五酯片 (Wuzhi tablet,WZ) 是华中五味子的乙醇提取物制剂,主要活性成分为木脂素类化合物,包括五味子甲素 (schisandrin A)、五味子乙素 (schisandrinB)、五味子丙素 (schisandrin C)、五味子醇甲 (schisandrolA)、五味子醇乙 (schisandrol B)、五味子酯甲 (schisantherinA) 等^[1],具有抗肝细胞损伤、改善肝细胞代谢的作用,常用于辅助治疗各种类型肝损伤^[1-3]。许多文献^{[4, 5]}报道,五味子提取物及其活性成分可以抑制体外CYP3A的活性。作者^[6-9]的研究亦表明单次灌胃给予五酯片及其活性成分可以使大鼠体内CYP3A底物——他克莫司、环孢素及紫杉醇等的血药浓度显著升高。但是,长期服用五酯片对CYP3A活性的影响,以及五酯片是否通过影响CYP3A基因及蛋白表达从而影响其活性尚未清楚。因此,本研究利用实时荧光定量PCR及Western blot法考察五酯片对CYP3A基因及蛋白表达的影响,并利用经典CYP3A探针药——咪达唑仑评价长期灌胃给予五酯片对大鼠体内CYP3A活性影响,阐明五酯片对CYP3A的长期作用。

药品与试剂 五酯片 (广西方略药业有限公司,批号: 090910); 咪达唑仑 (midazolam,MDZ,5 mg×1 mL/ 支,江苏恩华药业股份有限公司,批号: 20090501);地塞米松 (dexamethasone,Dex,≥98%,Sigma公司); 肝素钠注射液 (常州千红生化制药股份有限公司,批号: 090625); PE插管 (Polythene 0.98 mm OD,浙江安莱科技有限公司); Trizol试剂 (Invitrogen公司); RT试剂盒 (日本Takara公司); SYBR^®Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒 (日本 Takara公司); Tris (晶欣生物科技公司,批号: 20100327); 硼酸 (天津市百世化工有限公司,批号: 20090630); RIPA蛋白提取试剂 (上海博彩生物科技有限公司); 苯甲基磺酰氟 (上海博彩生物科技有限公司); 丙烯酰胺 (广州国奥生物技术有限公司); N,N '-亚甲基双丙烯酰胺 (广州国奥生物技术有限公司); BCA蛋白测定试剂盒 (Thermo Scientific公司); 色谱分析实验中所用试剂均为色谱纯。

仪器 Roche lightcycler 2.0定量PCR仪(德国罗氏仪器有限公司); PCR仪 (Biometra梯度PCR仪);Mini-PROTEAN3电泳系统 (美国Bio-Rad公司); Mini Trans-Blot转移系统 (美国Bio-Rad公司); GDS-8000UVP凝胶成像系统 (美国UVP公司); 5417-R低温高速离心机 (德国Eppendorf公司); Surveyor高效液相-质谱联用仪 (美国Finnigan公司)。

实验动物 清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠27只,220～240 g,由中山大学实验动物中心提供 (合格证号: SCXK (粤) 2009-0011),于SPF级环境饲养,动物室内温度20～25 ℃、相对湿度40%～70%、换气次数10～15次/h,保持12 h光照循环; 期间自由饮水进食,提供实验室标准动物饲料,符合我国《实验动物管理条例》和《医学实验动物管理实施细则》。

五酯片对大鼠肝脏和肠道CYP3A基因及蛋白表达的影响 12只雄性SD大鼠随机分成3组,一 组连续灌胃给予五酯片混悬液14天 (WZ group,0.25 g·kg^-1),一组则灌胃给予相同体积的蒸馏水 (control group),另一组连续灌胃给予蒸馏水10天后继续灌胃给予地塞米松 (Dex group,100 mg·kg^-1)4天。以上所有大鼠最后一次给药后,禁食12 h,次日断头取其肝脏及肠道 (幽门至幽门以下50 cm),用生理盐水将肝脏表面血迹及肠道内容物冲洗干净,用干净的刀片将小肠黏膜刮下,马上置液氮中保存,按作者已经建好的方法提取RNA及蛋白^[10]。采用实时荧光定量PCR方法检测大鼠肝脏及肠道Cyp3a1 (引物: Cyp3a1-F 5'-GGAAATTCGATGTGGAGTGC-3',Cyp3a1-R 5'-AGGTTTGCCTTTCTCTTGCC-3')、Cyp3a2 (引物: Cyp3a2-F 5'-AGTAGTGACGATTCCAACATAT- 3',Cyp3a2-R 5'-TCAGAGGTATCTGTGTTTCCT-3')、Cyp3a9 (引物: Cyp3a9-F 5'-TGGTTATCAGCCTGGTGC-3',Cyp3a9-R 5'-AAAGTTCCGTCGGTTTGT-3')、Cyp3a18 (引物: Cyp3a18-F 5'-TGATGCCACAAGCA CCTC-3',Cyp3a18-R 5'-AGACTTTCATTCACCACC- 3')、内参Gapdh(引物: Gapdh-F 5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3',Gapdh-R 5'-ATGGTGGTGAAG ACGCCAGTA-3') mRNA含量^[11]。采用作者已经建好的Western blot的方法检测CYP3A蛋白含量^[10]。

五酯片对大鼠体内咪达唑仑的药动学影响 另取15只大鼠随机分成3组,其中两组连续灌胃给予五酯片混悬液14天 (0.25 g·kg^-1),一组则灌胃给予相同体积的蒸馏水 (空白对照组)。第14天,大鼠行右颈静脉插管手术^[6-9]。术后恢复12 h后用于实验,给药前12 h禁食。第15天,连续灌胃给予五酯片混悬液14天的2组大鼠,其中一组先灌胃给予五酯片混悬液 (0.25 g·kg^-1) 再灌胃给予咪达唑仑 (2 mg·kg^-1,合用五酯片组,WZ coadministeredgroup),另一组 给予同体积的蒸馏水后再灌胃给予咪达唑仑 (五酯片预处理组,WZ pretreatment group); 空白对照组则给予同体积的蒸馏水后再灌胃给予咪达唑仑; 于给药前 (0 h)、给药 (咪达唑仑) 后0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3和4h从右颈静脉插管处取血约0.25 mL。取血后即从插管处补充同体积的肝素化生理盐水(含50 U·mL^-1肝素的生理盐水),所取 血样12 000 r·min^-1离心10 min,立即精密吸取上清100 μL置2 mL EP管中,置-80 ℃保存。

数据分析 血样按作者^[12]建立的LC-MS/MS方法检测血浆中咪达唑仑、1'-羟基咪达唑仑的浓度,并用PKPP药动学软件包计算药代动力学参数^[6-9]。统计学分析用方差分析及非参数检验,P < 0.05有统计学意义。数据处理软件为SAS 8.1(SAS Ver.8.1,SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA) 统计学软件。

长期灌胃给予五酯片对大鼠肝脏CYP3A基因表达的影 响见图 1。在大鼠肝脏中,长期灌胃给予五酯片组的 Cyp3a1、Cyp3a2、Cyp3a9、Cyp3a18 mRNA表达分别为空白对照组的1.55 ± 0.41、1.21 ± 0.41、2.88 ± 0.84、1.36 ± 0.41(P < 0.05) 倍。长期灌胃给予五酯片使大鼠肝脏中Cyp3a1及Cyp3a9 mRNA表达分别升高54.6% 及188.3%(P < 0.05),而对其他基因包括Cyp3a2、Cyp3a18 mRNA表达影响不大。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Changes in mRNAexpression of hepatic Cyp3as of rats after oral administered Wuzhi tablet (WZ,0.25 g·kg-1) for 14 consecutive days or dexamethasone (Dex,100 mg·kg-1) for 4 consecutive days,data were expressed as fold expression compared withvehicle treatment. n = 4,x± s. P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.01 vscontrol group

长期灌胃给予五酯片对大鼠肠道CYP3A基因表达的影响见图 1。在大鼠小肠中,长期灌胃给予五酯片组的Cyp3a9、Cyp3a18 mRNA表达分别为空白对照组的1.48 ± 0.18 (P < 0.05)、1.27 ± 0.44倍。长期灌胃给予五酯片使大鼠肠道中Cyp3a9 mRNA表达升高48.2% (P < 0.05),而对Cyp3a18 mRNA表达影响微弱。

长期灌胃给予五酯片对大鼠肝脏、肠道CYP3A蛋白表达的影响见图 2。在大鼠肝脏中,长期灌胃给予五酯片组的CYP3A蛋白的表达为空白对照组的1.43 ± 0.47倍。在大鼠小肠中,长期灌胃给予五酯片组CYP3A的蛋白表达为空白对照组的0.91 ± 0.14倍。长期灌胃给予五酯片使大鼠肝脏CYP3A的蛋白表达升高43.2%,但对大鼠肠道CYP3A蛋白表达影响微弱。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Changes inprotein expression of hepatic CYP3A of rats after long-term treatment of WZ (0.25 g·kg-1) for 14 consecutive days or Dex (100 mg·kg-1) for 4 consecutivedays,data were expressed as fold expression compared with vehicle treatment. n = 4

长期灌胃给予五酯片对咪达唑仑药动学影响 的药时曲线见图 3,药动学参数见表 1。长期灌胃 给予五酯片后,未合用五酯片组 (即五酯片预处理组,WZpretreatment group) 咪达唑仑的AUC升高29.9%; 而合用五酯片组 (WZ coadministeredgroup) 咪达唑仑的AUC升高154.2%,咪达唑仑主要的代 谢产物1-羟基咪达唑仑的AUC与咪达唑仑AUC之比 (AUC_M/AUC_P) 降低了54.8%。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Plasmaconcentration-time profiles of midazolam (MDZ) (A),1-hydroxylation midazolam(1-OH MDZ) (B) of rats after oral administrations of MDZ (2 mg·kg-1)with or without WZ (0.25 g·kg-1)pretreated for 14 days. n = 5,x± s

表1(Table 1)

Table 1 Pharmacokineticparameters of MDZ and 1-OH MDZ of rats after oral administrations of MDZ (2 mg·kg-1)with or without WZ (0.25 g·kg-1)pretreated for 14 days. n = 5,x± s. Con: Controlgroup,MDZ alone group; WZ pretreatment/ coadministered:Rats of the pretreatment group and the coadministered group were gavaged with WZ(0.25 g·kg-1)for 14 consecutive days. On day 15,rats inthe control group and the pretreatmentgroup received a vehicle (water),while those inthe coadministered group were given with WZ (0.25 g·kg-1).AUCM/AUCP: AUC of 1-OH MDZ/AUC of MDZ Parameter Con WZ Pretreatment Coadministered MDZ Cmax /ng·mL-1 125.6 ± 59.7 111.5 ± 19.2 181.9 ± 180.3 tmax /h 0.18 ± 0.07 0.17 ± 0.06 0.56 ± 0.63 t1/2 /h 0.67 ± 0.16 0.68 ± 0.11 1.19 ± 0.45 MRT /h 0.64 ± 0.09 0.76 ± 0.20 1.31 ± 0.33 Vz /L·kg-1 32.9 ± 16.9 23.9 ± 8.2 27.3 ± 21.0 CLz /L·h-1·kg-1 32.9 ± 13.4 24.3 ± 6.5 15.0 ± 10.5 AUC0-4 h /ng·h·mL-1 65.5 ± 21.1 85.1 ± 25.0 166.5 ± 91.6 AUC0-∞ /ng·h·mL-1 67.3 ± 20.9 87.5 ± 25.5 176.8 ± 89.3 1-OH MDZ Cmax /ng·mL-1 39.2 ± 29.7 32.0 ± 5.8 19.1 ± 13.6 tmax /h 0.23 ± 0.04 0.22 ± 0.04 0.38 ± 0.14 t1/2 /h 0.64 ± 0.07 0.73 ± 0.15 1.30 ± 0.48 MRT /h 0.72 ± 0.11 0.82 ± 0.22 1.35 ± 0.23 AUC0-4 h /ng·h·mL-1 20.0 ± 8.6 25.8 ± 4.0 22.6 ± 6.9 AUC0-∞ /ng·h·mL-1 21.2 ± 8.6 27.6 ± 4.4 28.0 ± 6.3 AUCM /AUCP 0.31 ± 0.08 0.30 ± 0.06 0.14 ± 0.06

Table 1 Pharmacokineticparameters of MDZ and 1-OH MDZ of rats after oral administrations of MDZ (2 mg·kg-1)with or without WZ (0.25 g·kg-1)pretreated for 14 days. n = 5,x± s. Con: Controlgroup,MDZ alone group; WZ pretreatment/ coadministered:Rats of the pretreatment group and the coadministered group were gavaged with WZ(0.25 g·kg-1)for 14 consecutive days. On day 15,rats inthe control group and the pretreatmentgroup received a vehicle (water),while those inthe coadministered group were given with WZ (0.25 g·kg-1).AUCM/AUCP: AUC of 1-OH MDZ/AUC of MDZ

实验中,五酯片给药天数的确定是参考相关文献。由于药物对于CYP450酶产生的诱导作用与药物本身特性、半衰期及与CYP450酶半衰期有关。当给药时间持续4～14天,药物对代谢酶是否具有诱导作用一般都能体现^[13]。因此,本实验选用连续灌胃给予五酯片14天,以考察长期灌胃给予五酯片对大鼠体内CYP3A基因和蛋白表达及酶活性的影响。据文献^[14]报道,Cyp3a基因亚型在大鼠体内的分布存在组织差异。在大鼠肝脏主要为Cyp3a1、Cyp3a2、Cyp3a9、Cyp3a18等基因; 而在大鼠小肠中,只能检测得到Cyp3a9及Cyp3a18,检测不到Cyp3a1及Cyp3a2。因此,在肝脏中选择考察Cyp3a1、Cyp3a2、Cyp3a9及Cyp3a18等目的基因的变化,以反映长期灌胃给予五酯片对大鼠肝脏Cyp3a基因表达 (mRNA) 的影响; 而在小肠中,则选择考察Cyp3a9及Cyp3a18等目的基因的变化,以反映长期灌胃给予五酯片对大鼠肠道Cyp3a表达的影响。由于作者的预实验结果表明五酯片对大鼠小肠上、中、下段Cyp3a基因表达影响 的趋势相同,因此,本实验有针对性地考察长期灌胃给予五酯片对大鼠小肠上段 (幽门至幽门以下50 cm) Cyp3a基因表达的影响。

本实验通过考察长期灌胃给予五酯片对大鼠体内CYP3A基因和蛋白表达及对经典探针药——咪达唑仑药动学的影响,评价长期灌胃给予五酯片对CYP3A基因、蛋白表达及活性的影响,初步阐明中药五酯片对CYP3A的影响机制。结果表明,长期灌胃给予五酯片使大鼠肝脏CYP3A基因、蛋白表达升高,却使咪达唑仑的AUC升高。作者研究组另外的研究表明: 灌胃给予五酯片10 h后,大鼠全血、肝脏及肠道中基本检测不到五酯片各木脂素活性成分。但是本研究中,长期灌胃给予五酯片间隔24 h后仍可使大鼠体内咪达唑仑的AUC升高29.9% (未合用五酯片组),证实长期灌胃给予五酯片可抑制CYP3A的活性。可见,五酯片诱导CYP3A mRNA及蛋白表达,却可抑制CYP3A的蛋白活性。五酯片这种对CYP3A基因、蛋白表达水平与酶活性影响不一致的现象提示: 五酯片并非通过降低CYP3A基因、蛋白表达而降低其活性,五酯片对CYP3A存在双向调节机制。

从大量对药物代谢酶功能调控的研究可以发现,存在某些CYP450酶亚型的mRNA及蛋白的表达上升,但相应的活性却下降的现象。如红霉素是经典的CYP3A底物,亦为经典的CYP3A抑制剂,实验表明重复给予SD大鼠4 mmol·kg^-1红霉素可以诱导大鼠肝脏CYP450酶,但同时红霉素却与酶形成复合物使酶失去活性^{[15, 16]}。另有研究报道竹桃霉素亦可使CYP3A的蛋白表达升高,但同时抑制了CYP3A的蛋白活性^{[17, 18]}。国内的研究报道^[19]白蔹配伍乌头可以通过影响基因转录进而提高CYP1A2、CYP3A1/2的mRNA和蛋白质表达水平,但CYP1A2、CYP3A1/2酶的活性却下降。药物对CYP450酶活性的调控,作用在转录、转录后、翻译、翻译后蛋白修饰等水平上,因此,仅转录 (基因) 水平或者翻译 (蛋白) 水平的上调或者下调,并不能推知最后蛋白活性的增强或者减弱。五酯片对CYP3A基因、蛋白表达水平与酶活性影响不一致的现象提示: 在翻译水平之后可能存在影响和调节CYP3A活性的重要机制和因素,最终导致五酯片对CYP3A蛋白表达及对CYP3A生物活性影响不一致的现象,具体机制有待进一步研究。