苯磺酸氨氯地平是新型二氢吡啶类钙离子拮抗剂,对血管选择性高,主要作用于外周血管,也可扩张冠状动脉和肾动脉。该药物适用于各型高血压的治疗,也可用于稳定型心绞痛患者。目前,已有多篇文献报道苯磺酸氨氯地平血浆生物样品检测方法,主要包括高效液相色谱紫外检测 (HPLC-UV)^[1]、液相色谱串联质谱法 (LC-MS/MS)^{[2, 3, 4, 5]}等。由于LC-MS/MS法具有灵敏度高、选择性好以及较高的分析通量,已成为检测生物样品的主流方式。但由于质谱检测是基于化合物离子化并通过特定的质荷比来检测和定量的,所以任何干扰待测物离子化的物质都可能影响检测方法的灵敏度和选择性。因此,2015版中国药典要求生物分析方法基质因子变异系数应控制在15%以内^[6]。但是,有关氨氯地平分析方法鲜有文献针对其基质效应进行详细的研究^[7,8]。此外,已报道的样品处理与分析方法并不能消除或改善基质效应。因此,本文针对氨氯地平LC-MS/MS检测方法的基质效应进行了系统的考察并找到经济、快速的解决方案,为准确测定人体苯磺酸氨氯地平生物等效性试验血浆样品中氨氯地平浓度提供保障。

苯磺酸氨氯地平对照品 (结构式见图 1A,含量≥99.9%),由中国食品药品检定研究院提供; 内标d₄-氨氯地平 (结构式见图 1B,纯度为98%) 购自加拿大Toronto Research Chemicals公司; 苯磺酸氨氯地平片 (受试制剂,5 mg/片),宜昌人福药业有限责任公司研制; 苯磺酸氨氯地平片 (商品名: 络活喜,参比制剂,5 mg/片),辉瑞制药有限公司生产。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 The structures of amlodipine (A) and d4-amlodipine (B,IS)

API 4000 Qtrap,AB四级杆线性离子阱 混合质谱仪: 美国Applied Biosystems SCIEX公司,配备电喷雾离子源 (electrospray ionization,ESI) 以及Analyst 1.6.1数据处理软件; 日本Shimadzu公司Prominence UFLC型高效液相色谱仪: 包括LC-30AD系统泵; 本实验中用到的其他设备包括分析天平 (十万分之一),药动学分析软件为DAS 2.1.1。

选用Welch Ultimate XB-C18色谱柱 (100 mm× 2.1 mm,3 µm); 预柱为菲罗门C18保护柱 (4 mm× 2.0 mm,3 µm); 柱温为40 ℃; 用2 mmol·L^-1甲酸铵溶液 (甲酸调至pH 3.0) 和乙腈为流动相梯度洗脱; 0～0.2 min,乙腈为30%; 0.2～2.5 min,乙腈30%～90%,乙腈在90% 时维持0.7 min; 3.2 min,乙腈的比例从90%～30% 平衡至4 min分析结束。实验过程中流动相总流速为0.6 mL·min^-1,进样体积为10 µL。质谱条件: 离子检测方式为正离子多反应监测离子检测 (MRM); 离子化方式为电喷雾离子化 (ESI); 气帘气 (CUR)、碰撞气 (CAD)、离子源电压 (IS)、离子源温度 (TEM)、雾化气 (GS 1)、辅助加热气 (GS 2)、接口加热器 (ihe) 参数分别为10 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa)、Medium、5.5 kV、500 ℃、50 psi、50 psi、On。氨氯地平检测离子对为409.0/238.0,去簇电压DP为61 V,碰撞能CE为15 V,出室电压CXP为15 V,入室电压EP为10 V; 氘代内标检测离子对为413.1/238.3,去簇电压DP为50 V,碰撞能CE为18 V,出室电压CXP为18 V,入室电压EP为10 V。

对照品溶液: 用甲醇配制10.0 g·L^-1的苯磺酸氨氯地平储备液,用甲醇-水 (1∶1) 稀 释成不同浓度的对照溶液。内标溶液: 用甲醇配制1.0 g·L^-1内标储备液,用甲醇-水 (1∶1) 稀释成100.0 μg·L^-1的内标工作液。

精密吸取空白血浆200 μL,置2 mL离心管中,加入饱和碳酸钠溶液80 µL,涡旋30 s,再加入甲基叔丁基醚1 mL,涡旋混合10 min,于4 ℃10000 r·min^-1离心10 min,吸取上清液800 μL于1.5 mL离心管中,40 ℃氮气吹干,然后用流动相 (乙腈-2 mmol·L^-1甲酸铵,50∶50) 80 µL复溶,涡旋混合2 min后,于4 ℃、15 000 r·min^-1离心10 min,取上清液10 µL进行LC-MS/MS分析。

精密吸取待测血浆200 μL,置2 mL离心管中,精密加入内标工作液20 µL,涡旋30 s后,加入饱和碳酸钠溶液80 µL,涡旋30 s,然后按照“空白血浆样品处理”方法处理,进行LC-MS/MS分析。

按照上述血浆样品处理方法,考察饱和碳酸氢钠和碳酸钠以及不同用量饱和碳酸钠作用下的提取回收率和基质效应。

选用乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、正己烷以及甲基叔丁基醚作为萃取剂,考察不同萃取剂对基质效应和回收率的影响。

分别在等度洗脱与梯度洗脱条件下,考察涡旋萃取3 min与10 min对基质效应和回收率的影响。

采用柱后灌注法^[9],分别在等度洗脱和梯度洗脱的色谱条件下,将不含分析物和内标的空白血浆样品按上述样品处理方法处理后,用甲醇-水 (1∶1) 80 µL复溶后离心,取10 µL进行LC-MS/MS分析,同时在柱后用注射泵以10 µL·min^-1速度将10 μg·L^-1苯磺酸氨氯地平的工作溶液泵入质谱检测器,检测分析物离子对信号。

考察6份来自不同个体的空白血浆样品、空白血浆加苯磺酸氨氯地平和内标样品的色谱图,观察图谱在氨氯地平和内标保留时间处是否出现干扰峰。

取空白血浆200 μL,加入内标工作溶液20 µL,配制苯磺酸氨氯地平分析物系列浓度的血浆校正标样,以分析物峰面积A_s和内标峰面积A_i 的比值Y为纵坐标,校正标样中分析物浓度C为横坐标,采用加权最小二乘法进行回归 (W = 1/C²),求得的直线回归方程即为标准曲线。

平行配制6份0.1 µg·L^-1血浆样品,进行LC-MS/MS分析,考察其准确度和精密度。

按照0.1 µg·L^-1血浆样品、空白血浆样品、20 µg·L^-1血浆样品和空白血浆样品的进样顺 序依次进样分析,观察最后一个空白血浆样品色谱图中是否有分析物与内标残留。

取苯磺酸氨氯地平低、中、高浓度的血浆质控样品,每一浓度配制6份样品,连续测定3批,计算批内、批间准确度与精密度。

分别配制苯磺酸氨氯地平低、中、高3个浓度 (0.3、3.0和16.0 µg·L^-1) 的血浆样品,每一浓度配制6份样品,按照血浆样品处理方法处理,进行LC-MS/MS分析,记录分析物氨氯地平峰面积,标记为A₁。取空白血浆200 μL,加入甲醇-水 (1∶1) 20 µL,按空白血浆样品处理方法处理至氮气吹干,用80 µL含分析物和内标的工作液 (内标终浓度为20.0 µg·L^-1,苯磺酸氨氯地平终浓度分别为0.6、6.0和32.0 µg·L^-1) 复溶,进样分析,记录氨氯地平峰面积,标记为A₂。将内标为20.0 µg·L^-1、苯磺酸氨氯地平浓度分别为0.6、6.0和32.0 µg·L^-1的对照品溶液进样分析,记录氨氯地平峰面积,标记为A₃。A₁与A₂的比值为氨氯地平的提取回收率 (R%); A₂与A₃的比值为氨氯地平的基质效应 (ME%)。内标的提取回收率和基质效应同法计算。

考察苯磺酸氨氯地平低、中、高3个血浆样品室温放置6 h、-80 ℃冻融循环3次、-80 ℃冷冻放置80天、4 ℃放置24 h稳定性以及苯磺酸氨氯地平对照品溶液室温放置24 h、光照6 h、储备液于-80 ℃放置3个月稳定性。将各样品按上述考察条件放置后,进行处理分析。计算血浆样品在上述条件下的准确度,考察其稳定性。

分别配制含20.0 µg·L^-1苯磺酸氨氯地平和10.0 µg·L^-1内标的血浆样品进行LC-MS/MS分析,确定分析物与内标之间是否存在交叉干扰。

健康男性受试者21名入选 并随机分为两组,一组11人,另一组10人。由本人签署知情同意书,经华中科技大学同济医学院医学伦理委员会批准。采用单剂量双交叉试验,清洗期为3周。受试者于试验前一日晚餐后开始禁食,试验当日晨间空腹服用宜昌人福药业有限责任公司研制的苯磺酸氨氯地平片 (受试制剂,5 mg/片) 2片或辉瑞制药有限公司生产的苯磺酸氨氯地平片 (商品名: 络活喜,参比制剂,5 mg/片) 2片,服药前 (0 h) 及服药后1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120和144 h肘静脉采血5 mL。血样置于肝素化试管中,离心分离血浆,-80 ℃冷冻贮存待LC-MS/MS分析。采用DAS 2.1.1软件进行药代动力学参数计算与生物等效性评价。

结果表明,不同的碱化剂对提取回收率存在影响,但对基质效应影响甚微。图 2A表明饱和碳酸氢钠和碳酸钠对基质效应无明显影响,但在饱和碳酸钠条件下,分析物提取回收率更高。由图 2B可知,饱和碳酸钠不同用量对提取回收率有一定的影响,当碱化剂的用量从40 μL增加至80 μL后,高浓度质控样品氨氯地平提取回收率从58%升高至72%,但饱和碳酸钠不同用量对基质效应影响没有显著差异 (图 2C)。不同萃取溶剂的提取回收率与基质效应也存在明显差别,结果见图 2D。正己烷萃取处理的血浆样品基质效应最低,但其提取回收率仅为25%。与乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚相比,甲基叔丁基醚可明显改善基质效应,且具有较高的提取回收率。此外,萃取时间不会明显影响基质效应 (图 2E) 与提取回收率 (图 2F)。改变色谱分离条件可显著降低基质效应 (图 2G)。采用等度洗脱方式,低、中、高浓度质控样品基质因子分别为96%、79% 和72%,采用梯度洗脱方式低、中、高浓度基质因子分别为94%、96% 和94%,提示血浆基质效应可通过改变色谱分离条件实现。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Matrix effect and recovery optimization under different conditions. A: Matrix effect (ME) and recovery (RE) results obtained from NaHCO3 and Na2CO3 pretreated plasma samples; B and C: RE and ME results using 40 µL and 80 µL Na2CO3; D: ME and RE results employing different extracting solvents (DCM: Dichloromethane; EA: Ethyl acetate; MTBE: Methyl tert-butyl ether); E and F: ME and RE data under different extracting time; G: Influence of chromatographic conditions on the matrix effect. LQC,MQC and HQC: 0.3,3.0 and 16.0 μg·L-1 amlodipine besylate

如图 3所示,在等度洗脱条件下,分析物的保留时间为1.4 min。柱后灌注的结果表明在分析物保留时间前后质谱响应信号均被抑制,且在2.5 min处仍存在明显的信号抑制,表明血浆中内源性基质对质谱信号存在显著的影响。改用梯度洗脱分析物的保留时间延长至1.7 min,但峰形明显改善。比较等度洗脱与梯度洗脱模式下定量下限信噪比,检测灵敏度提高2.5倍。此外,影响基质效应的内源性可与分析物实现分离,在此条件下的分析物保留时间处无质谱信号抑制现象。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Results of the post column infusion. A,C: Amlodipine peak under isocratic elution mode or gradient elution condition; B,D: Post column infusion chromatogram under isocratic elution or gradient elution condition

分析物和内标的保留时间均约为1.7 min,空白血浆样品的色谱图中没有出现干扰峰,在本条件下待测物的分离与测定不受影响。

结果表明,苯磺酸氨氯地平在0.1～20.0 µg·L^-1内质谱响应符合线性关系,标准曲线相关系数均大于0.999。血浆中苯磺酸氨氯地平的定量下限为0.1 µg·L^-1,其日内准确度和精密度分别为 (98 ± 9) % 和6.2%。

在最高浓度校正标样进样分析完成后,进样分析一个空白样品,空白样品色谱图中未发现分析物与内标残留,本方法不存在残留效应。

苯磺酸氨氯地平定量下限、低、中、高浓度质控样品的批内与批间精密度和准 确度相对标准差 (RSD) 均小于15%,定量下限相对偏差 (|RE|) 在20% 内,低、中、高浓度质控样品 |RE| < 11%。

苯磺酸氨氯地平回 收率在83.5%～88.2% 之间,内标回收率为88.3%。低、中、高浓度苯磺酸氨氯地平和内标的基质因子 分别为 (93.9 ± 1.8) %,(95.8 ± 4.9) %,(93.9 ± 1.5) % 和(97.9 ± 5.3) %。

结果表明,苯磺酸氨氯地平测定的准确度为92%～115%,提示稳定性良好。

结果表明,同位素内标和氨氯地平不存在交叉干扰。

药代动力学参数结果见表 1。AUC_{0-144 h}、AUC_0-∞、C_max数值经对数转换后进行方差分析表明,在受试制剂与参比制剂间无显著差异 (P > 0.05); 双向单侧t检验结果表明受试制剂没有超过规定的参比制剂的高限与低限 (P < 0.05),拒绝生物不等效假设; 受试制剂AUC_{0-144 h}和AUC_0-∞的90% 置信区间均在80%～125% 内; 受试制剂C_max的90% 置信区间为93.7%～104.9%,在80%～125% 内。t_max经非参数检验也无 显著性差异 (P > 0.05)。根据AUC_{0-144 h}计算,本试验21名健康受试者单次口服受试试剂的相对生物利用度为 (103 ± 15) %。

表1(Table 1)

Table 1 Main pharmacokinetic parameters of amlodipine in human after oral administration Parameter Reference Test Cmax /µg·L-1 6.23 ± 1.21 6.18 ± 1.27 tmax /h 7.14 ± 2.58 7.62 ± 3.01 t1/2 /h 46.89 ± 17.22 47.98 ± 10.71 AUC0-144 h /µg·L-1·h 322.19 ± 71.87 328.49 ± 70.19 AUC0-∞ /µg·L-1·h 367.90 ± 96.23 375.89 ± 89.10

Table 1 Main pharmacokinetic parameters of amlodipine in human after oral administration

综上所述,受试制剂与参比制剂具有生物等效性,受试制剂与参比制剂为生物等效制剂。

在人体生物等效性或临床药代动力学试验中,LC-MS/MS技术被广泛应用,而基质效应也是检测过程中不可忽视的问题^[10]。2015年中国药典在生物样品定量分析方法验证指导原则以及美国食品药品管理局的生物分析方法指导原则均对基质效应提出了明确的要求,以保证LC-MS/MS方法的灵敏度和准确度。到目前为止,关于LC-MS/MS方法应用在苯磺酸氨氯地平人体生物等效性研究的相关文献中鲜有提及基质效应。现有的改善基质效应的方法包括改变样品前处理方式、色谱或者质谱条件以及选择合适的内标等^[10,11]。

目前常用的样品前处理方法包括蛋白沉淀,液液萃取和固相萃取等。蛋白沉淀法^[12]虽然简单,但由于不能去除盐分以及脂质成分,对于改善基质效应效果甚微。液液萃取法^[13]与蛋白沉淀法相比,不仅能够对样品进行浓缩保证分析的灵敏度,同时能较大程度减小基质效应。固相萃取^[14,15]可以达到比较好的去除基质的效果,但是处理过程复杂,且价格昂贵。

由于氨氯地平分子式中有两个酯基团,遇强碱 (如氢氧化钠) 不稳定。参考相关文献,本研究考察了饱和碳酸钠和碳酸氢钠两种弱碱对提取回收率和基质效应的影响。在饱和碳酸钠作用下,血浆中氨氯地平更多以分子形式存在,有利于氨氯地平从血浆样品向有机相的转移,提高提取回收率。饱和碳酸钠和碳酸氢钠对基质效应影响没有显著差异。

本实验改变样品前处理方法与选用同位素内标,可改善相对基质效应、提高实验检测的精密度,但绝对基质效应与准确度都不能得到改善^[16]。

目前,评价基质效应的方法主要有柱后灌注法和提取后加入法。柱后灌注法能直观地显示内源性 基质对待测物在色谱保留时间处质谱检测信号响应的影响,为提取后加入法评价基质效应起到很好的补充作用。本实验采用柱后灌注法证明血浆中内源 性基质在等度洗脱的条件下对氨氯地平分析物色谱保留前后均存在明显抑制情况,提示可通过改变色谱分离条件改善血浆中内源性基质对质谱检测信号的影响。

本研究采用改变色谱条件由原来的等度洗脱转为梯度洗脱,利用色谱柱分离内源性干扰物和分析物,解决了本方法中存在的基质效应问题。在分析开始,利用高水相将极性较大、保留较弱的内源性物质先洗脱; 再缓慢升至高有机相,让分析物在此过程中被洗脱; 分析物洗脱后再将高有机相维持0.7 min,使得极性较小的内源性物质洗脱,可避免其对后续样品分析的干扰。相比于等度洗脱,梯度洗脱方法同时考虑到基质中弱极性和强极性内源性干扰物,在避开内源性干扰物对本分析样品干扰的同时也消除了弱极性物质如磷脂等对后续样品检测的干扰。柱后灌注结果也直观证明,在梯度洗脱条件下内源性基质对氨氯地平分析物检测不存在干扰现象。

由于氨氯地平分子式中的1,4-二氢吡啶环在光照下易发生二氢吡啶环芳构化反应,所以本研究考察了苯磺酸氨氯地平工作溶液光照6 h稳定性。结果表明,在日光灯下照射6 h,苯磺酸氨氯地平的稳定性控制在 (98.24 ± 3.36) % 到(99.96 ± 3.66) % 之间,其稳定性不受光照的干扰,所以实验过程不需要冯仕银等^[5]报道的避光操作,实验操作变得简单高效。

本文在已报道方法的基础上不断优化,比较系统地研究了不同影响因素对本实验中基质效应的影响,考察了苯磺酸氨氯地平的光稳定性,通过优化色谱分离条件消除基质效应对本实验准确定量的影响,建立了经济、方便、特异、准确、可信的定量分析方法,可用于苯磺酸氨氯地平人体生物等效性研究。