香樟 [Cinnamum camphora (L.) Presl] 是我国的珍贵药用和经济树种,其根、枝、叶中富含大量的精油 (也称挥发油,essential oil),因此被广泛应用于化工、医药、食品等工业^{[1, 2]}。根据香樟精油中所含主要成分的不同,可以把香樟划分为脑樟、芳樟、油樟、异樟和龙脑樟5种化学类型^[3],它们所含主要成分樟脑、芳樟醇、桉叶素、异橙花叔醇和龙脑已被证实具有镇痛^{[4, 5]}、抗炎^[6,7]、抗菌^{[8, 9]}、抗癌^[10]等重要的药理作用。林木类药材,生长周期长,杂交优势也会随世代的增加而减弱,为加速育种,人们开始利用分子生物学的相关技术对香樟进行研究,其中包括分子标记^[11]、基因的分离与克隆^{[12, 13]}以及基因工程^{[14, 15]}。目前正在对香樟的全基因组进行测序、拼接^[16],江香梅等^[17]也对5种化学类型的香樟叶片转录组进行了测序,共获得156 278个Unigene。香樟的分子生物 学研究仍处于起步阶段,对于香樟基因表达调控机制鲜有报道。

萜类(terpenoids) 化合物正是香樟精油的重要组成部分。近年来,有关萜类物质的生物合成途径已被逐步阐明^[18]。萜类前体物质通常存在于细胞质的甲羟戊酸(MVA) 途径和质体的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸 (MEP) 途径中^[19]。DXR是MEP途径上游的第二个限速酶,也是细胞质体内类异戊二烯化合物代谢的重要调控位点,它含有两个NADPH功能结合基序 (motif) 和两个DXR功能结合基序^[20],催化1-脱氧木酮糖-5-磷酸 (DXP) 形成MEP^[21],再经过一系列酶的催化反应后及结构修饰^[22],最后生成功能各异的萜类物质。已有报道称,薄荷 (Mentha haplocalyx) 中DXR基因的上调对薄荷精油的产量有明显的促进作用^[23],超表达阳春砂 (Amomum villosum) 中DXR基因导致萜类物质光合色素叶绿素和类胡萝卜素含量的上升^[24]。因此,DXR活性的高低决定了DXP用于萜类物质合成的比例,从而对香樟精油类化合物的合成起到十分重要的作用。目前已从红豆 杉(Taxus chinensis)、山鸡椒 (Litsea cubeba)、当归 (Angelica sinensis)、枇杷 (Eriobotrya japonica)、雷公藤 (Tripterygium wilfordii) 等药用植物中克隆分离了DXR基因^[23-29]。但香樟萜类生物合成、功能基因开发和利用方面的研究较少,香樟DXR基因的克隆及序列分析未见报道。

本研究以香樟为材料,在前期转录组测序的基础上,利用3' RACE技术得到香樟CcDXR1基因cDNA的全长,对氨基酸序列进行生物信息学分析,并对香樟不同组织、不同生长时期叶片及不同化学型叶片中CcDXR1基因的表达特性进行分析,为解析香樟植物中萜类生物合成途径及提高精油类化合物的含量提供了一定的参考。

材料 香樟 (Cinnamum camphora),采集自江西省龙脑樟繁殖基地,栽于中国中医科学院温室,其中包括龙脑樟、脑樟、芳樟、油樟、异樟5种化学型。新鲜的根、枝和叶采集后立即用液氮速冻,−80 ℃保存,用于提取总RNA; Trans 5α感受态细胞购自于北京全式金生物技术有限公司。

试剂 超快新型植物RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司; 焦碳酸二乙脂 (DEPC) 购自于西格玛奥德里奇 (上海) 贸易有限公司; 10 mmol·L⁻¹ dNTP、RiboLockRNase Inhibitor、RevertAid Reverse Transcriptase购自赛默飞世尔科技 (中国) 公司; LA Taq、DL2000 DNA Marker、SYBR^®Premix Ex Taq^TMⅡ、50×ROX Reference DyeⅡ购自宝生物工程 (大连) 有限公司; pGEM^®-T Easy载体、T4 DNA连接酶购自普洛麦格 (北京) 生物技术有限公司; 所有引物均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

仪器 MM400冷冻混合研磨仪 (Retsch,德国),5810R型低温冷冻离心机 (Eppendorf,德国),NanoDrop2000分光光度计 (Thermo Fisher Scientific,美国),9700 PCR仪(ABI,美国),TF 7500型Realtime PCR System (ABI,美国),紫外凝胶成像分析仪 (Gene,中国)。

总RNA的提取 香樟根、枝及叶总RNA的提取采用华越洋核酸提取试剂盒中的方法。实验中所 用到玻璃器皿、离心管和去离子水均用焦碳酸二乙 酯 (DEPC) 处理,以变性灭活RNase。将提取到的 总RNA进行1% 非变性琼脂糖凝胶电泳检测,判断RNA的完整性; 使用分光光度计测定吸光度 (A) 值和A₂₆₀/A₂₈₀、A₂₆₀/A₂₃₀ (A₂₆₀/A₂₃₀在1.8～2.0说明RNA无污染),以确定所提取总RNA的浓度及纯度; 并依照测定浓度确定下一步实验中合成cDNA所需模板的用量,其余RNA置于−80 ℃冰箱中保存。

CcDXR1基因cDNA全长的获得 二代转录组测序得到的unigene 26091为含部分ORF序列的DXR基因,序列比对发现缺少3' 端。根据已知的ORF序列片段,设计两个特异性引物 (表 1),进行3' RACE。反应体系: RNA 1 μg、10 μmol·L⁻¹锚定引物 (AP) 1 μL、加DEPC水至12 μL,65 ℃加热5 min,产物置于冰上冷却; 待产物冷却后,加入5×Reaction Buffer 4 μL、10 mmol·L⁻¹ dNTP 2 μL、RiboLockRNase Inhibitor 1 μL、RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL,混匀,42 ℃加热60 min,70 ℃加热5 min,产物置于冰上冷却,得到模板cDNA; 用序列特异引物 (GSP1) 与通用扩增引物 (AUAP) 组合,按以下体积进行第一轮扩增反应: LA Taq 0.5 μL、10×LA taq Buffer Ⅱ 5 μL、2.5 mmol·L⁻¹ dNTP 4 μL、cDNA 1 μL、Primer L 0.8 μL、Primer R 0.8 μL,加ddH₂O至 50 μL,反应条件为: 94 ℃预变性5 min,然后进行30个循环: 94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s; 循环结束后72 ℃延伸 10 min,4 ℃保温; 对PCR产物进行1% 非变性琼脂糖电泳检测,将所得PCR产物稀释100倍后进行第二轮扩增反应,体系与条件与第一轮相同,应用序列特异引物 (GSP2) 与通用扩增引物 (AUAP) 搭配进行。

表1(Table 1)

Table 1 Sequences of primers used in the CcDXR1 cloning Primer sequence(5'−3') Primer name 3'RACE GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT Adapter Primer(AP) GGCCACGCGTCGACTAGTAC Abridged Universal Amplification(AUAP) CCCTCTTCAACAAGGGTCTTGAA Gene-Specific Primer1(GSP1) CAGGATTCATCAGTTCTTGCTCAG Gene-Specific Primer2(GSP1) Full-length of cDNA GAGATGGCTTTGAAATCCCCACTG CcDXR1-F AGCTACCAATTAAGCCAGGAC CcDXR1-R

Table 1 Sequences of primers used in the CcDXR1 cloning

pGEM-CcDXR1重组载体的构建、转化及鉴定 PCR产物与T载体连接体系包括: T4 DNA连接酶的快速2×连接缓冲液5 μL、pGEM^®-T Easy载体1 μL (50 ng)、PCR产物2 μL、T4 DNA连接酶1 μL,无菌去离子水补充至10 μL,4 ℃孵育过夜。连接产物全部加入到50 μL置于冰上的感受态Trans 5α感受态细 胞中,冰浴30 min; 42 ℃热激45 s; 冰浴3 min。加入500 μL预热至室温的液体LB培养基,摇菌1 h (37 ℃,250 r·min⁻¹)。取50 μL菌液稀释一倍涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上,37 ℃培养过夜。次日挑选单菌落,进行菌落PCR检测,阳性克隆接种于含氨苄青霉素的液体培养基培养 (37 ℃,250 r·min⁻¹),培养过夜后送至美吉生物医药科技有限公司测序。

CcDXR1生物信息学分析 利用NCBI的ORF Finder分析该CcDXR1基因的最大开放阅读框 (ORF); 利用Prot Param Tool (http://web.expasy.org/protparam/) 分析蛋白的理化性质; 利用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 预测跨膜结构; 利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/) 进行信号肽分析; 利用DNAMAN 8.0进行多重序列比对; 利用MEGA6进行系统进化树的构建,bootstrap重复1000次。

香樟植株不同生长时期叶片、不同组织及不同 化学型中DXR基因的特异表达 Realtime PCR测 定香樟植株不同组织、不同生长时期叶片及不同化 学型的叶片中CcDXR1基因的表达量。采用在线工 具Primer Quest Tool (http://sg.idtdna.com/Primerquest/ Home/Index) 设计Realtime PCR引物,DXR-qPCR-L: CCCAAGCCTATCTCGATTGTT,DXR-qPCR-R: GTT CGGGTTCTCAGCTACTATG。反应体系: cDNA 1 μL、SYBR^® Premix Ex Taq 5 μL、Primer-L 0.2 μL、Primer-R 0.2 μL、ROX (Ⅱ) 0.2 μL、ddH₂O 3.4 μL,PCR反应条件为: 95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s。每个样品进行3次生物学重复及3次技术重复,数据采用2^−ΔΔCT公式进行分析。

统计分析 所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析。根、枝、叶间及不同化学型间的CcDXR1相对表达量差异性利用单因素方差分析。不同生长时期叶片的CcDXR1相对表达量差异利用独立样本t检验分析。

香樟叶片组织中含有的大量油脂和多糖类物质,在利用Trizol法和CTAB法提取香樟叶片总RNA的过程中,这些物质无法很好地去除,导致所提取的RNA浓度和纯度较低,且对反转录过程产生影响。在对比多种RNA提取方法后,最终选用北京华越洋RNA快速提取试剂盒进行RNA提取,该方法通过使用离心吸附技术,很好地去除了香樟中油脂、多糖和多酚类物质。RNA非变性琼脂糖凝胶电泳结果显示: 28S rRNA和18S rRNA条带清晰,没有其他杂质条带 (图 1),说明提取的总RNA的完整性较好; 经分光光度计测定A₂₆₀/A₂₈₀平均值为2.01,表明总RNA的纯度较高,可用于RACE、RT-PCR及之后的Realtime PCR实验。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Nondenaturing agrose gel electrophoresis of total RNA. M: DL2000 DNA marker; 1,2,3: RNA of C. camphora

为深入研究香樟精油的生物合成机制,利用二代测序技术对香樟进行转录组测序分析,从中得到2条DXR基因片段,其中unigene 26091包含了部分的ORF序列,长1 195 bp,将这段序列翻译成氨基酸序列与NCBI上其他物种的DXR蛋白序列比对发现,这段ORF包含了起始密码子,缺少3' 端序列。因此,根据已知的序列,以叶片的总RNA为模板,设计了巢式引物GSP1和GSP2,见表 1,利用3'RACE技术扩增DXR基因cDNA的3' 末端。DXR基因cDNA第一轮扩增因特异性不强,出现弥散条带,在第二轮扩增中,大约700 bp处有明亮、清晰的目的条带 (图 2),回收纯化该目的片段,且连接到pGEM-T Easy克隆载体上,转化Trans 5α。测序结果显示,所得序列与已知DXR 5' 端序列有222 bp的重叠片段,确认此片段为CcDXR1基因的一部分,经拼接后,获得CcDXR1全长序列,其开放阅读框为1 413 bp。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Amplification and detection of CcDXR1 3' RACE. M: DL2000 DNA marker; 1,2,3,4: Products of the nest-PCR

为进一步检验拼接序列的正确性,根据CcDXR1基因的ORF区重新设计该基因的上下游特异引物,进行PCR扩增,将回收纯化的目的片段连接到pGEM-T Easy克隆载体上,转化Trans 5α,从转化的平板上随机挑取4个克隆并分别用序列特异性引物 (CcDXR1-F、CcDXR1-R) 与载体通用引物 (T7、SP6) 进行菌落PCR扩增,单克隆1～4扩增出大小约为1 400 bp、 5～8扩增出带有部分载体片段的1 600 bp左右的明亮条带 (图 3),可能为阳性克隆,经菌液培养、测序,得出一段长度为1 413的编码区序列。序列比对分析后,发现该序列编码的是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 (DXR),在NCBI网站的GenBank数据库中进行注册,登录号为KU886266。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Positive clones of pGEM-CcDXR1. M: DL2000 DNA marker; 1,2,3,4: PCR products of specific primers; 5,6,7,8: PCR products of plasmid primers

运用在线工具Prot Param Tool对CcDXR1蛋白的理化性质进行分析,推测其分子式为C₂₃₀₀H₃₆₉₅N₆₁₅O₆₆₄S₁₅,分子质量为51.1 kDa,等电点 (theoretical pI) 为6.62,该蛋白的不稳定系数 (instability index) 为33.51,说明其较为稳定,脂肪系数 (aliphatic index) 为102.35,亲水性平均系数 (grand average of hydropathicity,GRAVY) 为0.006,说明其为疏水性蛋白 (GRAVY为负值,蛋白亲水)。利用TMHMM Server v.2.0预测跨膜结构,结果表明其位于膜外,不存在跨膜结构。利用SignalP 4.1 Server进行信号肽分析,结果表明其为非分泌蛋白,不存在信号肽。不同植物DXR的相对分子质量、理论等电点、疏水性氨基酸的比例等理化性质基本一致^[30]。

对克隆得到的CcDXR1基因进行初步的序列分析,其编码470个氨基酸。Blastp比对结果显示,该序列与NCBI基因库中茶树CsDXR (AKE33276.1) 同源性最高 (88%),其次为软枣猕猴桃AaDXR (87%,AID55340.1)、橡胶树HbDXR (87%,ABD92702.1)、番茄SlDXR (86%,AAK96063.2)、烟草NtDXR (86%,ABH08964.1) 和当归AsDXR (85%,AAL37560.1)。说明DXR蛋白氨基酸序列在系统进化上有高度的保守性,将其与CcDXR1氨基酸序列进行多重序列比对 (图 4),结果发现完全一致的氨基酸占总氨基酸数的73.6%,这进一步证实了本实验克隆所得的CcDXR1基因确为DXR家族基因。对CcDXR1蛋白进行保守结构域分析,发现第76～204个氨基酸、第218～301个氨基酸和第333～456个氨基酸处分别具有DXP_reductoisom、DXP_redisom_C和DXPR_C蛋白超家族序列区域 (图 4),这3个保守结构域的功能是在NADPH存在下催化DXP转化成MEP,为CcDXR1蛋白的功能结构域。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Multiple comparison of amino acid sequence of DXR in C. camphora and other plant species

从NCBI的非冗余蛋白数据库 (Nr) 中选取与CcDXR1基因编码蛋白相似性较高的11条蛋白序列,分别来自于苔藓类植物、藻类植物、蕨类植物、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。利用MEGA 6.0软件通过Neighbor-Joining (NJ) 法构建氨基酸序列的进化树,结果 (图 5) 显示,其中绿藻植物杜氏盐藻为外力群; 苔藓植物钝鳞紫背苔与蕨类植物蛇足石杉聚为一类; 裸子植物火炬松聚为一类; 双子叶植物黄花蒿和亚麻聚为一类,香樟与白桦聚为一类,但与单子叶植物水稻和玉米及双子叶植物番茄和烟草也有较高的同源性,从进化树分析,不同植物间DXR序列也有很高的同源性,推测其在进化过程中是相当保守的。表明其亲缘关系较近,可能具有相似的功能。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Phylogenetic tree of CcDXR1 (KU886266) with other plant DXRs. The DXR sequences were obtained from the GenBank database. Plant origin: Betula platyphylla DXR (AHX36947.1); Oryza sativa DXR (AAL37560.1); Zea mays DXR (NP_001105139.1); Morus notabilis DXR (XP_010101212.1); Solanum lycopersicum DXR (NP_001234553.2); Nicotiana tabacum DXR (ABH08964.1); Artemisia annua DXR (AAD56391.2); Linum usitatissimum DXR (CAF22092.1); Pinus taeda DXR (ACJ67022.1); Plagiochasma appendiculatum DXR (AFM78686.1); Huperzia serrata DXR (AHJ38612.1); Dunaliella salina DXR (ACT21081.1); Dunaliella salina DXR is an out-group

已有报道香樟根与叶的含精油量远高于枝中,龙脑樟叶片含精油量高于其余4个品系叶片中所含精油量^[31]。本实验利用实时荧光定量PCR检测CcDXR1基因在香樟不同化学型的表达量。首先对Realtime PCR引物进行了筛选,扩增曲线显示Actin和CcDXR1引物的扩增效率良好,Ct值在24～32;熔点曲线分析也充分表示扩增曲线有良好的特异性,表现为单峰,

无非特异性荧光峰,Actin和CcDXR1的熔点曲线峰值分别出现在83 ℃和79 ℃。选取了成熟和新生长的香樟的叶片,香樟成熟叶片 (革质) 与幼嫩叶片 (纸质) CcDXR1基因的表达量结果显示 (图 6A),CcDXR1在成熟叶片中的表达量为幼嫩叶片的2.2倍,说明不同时期的叶片DXR的表达存在差异。香樟根、枝、叶 (成熟) 组织中CcDXR1相对表达量的结果显示,CcDXR1在植株各组织中均有表达,根和叶中表达量相当 (图 6B),为枝的3倍左右。分析油樟、龙脑樟、异樟、脑樟和芳樟5种化学型叶片中CcDXR1相对表达量,得出CcDXR1在各化学型叶片中均有表达,以龙脑樟中表达量最高,分别是油樟的3.2倍、异樟的4.8倍、脑樟的5倍和芳樟的9倍 (图 6C)。这一结果与香樟中精油含量的差异基本一致,说明CcDXR1基因很可能是调控香樟精油生物合成过程中的关键催化节点。

Figure 6

Figure 6

Figure 6 Relative expression levels of CcDXR1. A: Relative expression levels of CcDXR1 inyoung leaves and mature leaves of C. camphora. ***P < 0.001; B: Relative expression levels of CcDXR1 in roots,branches and leaves of C. camphora.P < 0.01; C: Analysis of the expression level of CcDXR1 gene in different chemotypes of C. camphora. P < 0.01

单萜类化合物作为香樟的次生代谢产物之一,是构成香樟精油的主要成分,解析香樟单萜类的生物合成途径是阐明香樟精油产生机制和提高精油产量的分子基础^[32-34]。DXR基因作为MEP途径上的 第二个限速酶,对植物单萜、二萜和四萜及其衍生 物的生物合成具有重要的调控作用^[35]。已有报道,薄荷 (Mentha haplocalyx) 的DXR基因与薄荷精油的生成密切相关^[23]; 含油玫瑰(Rosa rugosa) 的DXR基因与玫瑰精油的生物合成呈正相关性^[36]; 丹参 毛状根DXR基因的转录水平上调与丹参酮类化合 物含量的增加保持一致^[37]; 欧风轮属植物 (Satureja khuzestanica) 中香芹酚含量的变化与DXR基因表达水平的变化有关^[38]。然而在香樟中,萜类生物合成 途径上的关键酶基因的研究较少,限制了香樟精油合成生物学的研究。本研究首次从香樟叶片cDNA中扩增出CcDXR1基因cDNA的全长,并通过多序列 比对,发现CcDXR1与茶、软枣猕猴桃、橡胶树、番茄、烟草、当归的DXR序列同源性达85% 以上,其编码的CcDXR1蛋白具有保守的DXP催化位点和蛋白结构。

已有研究表明DXR基因在植物中的表达具有组织特异性,其在当归 (Angelica sinensis)、雷公藤 (Tripterygiun wilfordii) 及鱼腥草 (Houttuynia cordata) 的叶中表达量最高^{[27, 29, 39]},在蛇足石杉 (Huperzia serrata) 的根中^[40]、铁皮石斛 (Dendrobium officinale) 的根及茎中^[41]表达量较高。本研究发现香樟CcDXR1的表达量在成熟叶片中高于幼嫩叶片中,说明成熟叶片对萜类化合物合成的能力很可能要高于幼嫩叶片; 而在根和叶片组织中的表达量相当,并且明显高于枝中的表达量,这一结果显示CcDXR1基因具有组织特异性的表达模式,并且它可能主要在香樟的根与叶中发挥生物学功能。根据5种化学型CcDXR1基因表达量的检测结果发现,龙脑樟中CcDXR1基因的表达量高于另外4种化学型香樟,这一结果与徐有明等^[31]对香樟5种化学型精油含量的检测结果一致,说明CcDXR1基因表达量的高低与香樟精油含量的高低呈正相关。由此可见,不同植物的DXR结构相似,植株的大部分组织器官中都有表达,植株体内上调DXR基因的表达,可能增加萜类物质的含量。本研究克隆了香樟CcDXR1基因cDNA的全长,并对该基因在香樟不同组织和化学型的特异性表达进行了分析,为揭示香樟药材品质形成及种质遗传改良提供重要的参考。