药学学报  2016, Vol. 51 Issue (7): 1105-1109   PDF    
引用本文
YANG Jia-qiang, ZENG Fa-kun, YANG Xuan, LI Peng. Synthesis and antitumor activity of phosphonate derivatives containing amino acid[J]. Acta Pharm Sin, 2016, 51(7): 1105-1109.  
杨家强, 曾发奎, 杨旋, 黎鹏. 含氨基酸片段的膦酸酯衍生物合成与抗肿瘤作用[J]. 药学学报, 2016, 51(7): 1105-1109.  
含氨基酸片段的膦酸酯衍生物合成与抗肿瘤作用
杨家强1 , 曾发奎1, 杨旋2, 黎鹏1    
1. 遵义医学院药学院, 贵州 遵义 563003;
2. 曼尼托巴大学化学系, 加拿大 温尼伯 R3T4K6
收稿日期: 2016-01-18; 修回日期: 2016-02-14.
基金项目: 贵州省科技厅国际合作项目基金资助（黔科合外G字[2014]7013）；遵义市汇川区科技局资助项目（E-123）.
* 通讯作者: Tel: 86-851-28609461, Fax: 86-851-28609343, E-mail: yjqcn@126.com
摘要: 采用基于片段的药物发现方法，对前期研究的膦酸酯化合物进行优化，寻找抗肿瘤先导化合物。设计合成了15个含氨基酸片段的膦酸酯衍生物，经IR、1H NMR、13C NMR及元素分析确认结构。采用溴化噻唑蓝四氮唑（MTT）法进行了初步体外抗肿瘤细胞增殖活性研究。结果表明：目标化合物呈现不同的抗肿瘤活性，其中化合物4e、4n对A-549有明显增殖抑制作用，IC50分别为8.7±0.8、8.2±1.0 μmol·L-1；化合物4c对SGC-7901的IC50为9.8±0.9 μmol·L-1；化合物4l、4n对肿瘤细胞EC-109的增长具有显著抑制作用，IC50分别为9.5±0.6、9.4±0.5 μmol·L-1。
关键词: 膦酸酯     氨基酸     合成     抗肿瘤活性    
Synthesis and antitumor activity of phosphonate derivatives containing amino acid
YANG Jia-qiang1 , ZENG Fa-kun1, YANG Xuan2, LI Peng1    
1. School of Pharmacy, Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China;
2. Chemistry Department, University of Manitoba, Winnipeg, MB, Canada, R3 T4 K6
Abstract: In search of effective anticancer agents, fifteen new phosphonate derivatives were designed and synthesized. Their structures were clearly established by elemental analysis, IR, 1H NMR and 13C NMR, and their antitumor activities were evaluated by MTT assay. Preliminary results in bioactivity tests indicated that some title compounds exhibited better activity. Among the active compounds, compounds 4e, 4n had better inhibition effect on A-549 cells growth with IC50 values of 8.7±0.8, 8.2±1.0 μmol·L-1, the IC50 values of compound 4c was 9.8±0.9 μmol·L-1 against SGC-7901 cells and compounds 4l, 4n exhibited more potent activities against EC-109 with IC50 values of 9.5±0.6, 9.4±0.5 μmol·L-1.
Key words: phosphonate     amino acid     synthesis     antitumor activity    

有机磷化合物具有广泛的生物活性,尤其在抗肿瘤药物研究与应用中一直受到人们重点关注。如: 传统抗肿瘤生物烷化剂环磷酰胺,抑制法尼基焦磷酸合酶的抗肿瘤药物唑来膦酸等。2007年,Huang等[1]发现肌醇膦酸酯类似物通过抑制磷酸酯酶 (PI3K通路负调控子) 水解,稳定磷酸基团,呈现抗肿瘤作 用; 2008年, Palchaudhuri小组[2]报道了一些膦酸酯化合物与磷酰化氨基酸在结构上具有相似性,对肿瘤组织有很好的亲和性,能导致肿瘤细胞周期受阻,进一步抑制微管蛋白聚合; 2010年,Byun等[3]根据磷脂Sn-2位设计的膦酸酯衍生物,对前列腺癌呈现高度的选择性; 2012年,Song等[4]针对PI3K信号通路设计的两类膦酸酯类似物对非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞表现出较好的细胞毒活性。

本课题组前期也设计合成了不同系列膦酸酯衍生物,体外活性测试发现部分化合物对肿瘤细胞有较好的增殖抑制作用[5, 6, 7, 8, 9, 10]。分析已研究化合物的构效关系,推测共有的膦酸酯结构可能是其抗肿瘤活性片段。

众所周知,氨基酸是人体内重要的生理活性物质,是生物体内合成肽、蛋白质、激素、酶及抗体等物质的原料,参与多种生物化学过程,含氨基酸片段的化合物,如: 肽类、氮或碳取代的酸、酯、酰胺等,大多具有多种重要的生物活性[11, 12]。大量研究表明,氨基酸类衍生物由于生物兼容性好,容易渗透到组织中,极易穿透肿瘤细胞,提高免疫应答,抑制肿瘤生长和转移、诱发细胞凋亡、肿瘤坏死等特点,现已成为抗肿瘤药物分子设计的热点[13, 14],如: 临床应用的氨肽酶N抑制剂乌苯美司、蛋白酶体抑制剂硼替佐米,已进入临床Ⅲ期试验的血管生成抑制剂西仑吉肽等氨基酸衍生物。

本文以前期研究为基础,采用基于片段的药物发现 (FBDD) 方法,在膦酸酯结构中引入氨基酸片段,设计合成系列新型膦酸酯衍生物供抗肿瘤研究,以期获得抗肿瘤活性先导化合物。目标化合物的合成如合成路线1所示。

结果与讨论 1 化合物的合成

在合成中间体3的过程中,以3a为例,分别试验加入DCC/DMAP、EDCI/DMAP、HBTU/DIPEA体系催化该酰化反应。结果表明: 不同体系的催化剂均能较好的活化肽键的形成,但采用DCC/DMAP时,反应生成的杂质较难除去,而使用HBTU/DIPEA或EDCI/DMAP,对反应的影响无显著差异,从经济的角度出发,本研究选择EDCI/DMAP作为催化剂。

在制备目标化合物4时,脱Boc保护是关键,在脱保护的同时,需要保证目标结构中的酯键和酰胺不被破坏。以4a为例,分别选择三氟乙酸、盐酸、磷酸脱Boc保护,尝试改变酸的浓度、摩尔比,反应温度与时间,反应生成的杂质比较多,效果不理想,推测在脱Boc反应时,可能一并将酯键不同程度水解; 为了使得脱Boc保护能顺利进行,通过反复摸索,实验采用甲醇/乙酰氯体系,在冰盐浴下反应数小时能取得较好的脱保护效果。

目标化合物结构经IR、1H NMR、13C NMR及元素分析得以确证,理化数据见表 1和表 2。

Table 1 Physical property of compounds 4a-4o

Table 2 Spectral data of target compounds
2 抗肿瘤活性

抗肿瘤活性筛选表明: 目标化合物对肿瘤细胞A-549、SGC-7901、EC-109有不同程度的增殖抑制作用,结果见表 3。从表中可以看出,化合物4c、4e、4l、4n对A-549有较好的增殖抑制作用,IC50分别为10.1 ± 1.1、8.7 ± 0.8、10.6 ± 0.5、8.2 ± 1.0 μmol·L-1,尤以4e与4n最为突出,稍弱于对照药顺铂; 活性较好的化合物4c、4e、4j对SGC-7901的IC50分别为9.8 ± 0.9、13.2 ± 1.0、12.0 ± 1.3 μmol·L-1。从表中也可以看出,大多化合物对EC-109有较好的增殖抑制作用,其中活性较优的为化合物4j (IC50 = 10.4 ± 0.5 μmol·L-1)、4l (IC50 = 9.5 ± 0.6 μmol·L-1)、4n (IC50 = 9.4 ± 0.5 μmol·L-1),稍弱于对照药顺铂 (IC50 = 6.0 ± 0.9 μmol·L-1)。

Table 3 IC50 values of target compounds for different tumor cells

Scheme 1 Synthetic route of target compounds

进一步研究目标化合物的构效关系发现: 相同结构的L构型较D构型氨基酸衍生物有较优的抗肿瘤活性,可能与生物体内的氨基酸存在形式为L-构型有关; 同时大多含氟原子的化合物有更好的抗肿瘤活性。

同时,与本课题组前期设计合成的化合物进行比较,该类衍生物中部分化合物的抗肿瘤活性优于前期所研究的化合物,进一步表明氨基酸结构片段在抗肿瘤药物分子设计中呈现出的潜力。

3 小结

对膦酸酯类化合物的结构优化发现: 氨基酸片段的引入,能提高目标化合物对肿瘤细胞的抗增殖作用; 不同氨基酸片段结合形成的化合物对肿瘤细胞的抑制作用表现不同; 结构相同、构型不同的氨基酸衍生物的抗肿瘤活性呈现较大差异,值得进一步深入研究。

实验部分

用SGW X-4显微熔点仪测定熔点 (上海精密科学仪器有限公司,温度未校正); NMR用Bruker Avance 400型核磁共振仪测定 (TMS为内标); 红外光谱采用Varian傅里叶变换红外分光光度计; 元素分析数据用德国Elementar Vavio-Ⅲ型元素分析仪测得; 96孔板读取用ELX800酶标仪; 药品与试剂均为分析纯。

1 化合物的合成 1.1 中间体1与中间体2的合成

中间体1的制 备参照文献[15],在反应瓶中加入5 mmol氨基酸、 8 mmol NaOH及适量蒸馏水,冰盐浴 -5～0 ℃下,缓慢加入8 mmol Boc酸酐, 搅拌反应2 h,再室温搅拌过夜,然后用乙酸乙酯萃取2次,有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次,合并乙醇乙酯萃取过的母液 及碳酸氢钠洗涤液,所得水溶液用盐酸酸化后再用乙酸乙酯萃取2～3次,乙酸乙酯干燥后蒸除溶剂得产物; 中间体2的制备参照文献[5],在反应瓶中加入5 mmol三乙胺、10 mmol亚磷酸二乙酯与10 mmol苯甲醛,于油浴中加热到60～80 ℃,搅拌1.5 h,再室温搅拌过夜,减压浓缩,用石油醚重结晶。

1.2 目标化合物的合成

取中间体1 (4 mmol) 和 中间体2 (4 mmol) 加入到50 mL三口瓶中,再加入DMAP (4.1 mmol),以二氯甲烷 (15 mL) 为溶剂,搅拌溶解,冰盐浴 (-5～0 ℃) 下,用恒压滴液漏斗缓慢滴加EDCI (4.1 mmol,二氯甲烷15 mL溶解),30 min滴加完毕,室温反应10～12 h,过滤,除去 不溶物,浓缩,柱色谱法 (乙酸乙酯-石油醚1∶1) 分离纯化,得中间体3。在反应瓶中加入乙酸乙酯 (4 mL),冰盐浴 (-5～0 ℃) 下充分搅拌,依次加入甲醇 (0.8 mmol) 和乙酰氯 (0.8 mmol),维持该温度,反应约3 h。然后将中间体3 (0.5 mmol,用5 mL乙 酸乙酯溶解),缓慢加入上述反应体系,冰水浴下搅拌反应8～10 h,减压浓缩,得粘稠液体,柱色谱 (氯仿-甲醇8∶1) 分离纯化,真空干燥,得到目标物4。

2 MTT法抗肿瘤活性实验

采用MTT法[16],以顺铂为对照,测定目标化合物对肿瘤细胞A-549、SGC-7901和EC-109的增殖 抑制作用,两点法 (Reed and Muench法) 计算其IC50值。

参考文献
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