1 研究背景

阿尔茨海默病的发生是由于大脑皮层缺失了胆碱乙酰转移酶 (ChAT),不能或降低了由胆碱合成乙酰胆碱的能力,皮层的胆碱能传导功能降低,造成记忆障碍和痴呆。所以,提高神经元的胆碱能活性是治疗痴呆患者的一个切入点。此外,胆碱酯酶 (AChE) 抑制剂也是治疗阿尔茨海默病的重要手段。多奈哌 齐的研制就是从寻找新结构类型的胆碱酯酶抑制剂入手的。

2 苗头化合物及其向先导物的过渡 2.1 随机筛选得到苗头化合物:连接基 -O(CH₂)₃-N- 的变换

日本卫材公司为了研发与他克林结构不同的新型胆碱酯酶抑制剂,用随机筛选方法,发现公司内部为研制抗动脉硬化药物而合成的化合物1对胆碱酯酶有弱抑制作用,对AChE的活性IC₅₀ = 12.6 μmol·L⁻¹。以1作为苗头化合物,对结构逐步修饰,例如将哌嗪环变换为哌啶,化合物2降低了分子的极性,活性提高了36倍,IC₅₀ = 0.34 μmol·L⁻¹。进而将烷氧链的 -O-CH₂- 变换成酰胺片段 -CO-NH- ,化合物3的IC₅₀ = 0.055 μmol·L⁻¹,活性提高了5倍,提示虽然化合物3的极性强于2但降低了分子的柔性,可能有利于与酶的结合。

2.2 变换构象和硝基的替换

去除3中的硝基,化合物4的IC₅₀ = 0.56 μmol·L⁻¹,活性的下降提示硝基可能提供了与酶结合的因素。而若将酰胺的NH换成CH₂,化合物5的活性与4相当,IC₅₀ = 0.53 μmol·L⁻¹,这为以后消除氮原子提供了依据。另外,若将4中N原子甲基化,化合物6的活性提高2倍,IC₅₀ = 0.17 μmol·L⁻¹,可认为N-甲基化产物6不仅消除了氢键 供体,而且由于甲基的阻转异构,改变了分子的走向 (构象)。在6的苯甲酰对位引入苯甲磺酰基 (模拟3的硝基,并提高脂溶性),化合物7的活性有显著提升,IC₅₀ = 0.6 nmol·L⁻¹,活性提高了280倍 (Sugimoto H,Tsuchiya Y,Sugumi H,et al. Novel piperidine derivatives. Synthesis and anti-acetylcholinesterase activity of 1-benzyl-4-[2-(N-benzoylamino) ethyl] piperidine derivatives. J Med Chem,1990,33: 1880−1887)。

2.3 由内酰胺环演化为二氢茚酮母核——先导物的确定

将化合物6的N-CH₃与旁侧的苯基形成脂环,得到内酰胺化合物8,其抗乙酰胆碱酯酶活性略有提高,IC₅₀ = 98 nmol·L⁻¹,将8中的酰胺氮原子换成CH,即内酰胺环变成二氢茚酮母核,化合物9的IC₅₀ = 230 nmol·L⁻¹ (消旋物),活性稍有降低。将9中连接茚酮与哌啶的亚乙基缩短为亚甲基,化合物10的IC₅₀ = 150 nmol·L⁻¹ (消旋物)。可以看出,将柔性的开链骨架演化成具有刚性的二氢茚酮为母核的骨架,活性没有显著的改变。从而将化合物10确定为先导化合物进行系统的结构优化。

3 先导化合物的优化

前述的hit-to-lead是分散的非系统性的变换,与先导物的系统优化是不同的。下述的优化过程是将化合物10分成4个片段 (图 1),进行逐段优化。

3.1 片段1:苯并环酮的优化和苯环上的修饰

化合物10的二氢茚酮扩环成四氢萘酮11和苯并环庚酮12,评价它们对AChE的抑制活性,表明IC₅₀分别是130、2 100和15 000 nmol·L⁻¹,提示扩环对活性有不利影响,所以仍以10为基础骨架进行优化。

在化合物10的并苯环的4、5、6和7位置上分别用甲氧基作单取代或双取代,报道了9个化合物,对AChE的抑制活性都强于无取代的10,IC₅₀值5.7～ 85 nmol·L⁻¹。其中化合物13和14活性最高,IC₅₀值分别为6.4和5.7 nmol·L⁻¹。

3.2 片段2:亚甲基的变换

将活化14的片段2 (-CH₂-) 用单键替换,或用不饱和的 =CH、CH= 替换,抑制活性都有不同程度的下降; 用二亚甲基、三亚甲基、四亚甲基或五亚甲基置换,其中三亚甲基化合物的IC₅₀ = 1.5 nmol·L⁻¹,强于14,而其余的活性都弱于14,有趣的是亚甲基链为奇数的化合物比相邻的偶数链化合物的活性高。

3.3 片段3:哌啶环的变换

将化合物14的片段3哌啶环的连接方式变换180°,化合物15的活性降低80多倍,IC₅₀ = 480 nmol·L⁻¹,提示连接方式的重要性。用哌嗪环替换的化合物16,活性仍不及14,IC₅₀ = 94 nmol·L⁻¹,说明化合物14 的片段3环的配置和连接方式已是优化状态。

3.4 片段4:苄基的变换

化合物14苄基的苯环上作不同位置的甲基或硝基取代,发现间位取代的化合物17和18的活性略强于14,IC₅₀分别为2.0和 4.0 nmol·L⁻¹,而其他位置的取代均低于14,说明间位取代有利于同酶的结合。用环己甲基、苯乙基或2-萘甲基替换苄基,所得的化合物活性都降低 (Sugimoto H,Iimura Y,Yamanishi Y,et al. Synthesis and structure-activity relationships of acetylcholinesterase inhibitors: 1-benzyl-4-[(5,6-dimethoxy-l-oxoindan-2-yl) methyl]piperidine hydrochloride and related compounds. J Med Chem,1995,38: 4821−4829)。

4 候选化合物的选择: 多奈哌齐

通过上述的诸片段的依次优化,综合构效关系,仍显示化合物14为优秀的化合物,进一步评价14的选择性作用,表明对BuChE的抑制作用很弱,IC₅₀ = 7 138 nmol·L⁻¹,与抑制AChE的IC₅₀ = 5.7 nmol·L⁻¹相差1 252倍。对大鼠灌胃5 mg·kg⁻¹,4 h后对脑中的 乙酰胆碱酯酶仍然受到完全抑制。化合物14制成盐酸盐,命名为盐酸多奈哌齐 (donepezil hydrochloride),患者口服生物利用度F几近100%,血浆半衰期t_1/2 = 70 h,适于日服一次,经临床研究,于1997年首先在美国上市 (1999年在日本上市),治疗中度阿尔茨海默症患者。多奈哌齐分子中含有1个手性碳原子,该碳原子处于羰基的α位置,容易发生酮−烯醇的互变异构而消旋化,所以临床应用的多奈哌齐是消旋体。

5 多奈哌齐与乙酰胆碱酯酶的结合模式

多奈哌齐作为AChE可逆性抑制剂,与底物乙 酰胆碱的结合模式有相当大的区别。AChE的活性中心是个由多个芳香性氨基酸残基构成的峡道 (4.5 Å × 20 Å),ACh-AChE复合物晶体结构表明,季铵离子在峽道的底部,与Trp84发生N⁺-π相互作用,Gly118与Gly119构成的氧负离子穴接近于乙酰胆碱的羰基氧。然而多奈哌齐与AChE的结合则复杂的多,图 2a是多奈哌齐-AChE复合物晶体结构的结合图,图 2b是多奈哌齐与AChE的分子对接模拟图,二者非常相似。多奈哌齐与乙酰胆碱酯酶大体由5个关键结合位点 (KBI) 构成: ① 茚酮的苯环与Trp279形成π-π堆积作用 (KBI 1); ② 甲氧基与Arg289 (经结构水介导) 形成氢键结合 (KBI 2); ③ 茚酮的羰基氧原子经水分子介导与Phe288氢键结合 (分子模拟的羰基与Tyr70或121氢键结合) (KBI 3); ④ 哌啶经质子化形成的铵离子没有像乙酰胆碱的季铵离子沉入底部与Trp84结合,而是在“半途”与Phe330形成N⁺-π相互作用、与Asp72成盐以及与Tyr121氢键结合 (KBI 4); ⑤ 苄基沉入到峽道底部,与Trp84发生π-π堆积作 用 (KBI5) (Inoue A,Kawai T,Wakita M,et al. Thesimulated binding of ((±)-2,3-dihydro-5,6-dimethoxy- 2-[[1-(phenylmethyl)-4-piperidinyl] methyl]-1H-inden- 1-one hydrochloride (E2020) and related inhibitors to free and acylated acetylcholinesterases and corresponding structure-activity analyses. J Med Chem,1996,39: 4460−4470; Sussman JL,Harel M,Frolow F,et al. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein. Science,1991,253: 872−879)。