药学学报  2016, Vol. 51 Issue (5): 797-805   PDF    
引用本文
YANG Dai-lin, TONG Ling, LI Xiao-wen, LI Dong-xiang, LIU Wen-yuan. Identification of chemical constituents in Yangxue Qingnao granule by UPLC-Q-TOF/MSE[J]. Acta Pharm Sin, 2016, 51(5): 797-805.  
杨岱琳, 佟玲, 李晓稳, 李东翔, 柳文媛. UPLC-Q-TOF/MSE方法分析养血清脑颗粒的化学成分[J]. 药学学报, 2016, 51(5): 797-805.  
UPLC-Q-TOF/MSE方法分析养血清脑颗粒的化学成分
杨岱琳1, 佟玲2, 李晓稳2, 李东翔2, 柳文媛1     
1. 中国药科大学药物分析教研室, 江苏 南京 210009;
2. 天士力研究院创新中药关键技术国家重点实验室药物分析研究所, 天津 300410
收稿日期: 2015-11-01; 修回日期: 2016-01-17.
基金项目: 国家"重大新药创新"科技重大专项(2013ZX09402202).
* 通讯作者: liuwenyuan8506@163.com
摘要: 为系统阐明复方中药养血清脑颗粒的化学组成, 本研究采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间/全信息串联质谱(UPLC-ESI-Q-TOF/MSE) 技术, 对养血清脑颗粒的化学成分进行分析。通过Q-TOF-MSE提供化合物的准确相对分子质量、质谱碎片离子信息, 与对照品的保留时间和质谱数据比对, 结合参考文献, 共鉴定出142种成分, 主要包括酚酸类、单萜苷类、醌类、生物碱类和苯酞内酯类5 类成分, 并对各成分的药材来源进行归属。本研究全面、快速、准确地分析了养血清脑颗粒的化学成分, 为养血清脑颗粒的药效物质基础和质量控制等研究奠定了基础。
关键词: 养血清脑颗粒     UPLC-ESI-Q-TOF/MSE     定性分析    
Identification of chemical constituents in Yangxue Qingnao granule by UPLC-Q-TOF/MSE
YANG Dai-lin1, TONG Ling2, LI Xiao-wen2, LI Dong-xiang2, LIU Wen-yuan1     
1. Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;
2. State Key Laboratory of Core Technology in Innovative Chinese Medicine, Pharmaceutical Analysis Institute, Tasly Academy, Tianjin 300410, China
Abstract: In order to clarify the chemical constituents in Yangxue Qingnao granule, we established a rapid ultra-performance liquid chromatography/orthogonal acceleration time-of-flight mass spectrometry (UPLCQ- TOF/MSE) method. According to the high resolution MS spectra data, fragmentation ion information and retention time, 142 peaks were identified or tentatively presumed by comparison with reference standards data and literature reports. The herbal sources of these peaks were assigned. The results implied that phenolic acids, alkaloids, anthraquinones, phthalides, monoterpene glycosides were included in the main components of Yangxue Qingnao granule. The method is rapid for systematically elucidation of the constituents of Yangxue Qingnao granule and the results would facilitate the quality control of Yangxue Qingnao granule for safe and efficacious use.
Key words: Yangxue Qingnao granule     UPLC-Q-TOF/MSE     chemical profiling    

养血清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、延胡索、钩藤、鸡血藤、夏枯草、决明子、熟地黄、珍珠母、细辛11味药材组成的中药复方,具有养血平肝,活血通络的作用; 临床广泛用于头痛眩晕、脑供血不足、高血压、失眠多梦等症状的治疗[1]。

中药复方通过多成分协同作用发挥药效,因此有必要对其中化学成分开展系统全面研究,以明确其中的药效成分,阐明药效物质基础。目前围绕养血清脑颗粒化学成分的研究较少,仅对养血清脑颗粒中40余个化学成分进行了定性分析[2, 3],无法较全面地反映该药的化学组成。

基于养血清脑颗粒成分复杂,涵盖不同极性、多个种类,而常规分析技术在检测化合物范围、分离效率、检测灵敏度与准确度等方面存在不足。因此对复方中药亟需建立一个满足单次进样、多成分快速分析,同时能提供尽可能丰富、可靠数据的分析方法。

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间/全信息串联质谱 (UPLC-ESI-Q-TOF/MSE) 技术同时具备UPLC卓越高效的分离特性和Q-TOF高分辨的定性能力,通过“无碰撞能”与“高碰撞能”两种扫描交替,可实现单次液质分析同时获得高精确的母离子及碎片离子的化合物结构信息[4, 5]。该方法较其他成分定性方法更具灵活便捷、准确度高、通用性好的特点,逐渐成为中药复杂体系中化学成分快速分离和鉴定的有效手段,有助于科学阐明中药复方药效物质基础。

本文首次采用UPLC-ESI-Q-TOF/MSE技术,为系统分析养血清脑颗粒化学成分建立了一种灵敏可靠、快速灵活的定性方法。结合药材化学成分相关文献,根据实验获得的化合物精确分子量、碎片离子峰、色谱保留时间及对照品信息,快速分析鉴定未知成分,并对各成分进行药材归属。该方法对研究化学组成复杂的中药复方体系具有广泛实用性。研究结果为明确养血清脑颗粒的药效物质基础、阐明其体内药理作用机制、提升质量控制水平、确保临床用药安全有效等方面具有重要意义。

材料与方法 仪器与试剂

Acquity UPLC-Synapt G2 Q-TOF色谱-质谱联用仪 (美国Waters公司); MassLynx V4.1质谱工作站 (美国Waters公司); Biofuge primo R台式离心机 (美国Thermo公司); Milli-Q超纯水制备仪 (美国Millipore公司); xS105型电子分析天平 (瑞士Mettler Toledo公司)。

乙腈(质谱纯,德国Omni公司); 实验室自制超纯水; 甲酸 (质谱纯,美国Sigma公司)。四氢小檗碱、四氢黄连碱、四氢非洲防己碱、脱氢紫堇碱、延胡索甲素、巴马汀、欧当归内酯A、洋川芎内酯H、蒿本内酯、钩藤碱、异钩藤碱、异去氢钩藤碱均购自天津一方科技有限公司,含量≥ 98.0%; 别隐片碱、芍药内酯苷、苯甲酰芍药内酯苷、美决明子素、α-别隐片碱购自天津金兰科技有限公司,含量≥ 98.0%; 芍药苷、阿魏酸、绿原酸、没食子酸、迷迭香酸、咖啡酸、香草酸、原儿茶酸、原儿茶醛、表儿茶素、没食子酸乙酯、芦丁、金丝桃苷、延胡索乙素、黄连碱、盐酸小檗碱、大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、橙黄决明素均购自中国食品药品检定研究院,含量均≥ 98.0%。养血清脑颗粒 (批号: 130606),由天津天士力制药股份有限公司提供。养血清脑颗粒中各单味药材: 当归、川芎、白芍、决明子、延胡索、夏枯草、鸡血藤、熟地黄、钩藤、细辛、珍珠母,由天津天士力现代中药资源有限公司提供,经中国药科大学中药学院冯锋教授鉴定,符合中国药典2010版标准。

供试品溶液和对照品溶液的制备

取养血清脑颗粒1.5 g,置具塞锥形瓶中,加50% 甲醇20 mL,称定重量,超声处理30 min,放至室温,补足减失的重量,过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液,作为养血清脑颗粒供试品溶液。各药材浸膏根据养血清脑颗粒制备方式实验室自制,按供试品溶液处理方法制备得各药材供试品溶液。

分别取各对照品适量,精密称定,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解制成对照品溶液。再分别取各对照品溶液0.2 mL,置10 mL量瓶中,加50% 甲醇制成混合对照品溶液。

液相条件

ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2.1 mm,1.7 μm) 色谱柱 (Waters公司); 流动相: 0.1% 甲酸水 (A) - 乙腈 (B)。梯度洗脱: 0～9 min,95%～85% A; 9～15 min,85%～82% A; 15～20 min,82%～80% A; 20～26 min,80%～70% A; 26～30 min,70%～55% A; 30～39 min,55%～10% A; 39～43 min,10% A。流速: 0.25 mL·min-1。柱温35 ℃,进样量为5 μL。

质谱条件

电喷雾电离离子源 (ESI),扫描范围m/z为50～1 200,正、负离子模式检测: 毛细管电压分别为3.0 kV (ESI+) 和2.5 kV (ESI-),锥孔电压 40 kV,提取锥孔电压5 kV,离子源温度为100 ℃,脱溶剂温度为450 ℃,脱溶剂气体 (氮气) 流速为900 L·h-1,锥孔气流量50 L·h-1; 氩气为碰撞气,低能量扫描时trap电压为6 eV,高能量扫描时trap CE电压为20～60 eV。准确质量数用亮氨酸脑啡肽作校正液,质核比为m/z 556.277 1 (ESI+),m/z 554.261 5 (ESI-)。

结果与分析 1 样品主要色谱峰的鉴定及归属

将供试品的色谱保留时间、质谱准分子离子峰和碎片离子等信息,与对照品比对,最终确定39个化学成分峰。汇总与养血各药材相关化学成分的文献报道,根据质谱提供的准确分子量计算化合物的精确分子式,进行初步判断,再依据高能碰撞下碎片离子信息,与文献比对,推测化学成分,共推断103个化学成分峰。通过与养血各单味药材图谱比对并参考文献,确定以上化学成分来源药材。最终本实验从养血清脑颗粒中共鉴定出142个化合物。养血清脑颗粒化学成分的保留时间、分子式、化合物名称、高分辨质谱母离子及偏差数据、碎片离子信息、药材来源等信息数据结果见表 1[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21]。

Table 1 Compounds identified in Yangxue Qingnao granule by UPLC-Q-TOF/MSE in both negative and positive ion polarity modes. Compounds confirmed with the reference standard. D: Angelica Sinensis Radix,C: Chuanxiong Rhizoma,S: Radix Rehmanniae Preparata,B: Radix Paeoniae Alba,G: Ramulus Uncariae Cum Uncis,J: Caulis Spatholobi,X: Spica Prunellae,M: Semen Cassiae,Y: Rhizoma Corydalis Yanhusuo
2 各类化合物结构及裂解特点 2.1 酚酸类及其苷类

已鉴定酚酸类化合物共11个,包括: 柠檬酸、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、隐绿原酸等。该类成分多来源于当归、白芍、鸡血藤、夏枯草和钩藤等药材。酚酸类化合物质谱行为呈现: 负离子模式以 [M-H]- 的准分子离子峰形式存在,质谱高能碰撞多产生 [M- H-CO2]- 或 [M-H-H2O]- 的碎片离子; 对于含没食子酸结构的化合物,易出现没食子酸丢失 [M-H-gallic acid]- 及没食子酸残基碎片离子; 含咖啡酸结构的化合物,易出现咖啡酰基丢失 [M-H-caffeoyl]- 及形成咖啡酸碎片离子[11, 12, 13]。14号绿原酸的具体质谱碎裂信息见图 1。

Figure 1 Proposed major fragmentation of chlorogenic acid
2.2 生物碱类 2.2.1 吲哚类生物碱

已鉴定吲哚类生物碱共19个,包括: 钩藤酸、18,19-二去氢科诺新酸、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛、长春花苷内酰胺、毛钩藤碱、去氢毛钩藤碱及其异构体等。吲哚类生物碱均来自钩藤药材。该类成分质谱行为呈现: 正离子模式以[M+H]+准分子离子峰形式存在,高能碰撞下易丢失C-22、C-17、C-15位置处取代基,如CH3OH、COOH、C4H5O2等,进而产生D环和C环开裂,产生一系列特征碎片离子[8, 14]。85号钩藤碱的具体质谱碎裂信息见图 2。

Figure 2 Proposed major fragmentation of No.85 rhynchophylline (A); No.66 tetrahydropalmatine (B); No.90 palmatine (C)
2.2.2 苄基异喹啉类生物碱

已鉴定苄基异喹啉类生物碱共19个,分为叔胺碱 (四氢原小檗碱型、原阿片碱型生物碱) 和季胺碱 (原小檗碱型) 两大类,该类成分均来自延胡索药材[17, 20]。叔氨碱包括: 四氢非洲防己碱、四氢药根碱、四氢小檗碱、延胡索乙素、原阿片碱、别隐片碱、延胡索甲素、四氢黄连碱等; 季胺碱包括: 小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀、黄连碱、脱氢紫堇碱等。苄基异喹啉类生物碱在正离子模式下响应高,不同结构类型的成分具有不同的质谱碎片离子信息。

以四氢原小檗碱型生物碱为代表的叔胺碱在正离子模式下以[M+H]+准分子离子峰形式存在,高能碰撞产生Retro-Diels-Alder (RDA) 裂解,形成互补碎片离子。RDA裂解后氮原子的离子化效率高且荷质比为偶数,可判断含氮碎片离子来自四氢异喹啉部分,互补碎片离子来自苯环部分; 以原小檗碱型生物碱为代表的季胺碱,质谱中检测到的母离子峰为[M]+峰,由于结构中C环是吡啶环结构,因此无法发生RDA裂解,裂解途径主要以取代基的碎裂为主,碎片离子集中在m/z 280～350左右,该类成分质谱特点是其取代基丢失形成碎片离子、相对丰度大[17, 20]。66号延胡索乙素和90号巴马汀的具体质谱碎裂信息见图 2。

2.3 醌类

已鉴定的醌类化合物共32个。涉及10个蒽醌类化合物,包括大黄酸、美决明子素、大黄素甲醚、钝叶决明素、橙黄决明素等; 涉及22个蒽醌苷类化合物,包括大黄素龙胆二糖苷、决明苷B2、橙黄决明素葡萄糖苷等。该类成分主要来源于药材决明子。醌类化合物的质谱行为呈现多数成分的负离子模式响应好于正离子模式,高能碰撞下依次失去CO,同时出现CO2丢失; 连接在苯环上的取代基,如甲基、甲氧基易丢失; 此外蒽醌苷类成分易丢失糖苷配基,发生上述裂解规律。这些质谱裂解特征对醌类化合物的结构推断能提供重要信息[16]。99号大黄素葡萄糖苷的具体质谱碎裂信息见图 3。

Figure 3 Proposed major fragmentation of emodin-glucoside
2.4 苯酞内酯类

已鉴定苯酞内酯类化合物共18个,包括: 洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯及其同分异构体、洋川芎内酯F、丁基苯酞、欧当归内酯A及其同分异构体等。该类成分多来自药材当归和川芎,苯酞内酯类在正离子模式下响应高,高能碰撞质谱中易形成丢失H2O、CO和烷基链的特征碎片离子[13, 15]。133号峰Z-蒿本内酯的具体质谱碎裂信息见图 4。

Figure 4 Proposed major fragmentation of No.133 ligustilide
2.5 单萜类

已鉴定单萜苷类化合物共14个,包括氧化芍药苷及其异构体、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷及其的异构体等。该类成分来自白芍药材。单萜苷类在负离子模式下响应良好,母离子多以 [M+COOH]- 或 [M-H]- 形式存在。高能碰撞易失去苯甲酸 (BA) 而形成 [M-H-122]- 和121 [BA-H]- 的特征离子,还易形成 [M-H-CH2O]-、[M-H-162- BA]- 等特征离子[12, 22]。27号峰芍药苷的具体质谱碎裂信息见图 5。

Figure 5 Proposed major fragmentation of paeoniflorin
2.6 其他类

本文还检测到儿茶素、没食子酰乙酯、芦丁、金丝桃苷、伞形酮、毛蕊花糖苷等成分,涉及白芍、夏枯草、鸡血藤等多种药材。

讨论

本实验共鉴定养血清脑颗粒142个成分,其中酚酸类11个、生物碱类38个、蒽醌类32个、苯酞内酯类18个、单萜苷类14个,其中89个成分是养血清脑颗粒首次报道。以上成分中,酚酸类在心血管保护、抗血栓、抗炎、抗氧化等方面作用明显。生物碱类的钩藤碱具有降压、镇静催眠等作用; 延胡索总碱具有解热镇痛、抗炎抗氧化、改善心脑血管系统等作用。蒽醌类具有降血压降血脂、抗动脉粥样硬化等血管保护作用。苯酞内酯类具有明显的抗脑缺血、改善神经系统损伤等作用。单萜苷类具有抗炎、解痉镇痛、神经元保护等作用[23, 24, 25, 26]。以上不同来源、多种类的活性成分可通过协同或互补作用,从而使养血清脑颗粒发挥治疗头痛眩晕、慢性脑缺血不足等疗效。

研究结果表明,UPLC-Q-TOF-MSE法可以快速、系统地对养血清脑颗粒中化学成分进行定性分析。研究较为全面系统地阐明养血清脑颗粒的化学成分组成、探究其药效物质基础,为养血清脑颗粒的质量控制研究及临床应用提供坚实的理论依据。

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