner, Inner Mongolia	E107°27′12.23″ N38°11′9.14″	Cultivated	10
15	G. inflata	Chifeng, Inner Mongolia	E118°59′18.67″ N42°14′49.12″	Wild	10
16	G. inflata	Xiamaguan, Ningxia	E106°26′52.46″ N37°07′2.86″	Cultivated	20
17	G. glabra	Jiuquan, Gansu	E98°27′53.12″ N39°43′36.18″	Wild	10
18	G. glabra	Zhaozhou, Heilongjiang	E125°17′21.27″ N45°41′26.02″	Cultivated	10
19	G. glabra	Dafang, Xinjiang	E87°25′49.59″ N43°47′44.38″	Cultivated	10
20	G. glabra	Alar, Xinjiang	E81°16′56.50″ N40°36′33.20″	Wild	10
21	G. glabra	Xiamaguan, Ningxia	E106°26′52.40″ N37°07′2.80″	Cultivated	20

Table 1 Licorice plant materials for establishment of molecular original identification method

实验仪器 1-13000型离心机(Sigma); 移液枪(Eppendorf); TProfessional热循环分析仪(Biometra); BG-gdsAUTO510型凝胶成像系统; DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂); 高效液相色谱仪: Agilent 1100; Waters 2998;色谱柱: CAPCELL PAK C₁₈ MGⅡ (4.6 mm × 250 mm, 5 µm, 日本资生堂株式会社); Agela Durashell C₁₈-AM (4.6 mm × 250 mm, 5 μm); 十万分之一电子天平CPA225D (德国赛多利斯科学仪器有限公司); 超声清洗仪KQ-250E (昆山市超声仪器有限公司)。

实验试剂 广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix酶、BM2000+DNA Marker购自北京博迈德科技发展有限公司; 对照品甘草酸单铵盐(批号MUST-16011310, 纯度98.86%) 和甘草素(批号MUSF14050911, 纯度98%) 购自成都曼斯特公司; 异甘草酸镁(批号100879-201302, 纯度90.8%) 购自中国食品药品检定研究院; 异甘草苷(批号120526, 纯度98%) 购自世纪奥科公司; 甘草苷(批号111610-201106, 纯度98%) 和异甘草素(批号131020, 纯度98%) 购自成都普菲德公司; 乙腈(色谱纯) 与甲醇(色谱纯) 购自Merck公司; 甲醇(分析纯) 与磷酸(分析纯) 购自北京化学试剂有限公司; 实验用水为屈臣氏蒸馏水。

DNA的提取、PCR扩增及测序 取0.1 g甘草样品干燥叶片, 采用博迈德广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒进行总DNA提取。PCR扩增ITS序列及psbA-trnH序列所用引物均为通用引物。ITS序列:正向引物P1: 5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGT AGG-3', 反向引物P4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3'。psbA-trnH序列:正向引物F: 5'-GTTATGCAT GAACGTAATGCTC-3', 反向引物R: 5'-CGCGCATG GTGGATTCACAATCC-3'。ITS序列和psbA-trnH序列的PCR扩增体系及程序相同。PCR反应体系: 2× Taq PCR Master Mix酶15.0 µL, 正、反向引物各1.0 µL (5 µmol·L^-1), 总DNA 3.0 µL, 加ddH₂O至30.0 µL。PCR扩增程序: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 60 s (35个循环); 72 ℃ 10 min; 4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 送上海生工生物工程服务有限公司测序。

不同基原甘草分子鉴定方法的建立 将扩增获得的ITS序列和psbA-trnH序列上传至GenBank数据库, 进行BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 比对, 以确定是否为目标序列。采用Contig Express 3.0 (Informax., Inc, USA) 对序列进行拼接和校对。将校对完成的ITS序列和psbA-trnH序列导入DNAMAN 6.0 (Lynnon Biosoft Co., LTD, USA) 软件, 分别进行比对分析, 统计ITS序列和psbA-trnH序列的单倍型信息, 并在GenBank中注册。基于多态性位点差异, 确定物种与单倍型的对应关系, 从而建立分子鉴定方案。

市售甘草药材的分子鉴定 分别提取40份甘草药材的总DNA, 提取方法与甘草叶片DNA提取方法相同, 扩增其ITS序列和psbA-trnH序列, 利用已建立的分子鉴定方案对其进行物种鉴定。

HPLC法分析市售甘草药材中三萜成分的含量 按照本课题组已建立的方法^[14]对甘草药材中的甘草酸以及异甘草酸进行含量测定。色谱条件:色谱仪: Waters 2998液相色谱仪; 色谱柱: Agela Durashell C₁₈-AM色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm); 流动相: 10 mmol·L^-1高氯酸铵水溶液(用氨水调节pH 8.2)-甲醇比例为48:52;流速: 0.8 mL∙min^-1; 检测波长: 250 nm; 柱温: 50 ℃; 进样量: 20 μL。对照品储备液的制备:分别精密称定甘草酸铵和异甘草酸镁的对照品适量, 加50%甲醇水溶液制成每1 mL含甘草酸单铵盐0.231 2 mg和异甘草酸镁0.011 0 mg的混合溶液, 即得混合对照品溶液。供试品溶液的制备:将甘草药材烘干至恒重, 取样品粉末(过三号药典筛) 0.1 g, 精密称定, 置于50 mL量瓶中, 加入50%甲醇水溶液至刻度, 密塞, 超声(频率50 kHz, 功率250 W) 提取30 min, 放冷, 补足失重, 过0.45 μm微孔滤膜, 取续滤液, 即得供试品溶液。线性:分别精密量取混合对照品溶液1、2.5、10、15、20 μL, 注入高效液相色谱仪, 测定, 以进样量为纵坐标, 峰面积为横坐标, 绘制标准曲线, 计算回归方程。

HPLC法分析市售甘草药材中黄酮类成分的含量 按照本课题组已建立的方法^[35]对甘草药材中的4种黄酮类化合物进行含量测定。色谱条件:色谱仪: Agilent 1100;色谱柱: CAPCELL PAK C₁₈ MGⅡ (4.6 mm × 250 mm, 5 µm); 流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液; 梯度洗脱条件: 0~15 min 20%~25%乙腈, 15~30 min 25%~40%乙腈, 30~40 min 40%~60%乙腈, 40~41 min 65%~95%乙腈。检测波长: 276 nm (0~13 min), 360 nm (13~23 min), 276 nm (23~28 min), 376 nm (28~55 min); 流速: 1.0 mL·min^-1; 柱温: 30 ℃; 进样量: 20 μL。对照品储备液的制备方法:分别精密称取甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素对照品适量, 加50%甲醇水溶液制成每1 mL分别含有甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素0.011 880、0.005 760、0.001 202、0.002 368 mg的混合溶液, 作为对照品溶液。供试品溶液的制备:方法同三萜成分含量测定部分。线性:分别精密量取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL, 注入高效液相色谱仪, 测定, 以峰面积为横坐标, 进样量为纵坐标, 绘制标准曲线, 计算回归方程。

HPLC数据分析 运用统计软件SPSS (Statistical Product and Service Solutions) 21.0 (IBM Institute Inc., USA) 中的配对T检验和Spearman相关性分析, 对甘草药材中2种三萜类成分、4种黄酮类成分、总三萜皂苷以及总黄酮的含量进行统计学分析, 从而对不同基原甘草药材的质量进行评价。

结果 1 基于ITS序列和psbA-trnH序列的甘草分子鉴定 1.1 ITS序列变异位点及单倍型分析

40份甘草样品ITS序列的PCR成功率及测序成功率均为100%。测序结果显示ITS序列长度为616 bp, 其中ITS1长度为234 bp、5.8 S为164 bp、ITS2为218 bp。DNAMAN序列分析结果显示: 3个物种的ITS序列共存在4个变异位点(表 2): ITS1区域187 bp处, 乌拉尔甘草为C, 光果甘草与胀果甘草均为T; 5.8S区域, 3个物种序列完全一致; ITS2区域411~413 bp处, 乌拉尔甘草为TGC, 光果甘草与胀果甘草均为CAA。所有ITS序列在种内保持100%一致。乌拉尔甘草为单倍型ITS-Ⅰ (187C-411T-412G-413C), 栽培和野生品种无区别; 光果甘草与胀果甘草均为单倍型ITS-Ⅱ (187T-411C-412A-413A), 栽培和野生品种无区别。因此, ITS序列可以将乌拉尔甘草从3种甘草中鉴定出来, 但无法对光果甘草和胀果甘草进行区分。

Table 2 ITS haplotypes of G. uralensis, G. glabra, and G. inflata.

1.2 psbA-trnH序列变异位点及单倍型分析

240份甘草样品psbA-trnH序列的PCR成功率及测序成功率均为100%。测序及序列分析结果显示: psbA-trnH序列长度为389 bp; 存在3个变异位点, 分别位于224 bp、270 bp和323 bp; 可分为4种单倍型, 即:单倍型PSB-Ⅰ (224A-270C-323G)、单倍型PSB-Ⅱ (224A-270T-323G)、单倍型PSB-Ⅲ (224C-270T-323G) 和单倍型PSB-Ⅳ (224A-270T-323A)。其中, 单倍型PSB-Ⅰ、PSB-Ⅱ为乌拉尔甘草特有单倍型, 单倍型PSB-Ⅳ为光果甘草特有单倍型, 而单倍型PSB-Ⅲ在乌拉尔甘草和胀果甘草中均有出现。psbA-trnH序列单倍型分布情况见表 3。

Table 3 psbA-trnH haplotypes of G. uralensis, G. glabra, and G. inflata

1.3 不同基原甘草分子鉴定方法的建立

根据以上ITS序列和psbA-trnH序列的鉴定结果, 建立两种鉴定方案。方案一:在对3种基原甘草进行分子鉴定时, 首先选择psbA-trnH序列, 若样品的psbA-trnH序列为单倍型PSB-Ⅰ或PSB-Ⅱ, 可确定为乌拉尔甘草; 若为单倍型PSB-Ⅳ, 可确定为光果甘草; 若为单倍型PSB-Ⅲ, 则需进一步扩增其ITS序列, 若ITS序列为单倍型ITS-Ⅰ则为乌拉尔甘草, 若为单倍型ITS-Ⅱ则为胀果甘草。方案二:在对3种基原甘草进行分子鉴定时, 首先对ITS序列进行扩增, 若为单倍型ITS-Ⅰ则为乌拉尔甘草, 若为单倍型ITS-Ⅱ则为光果甘草或胀果甘草, 需进一步扩增其psbA-trnH序列, 若为单倍型PSB-Ⅳ, 可确定为光果甘草, 若为单倍型PSB-Ⅲ, 可确定为胀果甘草。综上, 《中华人民共和国药典》规定的3种基原甘草可以通过以上两种分子鉴定方案, 通过psbA-trnH序列结合ITS序列进行准确鉴定。

2 市售甘草药材的物种鉴定及质量评价 2.1 市售甘草药材的物种鉴定

按照已建立的甘草分子鉴定方法, 对40份甘草药材进行鉴定, 结果显示该方法能够成功鉴定全部的甘草药材, 40份甘草药材中, 乌拉尔甘草28份、光果甘草12份、胀果甘草0份, 鉴定结果见表 4。

Table 4 Molecular identification and HPLC results of 40 licorice slices

Sample	Haplotype	Molecular identification result	Content / %
Sample	Haplotype	Molecular identification result	18β-Glycyrrhizic acid	18α-Glycyrrhizic acid	Liquiritin	Isoliquiritin	Liquiritigenin	Isoliquiritigenin
AG1	PSB-Ⅳ	G. glabra	4.166 5	0.134 9	1.111 6	0.064 3	0.083 9	0.008 5
AG2	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.954 5	0.109 9	0.485 0	0.025 0	0.028 8	0.003 7
AG3	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.120 3	0.085 7	0.713 8	0.048 7	0.072 2	0.007 1
AG4	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.344 4	0.099 7	0.722 3	0.037 8	0.060 1	0.008 8
AG5	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.348 8	0.054 8	1.077 0	0.126 7	0.144 6	0.012 1
AG6	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.847 6	0.060 0	1.537 3	0.179 6	0.166 6	0.020 9
AG7	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.834 5	0.068 9	1.164 6	0.146 8	0.126 3	0.021 7
AG8	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.808 8	0.069 9	1.096 1	0.107 9	0.111 4	0.012 8
AG9	PSB-Ⅲ+ITS-Ⅰ	G. uralensis	1.844 5	0.053 6	1.666 0	0.071 9	0.148 9	0.015 9
AG10	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.849 6	0.058 4	1.111 6	0.104 3	0.123 9	0.013 5
BG1	PSB-Ⅰ	G. uralensis	2.095 9	0.086 3	1.628 4	0.092 9	0.118 8	0.014 1
BG2	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.611 4	0.069 7	1.490 6	0.099 4	0.122 6	0.014 4
BG3	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.600 1	0.050 2	1.101 7	0.100 2	0.138 6	0.016 1
BG4	PSB-Ⅱ	G. uralensis	1.632 8	0.049 5	1.261 9	0.092 1	0.131 9	0.013 6
BG5	PSB-Ⅰ	G. uralensis	2.392 9	0.096 5	1.081 2	0.092 8	0.179 8	0.014 9
BG6	PSB-Ⅱ	G. uralensis	2.016 7	0.088 0	0.909 1	0.097 3	0.157 0	0.009 1
BG7	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.171 2	0.029 8	0.936 8	0.098 5	0.142 4	0.016 1
BG8	PSB-Ⅱ	G. uralensis	0.938 9	0.043 5	1.177 9	0.107 3	0.123 9	0.011 6
BG9	PSB-Ⅱ	G. uralensis	1.660 4	0.043 4	1.280 9	0.125 4	0.143 0	0.028 5
BG10	PSB-Ⅱ	G. uralensis	2.002 6	0.059 1	0.929 3	0.105 4	0.245 4	0.038 0
HG1	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.592 1	0.023 5	0.921 4	0.109 5	0.143 9	0.009 3
HG2	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.659 1	0.097 1	0.754 4	0.055 9	0.085 8	0.006 9
HG3	PSB-Ⅰ	G. uralensis	2.019 5	0.061 3	0.998 5	0.097 5	0.138 3	0.013 0
HG4	PSB-Ⅰ	G. uralensis	2.158 7	0.069 3	0.925 5	0.086 8	0.120 0	0.025 4
HG5	PSB-Ⅰ	G. uralensis	2.163 8	0.058 8	0.827 9	0.088 1	0.159 9	0.011 9
HG6	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.625 4	0.094 0	0.469 9	0.051 1	0.045 9	0.009 3
HG7	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.406 0	0.087 3	0.489 1	0.041 7	0.083 3	0.008 3
HG8	PSB-Ⅰ	G. uralensis	2.090 8	0.071 0	0.865 9	0.102 3	0.121 6	0.023 0
HG9	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.286 3	0.092 4	0.531 8	0.062 4	0.064 7	0.008 9
HG10	PSB-Ⅰ	G. uralensis	2.056 5	0.070 0	0.799 9	0.099 1	0.140 8	0.018 4
YG1	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.103 9	0.083 5	0.427 2	0.041 7	0.063 6	0.009 0
YG2	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.886 3	0.058 7	0.848 3	0.109 5	0.147 7	0.019 4
YG3	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.797 8	0.053 0	0.805 9	0.092 7	0.138 2	0.017 6
YG4	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.451 0	0.053 2	0.796 6	0.083 3	0.124 7	0.013 0
YG5	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.649 0	0.098 9	0.367 0	0.047 4	0.030 1	0.006 1
YG6	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.731 1	0.044 6	0.570 6	0.106 4	0.136 3	0.016 3
YG7	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.003 1	0.081 4	0.613 4	0.052 8	0.032 6	0.009 6
YG8	PSB-Ⅳ	G. glabra	2.037 9	0.082 0	0.680 0	0.064 5	0.032 7	0.008 4
YG9	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.533 3	0.045 8	0.846 1	0.095 5	0.135 7	0.016 1
YG10	PSB-Ⅰ	G. uralensis	1.466 5	0.049 4	0.716 5	0.086 7	0.141 1	0.015 3

Table 4 Molecular identification and HPLC results of 40 licorice slices

2.2 市售甘草药材中三萜类及黄酮类化合物的含量分析

HPLC色谱图如图 1所示, A显示异甘草酸和甘草酸的保留时间分别为12.508、13.417 min; B显示甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素的保留时间分别为9.207、19.654、23.999、35.254 min; C和D分别为乌拉尔甘草药材中三萜类及黄酮类化合物的HPLC色谱图; E和F分别为光果甘草药材中三萜类及黄酮类化合物的HPLC色谱图。

Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance and samples. Compound 1-6: 18β-Glycyrrhizic acid, 18α-glycyrrhizic acid, liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin, and isoliquiritigenin, separately. A: HPLC chromatogram of reference substances 18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid; B: HPLC chromatogram of reference substances liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin, and isoliquiriti genin; C: HPLC chromatogram of 18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid in G. uralensis: D: HPLC chromatogram of liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin, and isoliquiritigenin in G. uralensis; E: HPLC chromatogram of 18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid in G. glabra; F: HPLC chromatogram of liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin, and isoliquiritigenin in G. glabra

各活性成分的标准曲线如下:甘草酸: Y=1×10^-6X + 1.42×10^-2 (R²=0.999 9);异甘草酸: Y=7×10^-7X + 1.52×10^-3 (R²=1);甘草苷: Y=6×10^-4X + 9×10^-5 (R²=0.999 9);异甘草苷: Y=2×10^-4X + 4×10^-5 (R²=0.999 8);甘草素: Y=3×10^-4X + 3×10^-5 (R²=0.999 9);异甘草素: Y=1×10^-4X -4×10^-5 (R²=0.999 2)。

各甘草药材中甘草酸、异甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素的含量见表 4及图 2A~2F。各甘草药材中总三萜及总黄酮的含量见图 2G和2H。

Figure 2 The triterpenoids and flavonoids contents in 40 licorice slices. A-F: The contents of 18β-glycyrrhizic acid, 18α-glycyrrhizic acid, liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin, and isoliquiritigenin in G. uralensis and G. glabra; G, H: The contents of total saponins and total flavonoids in G. uralensis and G. glabra

2.3 市售甘草药材的质量评价

以甘草酸和异甘草酸的含量之和作为总三萜皂苷含量, 以甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素的含量之和作为总黄酮含量。以甘草酸、异甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、总三萜皂苷以及总黄酮的含量分别作为评价指标, 以配对t检验的方法对2种不同基原甘草药材中各成分的含量进行统计学分析, 结果见表 5。统计结果显示, 以上6种化合物、总三萜皂苷以及总黄酮的含量在2种基原甘草药材中均存在显著差异, 光果甘草的甘草酸、异甘草酸以及总三萜皂苷的含量均明显高于乌拉尔甘草; 而乌拉尔甘草的4种黄酮类化合物以及总黄酮的含量则明显高于光果甘草。

Table 5 The Paired t-test results

运用SPSS 21.0分析软件中的Spearman相关性分析, 对40份甘草药材样品中甘草酸与异甘草酸、甘草苷与异甘草苷、甘草素与异甘草素的含量进行相关性分析, 结果见表 6。结果表明, 在乌拉尔甘草与光果甘草中, 甘草酸与异甘草酸含量、甘草苷与异甘草苷含量、甘草素与异甘草素含量均具有显著的相关关系。

Table 6 The Spearman correlation results

讨论

目前对于《中华人民共和国药典》规定的3种基原甘草的鉴定多集中于生药形态组织学^{[36, 37]}及化学成分含量上的差异^[12], 本文收集了来自全国7个省份21个居群的240株甘草, 通过ITS序列结合psbA-trnH序列分析, 确定不同基原甘草特有的单倍型, 从而从分子水平达到了鉴定3种基原甘草的目的。利用本论文中建立的分子鉴定方案, 本文对来自全国4个主要中药材市场的40份甘草药材进行了准确有效的基原鉴定。结果显示, 在4个主要药材市场中均未发现胀果甘草样品, 说明市场上流通的甘草主体为乌拉尔甘草(28份) 和光果甘草(12份)。

为了进一步调查市售甘草药材的质量, 本文利用HPLC对40份甘草药材中2种三萜类成分和4种黄酮类成分进行了含量测定。分析结果显示, 光果甘草样品中, 三萜类成分含量均显著高于乌拉尔甘草样品; 而乌拉尔甘草样品中, 黄酮类成分含量则显著高于光果甘草样品。由此提示, 不同基原甘草可用于不同目标成分的获得, 从而提高药材的使用效率。此外, 不同有效成分的药理活性差异很大, 如甘草酸和异甘草酸在治疗肝病以及发挥抗病毒作用方面具有的不可替代的活性^{[38, 39]}, 而黄酮类成分在抗氧化、治疗神经退行性疾病方面具有显著疗效^{[40, 41]}, 由此提示, 不同基原甘草的药效不同, 在疾病的治疗及使用方面应区分对待。此外, 通过对化合物含量的相关性进行比较分析, 发现甘草酸与异甘草酸、甘草苷与异甘草苷、甘草素与异甘草素含量之间存在着显著相关性, 由此可见, 其代谢途径上存在某种联系, 值得深入探讨。

《中华人民共和国药典》规定, 甘草药材中甘草酸含量不得低于2.0%, 甘草苷含量不得低于0.5%。通过对四大药材市场的甘草药材质量进行考察发现, 质量最好的甘草样品中, 甘草酸含量可高达4.2%, 而品质较差的甘草样品中, 甘草酸含量不足1.0%。40份甘草药材样品中, 甘草酸含量未达标的为19份, 甘草苷含量未达标的为5份。由于市场流通的甘草以栽培甘草为主, 因此人工栽培甘草的质量仍需进一步提高, 而药材市场也需要进一步加强监管。

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药学学报 2017, Vol. 52 Issue (2): 318-326	PDF