次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶 (inosine 5'-mono­phosphate dehydrogenase，IMPDH) 是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide，NAD⁺) 依赖酶，广泛存在于全身各分化细胞^[1]。IMPDH是嘌呤代谢过程中的限速酶，可催化次黄嘌呤核苷酸 (inosinemonphosphate，IMP) 转化生成黄嘌呤核苷酸 (xanthosine monophosphate，XMP)^[2]，继而合成鸟嘌呤核苷酸，在细胞的生长、分化和凋亡中起着重要作用。同时IMPDH也是细胞免疫的一种重要酶类，可在炎症反应的应答时对黏附因子和细胞内信号进行调节^[3]。此外，该酶还参与了细胞膜糖蛋白和黏附分子的合成，可影响淋巴细胞进入异体组织的募集作用与内皮渗透性^[4]。IMPDH被抑制时可导致细胞内鸟嘌呤核苷三磷酸储存量的消耗，减缓炎症部位与异体组织内单核细胞和淋巴细胞的增殖与补充^[3]。

目前上市的IMPDH相关药物主要是IMPDH抑制剂，包括麦考酚酸 (mycophenolic acid，MPA) 制剂、咪唑立宾、利巴韦林和NAD⁺类似物等，应用于抗免疫排斥、抗肿瘤、抗病毒或抗寄生虫等领域^[5]。该类药物的主要药理作用原理如图 1。IMPDH抑制剂的血药浓度与临床疗效之间存在一定关联性，以麦考酚酸为例，通常认为药时曲线下面积 (AUC) 为30～60 μg·h·mL^-1[6]时，肾移植术后早期的免疫排斥发生率较低。但该关联的个体间变异常较大，因此测定IMPDH活性可作为一项监测其药物效应的特异性生物标志物^[7]。了解患者体内IMPDH抑制水平，可有效弥补血药浓度监测的局限性，更全面地描述患者特异性的剂量-浓度-效应关系，以优化药物治疗方案^[8]。

本文就目前常用的IMPDH酶活性测定方法，以及在临床上应用的最新进展作一综述，旨在为开展IMPDH抑制剂的药效学监测提供具体方法和依据。

1 IMPDH的基因分型

人类IMPDH有两种亚型 (Ⅰ型和Ⅱ型)，分别 由基因IMPDH Ⅰ和IMPDH Ⅱ编码。两种基因分别位于7号染色体的短臂31区3带和3号染色体的 长臂21区2带^{[9, 10]}。IMPDH Ⅰ型和Ⅱ型的氨基酸序列有85%同源性，分子量大小相似，但酶的亲和力 及催化速率常数并不一致^[11]。McPhillips等^[12]发现，当刺激淋巴细胞进行有丝分裂时，IMPDH Ⅰ型和Ⅱ型表达均上调，但不同细胞表达的IMPDH亚型不尽相同。IMPDH Ⅰ在肝、结肠和外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 中表达更多，而IMPDH Ⅱ在肝、肾和骨骼肌中分布更多^[13]。

在给予MPA治疗的肾移植患者中，有研究表 明IMPDH Ⅰ和IMPDH Ⅱ的基因多态性可影响患 者体内的酶活性，与患者的急性排斥反应的发生相关^[14]。近年来已有研究发现，IMPDH Ⅰ的rs2278293、rs2278294和IMPDH Ⅱ的rs11706052等位点的突变可能增加MPA用药后的不良反应，如白细胞减少 症的发生^[15]，或通过对患者体内IMPDH酶活性的影响^[16]，从而改变MPA的治疗效果。但这些单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNP) 对于临床治疗效的影响，目前尚无统一结论^{[15, 17]}。

2 IMPDH活性测定方法

由于IMPDH活性难以直接测得，通常采用间接的方法，如测定IMPDH基因的表达量 (如mRNA含量^{[18, 19]})，或在体外孵化后考察酶催化特定酶促反应的速度，如考察催化底物IMP氧化生成产物XMP或辅酶产物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotina­mide adenine dinucleotide，NADH) 的速度^[20]。测定过程一般分为3个步骤: 靶细胞的分离、细胞预处理 (如提取细胞DNA/RNA或进行体外酶促反应) 以及酶活性的测定，具体过程见图 2。

2.1 靶细胞的选择及分离

IMPDH虽广泛存在于体内各分化细胞，但作用于该酶的药物通常需经血红蛋白转运，且主要作用于淋巴细胞。故欲考察与药物疗效更相关的IMPDH活性，需选择合适的靶细胞^{[7, 21]}。IMPDH 活性测定的靶细胞主要有全血或红细胞、CD4⁺ T细胞^[22]以及PBMC^[23]等。

2.1.1 全血或红细胞

因样本处理过程相对方便且操作简单，最初对IMPDH活性的测定大多选用全血。但由于全血中测定的IMPDH主要来源于红细胞，与体内实际药物效应存在差异，多不作为首选^[24]。

2.1.2 CD4⁺T细胞

CD4⁺ T细胞在急性排斥反应的免疫应答中发挥着重要作用。MPA可通过抑制其克隆性增长发挥药理学作用，故有研究选用该细胞作为分析样本^[25]。通常CD4⁺ T细胞分离采用的是磁珠分选法，通过抗原与抗体的特异性结合对细胞进行有效筛选^[22]。但因该类药物对体内免疫应答的影响并不仅作用于CD4⁺ T细胞，且其分离方法相对较繁锁，故目前并不常用。

2.1.3 PBMC

IMPDH抑制时产生药理作用的细 胞主要是淋巴细胞，但体外检测淋巴细胞首先需分离PBMC——即目前最常用于IMPDH测定的靶细胞。PBMC的分离通常采用Ficoll-hypaque密度梯度离心法，其基本操作流程为取肝素或乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA) 抗凝全血，磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline，PBS) 稀释后，加入淋巴细胞分离液离心，抽提淋巴细胞层、清洗离心后得到的沉淀物即为PBMC^[7] (其中淋巴细胞约占90%～95%)。

在PBMC的分离过程中，血样采集后进行细胞分离的时间可对测定结果产生较大影响。时间越长，PBMC的提取率越低，其中混入的红细胞也越多，且对不同患者的最终测定结果的影响程度也不尽相同。一般以4～12 h为宜^{[7, 26, 27]}。另外，目前的研究表明提取前保存温度对PBMC的提取率不产生影响。如Glander等^[7]的研究发现: 新鲜血液在室温或4 ℃保存24 h对最终测定结果并无显著影响。分离过程的另一个重要因素则是PBS对提取细胞的清洗次数。清洗次数越多，细胞内的药物浓度越低，对IMPDH活性的影响程度也被削弱^[7]。

此外，Glander等^[7]还分别考察了分离过程中不同影响因素，如分离时间、保存温度、内源性物质如蛋白和红细胞等对IMPDH活性测定结果的影响程 度，并改良了PBMC的分离方法。其研究结果建议，EDTA抗凝的新鲜全血须在采样后12 h内进行提取，分离后得到的PBMC最佳清洗次数为两次。

2.2 细胞预处理

根据IMPDH酶活性测定方法的不同，目前主 要有以下两种细胞预处理方法，提取细胞RNA和体外酶促反应。

2.2.1 提取细胞RNA

IMPDH的活性可用其mRNA的表达量来表示，此类方法需先提取细胞内RNA，再采用基因定量技术如实时定量PCR法^[18]进行测定。目前，已有技术成熟应用广泛的商品化试剂盒，可用于实验室提取细胞RNA，如Trizol-LS(R)、RNA-STAT- 50(R) 和Ultraspec-3(R)^[28]等，本文不再赘述。

2.2.2 体外酶促反应

IMPDH可在辅酶NAD⁺存在的条件下，将底物IMP转化生成 XMP。因此，测定细胞内IMPDH活性，可通过体外孵育的方式，模拟体内环境 (37 ℃，pH 7.4)，在孵育体系中加入足量的底物和辅酶。若采用放射法，则需加入同位素标记的底物^[8]。待酶促反应完全后，通过测定生成产物的含量来计算IMPDH酶活性^[7] (图 1)。

IMPDH活性与孵育过程中的底物浓度、辅酶浓度以及细胞内药物的含量有关，且呈现时间依赖性。其中，底物与辅酶的浓度因不同研究中提取的血样量不同而各有差异。Daxecker等^[29]分别测定了IMP和NAD⁺在0.034～0.546 mmol·L^-1时IMPDH的活性。结果发现，若采血量为30 mL时，两种加入物质的最佳浓度均为0.273 mmol·L^-1。而在Vethe等^[30]的研究中，取4 mL全血进行淋巴细胞分离，结果发现: 当NAD和IMP的浓度分别为0.38 mmol·L^-1和1.79 mmol·L^-1时，酶促反应可达到最大速率。

同时，IMPDH活性还受体内药物浓度的影响。Daxecker等^[29]的研究发现，当MPA浓度为0.5 μmol·L^-1时，产物XMP的生成量将低于检测下限 (约0.72 μmol·L^-1)。此外，该研究还探讨了IMPDH活性测定值与孵育时间的关系，发现在0～180 min时，120 min为最佳的孵育条件。而Vethe等^[30]的研究结果也表明: 120 min可使整个酶促反应体系中的IMPDH达最大活性。

另外，酶促反应的终止多采用加入高氯酸^{[31, 32]}或甲醇^[33]的方法，充分涡旋后高速离心，并取适量碱溶液进行中和及盐析，使蛋白沉淀且pH接近中性后，进行酶活性的测定。

2.3 酶活性测定

目前用于测定IMPDH酶活性的方法主要有3 种: RT-PCR法测定IMPDH的mRNA表达量^[34]、放射法检测酶促反应产物NADH^[8]，以及色谱法测定IMPDH催化反应产物XMP的生成量^{[7, 13, 21-24, 26, 27]}。

2.3.1 RT-PCR法

RT-PCR 法是通过测定IMPDH基因的mRNA表达量来表示其最终的IMPDH活性。如Vannozzi等^[34]以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为荧光标记物，应用实时定量PCR法检测了细胞RNA中IMPDH Ⅱ型的基因表达。该方法的最大优点在于可单独测定IMPDH某一亚型的活性，但因实验操作较为繁琐，且测定结果只能代表基因表达水平^[35]，无法完全代表真正的酶活性。因此，除一些机制性研究或药物基因组学研究^[15]外，该法并不常用。

2.3.2 放射法

放射法是指孵育体系在外加[2，8-³H]次黄嘌呤的条件下，反应底物IMP结构中次黄嘌呤环C-2位置上的氢原子可被标记为³H，之后的酶促反应过程中，该位置的³H被羟基取代，辅酶NAD⁺作为电子受体，转变成为NAD³H (图 2)。因此，待酶促反应完全后，可借NAD³H的生成速度来计算IMPDH活性，如将NAD³H的生成量对反应时间进行作图，最终得到的直线斜率即代表酶活性^[8]，Millan等^[20]的研究便是采用了此种方法。放射法的优点在于可特异性检测全血或者完整细胞中的酶反应产物，不受其他物质的干扰^[36]。但由于放射性标记物的制备相对复杂，且该方法存在一定的辐射效应，故近年来应用逐渐减少。

2.3.3 色谱法

酶促反应完成后，可通过色谱法来测定产物XMP^[7]的生成量，间接计算IMPDH活性 (图 1)。常用的方法是高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography，HPLC) 及液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)。自Albrecht等^[24]于2000年第一次采用HPLC方法检测IMPDH活性以来，目前HPLC法已成为应用最为广泛的方法。该法可对酶活性进行快速定量，且具较好的线性、精密度和准确度，在临床上有较好的可行性^[37]。

2.3.4 测定的影响因素

目前，最常用的IMPDH酶活性测定方法为色谱法。在色谱法测定过程中，为准确计算酶活性、减少实验误差，IMPDH催化反应产物的测定结果须根据提取的细胞数量进行标准化。常用的标准化方法主要有细胞计数法^[13]和蛋白定量法^[38]，即分别通过对同一测定样本的细胞数或蛋白含量进行测定，以标化最终产物的量，计算酶活性值。

无论是自动还是人工的细胞计数法，常存在实验室间差异、观测者间的变异和重复性不佳的缺点。在提取细胞过程中，加水稀释、离心等步骤可改变渗透压致细胞破坏，使实际测定时的细胞少于计数时的细胞，增加误差。测定细胞提取物中的蛋白含量，则易受到细胞外蛋白和非PBMCs细胞的影响，如红细胞可增加最终的蛋白测定浓度^[7]。

另一种方法是测定IMP的细胞内源性产物AMP^{[7, 39]}。由于AMP来源于IMPDH酶作用的同一底物，与最终测定溶液里的细胞数直接相关，故适于作为细胞数量的标准化物质。同时，AMP还可与XMP在相同条件下进行定量测定，提高了该方法的可重复性和稳定性。Glander等^[7]的实验发现，用AMP进行标化后，计算得到的IMPDH酶活性相比于细胞计数和蛋白定量法，其变异更小 (< 15%)。且该方法不受内源性蛋白和红细胞等干扰物质的影响，并在多中心实验中得到了较为可信的结果。上述IMPDH酶活性的计算见公式1。

$\begin{align} & \text{IMPDHactivity(}\mu \text{mol}\cdot {{\text{s}}^{\text{-1}}}\cdot \text{mo}{{\text{l}}^{\text{-1}}}\text{AMP)=} \\ & \frac{\text{Produced XMP (}\mu \text{mol}\cdot {{\text{L}}^{\text{-1}}}\text{)}\times \text{1}{{\text{0}}^{6}}}{\text{Incubation time(s)}\times \text{measuredAMP(}\mu \text{mol}\cdot {{\text{L}}^{\text{-1}}}\text{)}} \\ \end{align}$

(1)

采用色谱法测定 IMPDH活性，应尽可能采用与样本基质相近的空白基质配制标准曲线和质控品。IMPDH活性测定最常用的靶细胞为PBMCs，而PBMC存在内源性的IMPDH和AMP干扰测定，且难以大量获取，故无法作为空白基质。现有研究中常选用的空白基质主要有水^[40]、PBS缓冲液^[30]和小牛血清^[31]等，旨在提高实验操作性 (如水)，或模拟体内环境 (如PBS缓冲液和小牛血清)。为减少IMPDH活性测定时内源性物质的干扰，常同时测定健康志愿者的IMPDH活性作为对照^[7]。但尚无研究考察不同空白基质对测定结果的影响。

3 IMPDH活性测定的应用 3.1 移植与免疫

临床应用的IMPDH抑制剂中，MPA制剂是目 前使用最为广泛且研究最为系统的一类药物，主要用于移植术后抗排斥反应^[41]和自身免疫性疾病的治疗^[42]。MPA治疗范围窄，药动学个体间变异大且影响因素多，如与合并用药的相互作用、MPA代谢酶与转运体等的基因多态性等，现常被建议进行血药浓度监测^[31]。同时，亦有研究发现^[43]: 健康受试者、透析患者以及肾移植患者体内的IMPDH活性存在较大的个体间变异 (表 1)，有必要进行监测。目前已有移植中心将IMPDH的活性监测纳入移植患者术后维持期的常规监测^[44]，作为MPA个体化给药方案设计的重要手段^[45]。

多个研究表明: 移植患者IMPDH的酶活性及其抑制程度与MPA的治疗预后相关，如移植术后炎症反应、病理性急性排斥以及白细胞减少症的发生率 等^{[18, 46, 47]}。Fukuda等^[41]的研究显示: 移植术前IMPDH活性可作为临床疗效的预测因子，预测移植术后的药物毒性和移植物排斥反应。Chiarelli等^[27]的研究发现: MPA治疗预后的最佳监测指标为服用其酯类前体药物 (MMF) 后1.5 h的IMPDH活性或者0～1.5 h的IMPDH活性抑制率。在Raggi等^[31]的研究中，移植术后服用MPA预防急性排斥的IMPDH抑制靶水平均值约为50%。而Maiguma等^[37]的研究则表明: 25%～40% 的IMPDH抑制程度是一个较为合适的范围。但因IMPDH活性的测定方法各有不同，既往研究间的数据难以直接比较 (表 1)，IMPDH活性在不同人群的参考值范围仍需作进一步的考察和验证。

此外，IMPDH活性监测对免疫疾病的治疗也有积极意义。Schaier等^[42]研究了MPA治疗抗中性粒 细胞胞浆抗体 (anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA) 相关血管炎的PD指标 (IMPDH活性) 与临床疗效之间的关系，发现炎症复发的患者相比于疾病状态稳定的患者而言，其基线与复发前的IMPDH酶活性水平均显著升高。由此可知预后不佳可能与IMPDH活性抑制不足有关，同时也进一步证明IMPDH活性监测可改善MPA治疗的有效性。

3.2 抗病毒与抗肿瘤

IMPDH的活性监测对于抗病毒治疗的临床应用也有一定的指导价值。Khan等^[48]的研究显示: 细胞内IMPDH活性可作为基孔肯雅热病毒复制和诱导的生物标志物，表征作用于IMPDH的抗病毒药物的治疗效果，如抑制病毒复制与增殖，减少病毒引发的细胞凋亡等。

另外，在抗肿瘤治疗领域，IMPDH活性的测定还可预测疾病预后，指导临床用药方案的调整。Vethe等^[49]的研究发现: IMPDH抑制药物——巯鸟嘌呤核苷酸可通过影响MOLT-4人白血病细胞中的IMPDH活性，进而调控白血病细胞的增长及疾病进展。且IMPDH活性与药物浓度关联紧密，可作为该药的药效学的生物标志物，预测疾病预后。Fellenberg等^[50]研究表明: 当骨肉瘤细胞中的IMPDH Ⅱ基因过表达，其对化疗药物的耐药性将提高。故推荐IMPDH抑制剂联合化疗药物，作为治疗IMPDH Ⅱ高表达型骨肉瘤患者的优选治疗策略。以上研究均为IMPDH酶活性监测的开展提供了强有力的依据。

4 总结与展望

IMPDH酶活性测定可作为IMPDH抑制剂的药效学标志物，与血药浓度监测结合，为临床个体化给药提供更有效、安全的依据^{[27, 41]}。如在Sommerer 等^[51]的研究中发现，服用MPA肠溶制剂时，肾移植患者MPA的暴露与移植术后早期的急性排斥以及感染有关，而较低的IMPDH活性则与胃肠道不良反应的发生相关，提示结合MPA的PK与PD监测调整临床用药策略，可改善治疗效果并减少药物不良反应的发生。

目前常用的3种IMPDH活性测定方法，因其侧重点与结果的差异，实际应用各有所长。RT-PCR法因侧重于IMPDH的基因亚型，主要用于药物基因组学及作用机制研究^[38]; 放射法主要检测活化的淋巴细胞，不易受到其他物质干扰，适于进行特定细胞内的药理学研究^[20]; 而色谱法因其良好的准确性与精密度，以及检测过程相对前两者更方便快捷，因此更适用于临床应用^[7]。但相对于血药浓度测定，IMPDH活性的测定耗时较长且操作步骤较多。随着自动化检测设备的开发，未来可有更简便、易操作的测定方法，以利于IMPDH活性的监测在临床各治疗领域的推广应用。

IMPDH活性监测对于IMPDH抑制剂的临床应用已发挥出其积极意义，可提高药物治疗效果、预测疾病预后或指导用药调整等。但目前IMPDH活性抑制的目标程度与测定时机尚无定论，未来应开展前瞻性的多中心大样本的临床研究，确定剂量-浓度-IMPDH活性和临床结局的关系，更全面深入地探讨IMPDH活性监测的临床价值，明确合适的监测方法以及与临床疗效相关的评价标准，促进该类药物的合理应用。