2016, Vol. 51
2. 广东药科大学药科学院, 广东广州 510006
2. School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
据统计,目前全球60岁以上人口约为9亿,痴呆症患者约有4 680万,随着人口老龄化加剧,2050年痴呆患者预计将达到1.315亿[1]。AD为老年期痴呆的主要类型,约占总数的2/3。2005年我国流行病学调查结果显示,AD患病率随年龄增长而增加,65岁以上老年人群患病率为4.8%,85岁以上老年人群患病率高于20%。AD的主要临床表现为记忆力、理解判断能力和生活自理能力逐渐衰退,给患者及其家庭、医疗卫生机构和全球经济带来巨大负担,人均寿命延长意味着AD发病率不断升高,因此AD的防治已成为全球关注热点。AD的主要病理特征为神经纤维缠结、老年斑形成和选择性神经元丢失[2]。目前学界公认的AD病理机制有: tau蛋白异常磷酸化、Aβ毒性、基因突变、胆碱能神经系统受损、氧化应激损伤 、神经炎症和谷氨酸失衡[3]。
目前临床上用于治疗AD的药物主要为乙酰胆碱酯酶抑制剂 (acetylcholinesterase inhibitor,ACHEI) 和N-甲基-D-天冬氨酸受体 (N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR) 抑制剂,针对其他靶点的药物尚处于研究阶段。ACHEI和NMDAR抑制剂可在一定程度上改善认知能力、缓解病情但无法逆转病理进程。ACHEI只适用于胆碱能神经元损伤不明显的AD早期,且均有不同程度的不良反应,其中他克林因肝毒性明显已经退市。
钩藤,来源于茜草科钩藤属植物的干燥带钩茎枝,2015版中国药典收录的品种有钩藤 [Uncaria rhynchophylla (Miq.) Miq.exHavil.,UR]、华钩藤 [Uncaria sinensis (Oliv.) Havil.,US]、大叶钩藤、毛钩藤和无柄果钩藤[4],传统功效为清热平肝,息风止痉。现代药理研究证明钩藤在钩藤散、抑肝散等复 方改善痴呆患者精神状态和认知能力中起到重要作用[5]。钩藤主要含有吲哚生物碱类、三萜类、黄酮类和酚类化学成分,药理研究多集中于吲哚生物碱类。钩藤中的化学成分可从抑制炎症反应,减轻谷氨酸兴奋毒性损伤,抑制Aβ聚集,减轻Aβ对神经元的 毒性,提高脑组织抗氧化能力,抑制乙酰胆碱酯酶 (acetylcholinesterase,ACHE) 活性,修复突触功能障碍等多个方面发挥神经保护作用。此外,UR水提物 (aqueous extract of UR,AEUR)、异钩藤碱 (isorhynchophylline,IRhy) 可以改善Aβ引起的记忆损伤[6, 7]; trans-anethole及多种生物碱可改善东莨菪碱引起的记忆障碍[8, 9]; UR 70%乙醇提取物、IRhy可改善D-半乳糖引起的记忆损伤[10, 11] (表 1)。综上,可见钩藤在防治AD方面有巨大的潜能。本文主要从炎症、谷氨酸毒性、Aβ损伤、氧化应激、ACHE活性和tau异常磷酸化等几个方面阐述钩藤在AD模型中的相关研究。
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表 1 钩藤中与AD模型相关的活性成分. ACHE: 乙酰胆碱酯酶 |
小胶质细胞是脑内的巨噬细胞,参与中枢神经系统中的固有免疫和炎症反应。Aβ沉积、神经元坏死和氧化应激等因素会激活小胶质细胞,过度激活的小胶质细胞会释放促炎症细胞因子,加剧炎症反应,损伤神经元,因此抑制小胶质细胞过度激活有利于改善AD[30]。流行病学研究也表明长期服用非甾体抗炎药可降低患AD的风险[31]。
华钩藤正己烷提取物 (hexane extract of US,HEUS)、AEUR、去氢钩藤碱 (corynoxeine,Cory)、异去氢钩藤碱 (isocorynoxeine,ICory)、钩藤碱(rhynchophylline,Rhy)、IRhy、长春花苷内酰胺、uncarinic acids I、3β-hydroxy-27-(E)-coumaroyl-urs-12- en-28-oic acid、3β-hydroxy-27-(E)-coumaroyl-oleanen- 12-en-28-oic acid能够减轻脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS) 引起的小胶质细胞或RAW 246.7巨噬细胞炎症反应,减少促炎性细胞因子 (肿瘤坏死因子-α、白细胞介素 -1β、白细胞介素-6)、一氧化氮和前列腺素E2的生成和释放[11, 12, 13, 14, 15, 32, 33]。其机制研究表明: 钩藤化学 成分主要通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)、细胞外信号调节激酶及c-jun氨基末端激酶的磷酸化,从而抑制核因子κB抑制蛋白α的磷酸化、降解,减少核因子κB (nuclear factor kappa B,NF-κB) 核转录,阻断Akt/MAPKs/NF-κB信号通路,降低诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2的表达水平,减少一氧化氮、前列腺素E2及促炎性细胞因子的产生和释放[11, 13, 14, 32, 33]。小胶质细胞过度活化后释放的炎症介质会引起神经元损伤。上述研究表明钩藤中多种成分可减轻小胶质细胞炎症反应。此外,毛钩藤碱 (hirsutine,HS) 可以抑制炎症反应诱导的神经元死亡[34],其他成分是否有类似的作用有待研究。
2 谷氨酸兴奋毒性谷氨酸是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质,参与突触可塑性变化和学习记忆过程,然而谷氨酸失衡引起的兴奋毒性参与了AD的发病进程[35]。NMDAR是离子型谷氨酸受体的一个亚型,在谷氨酸兴奋性毒性中起到重要作用,过度激活NMDAR会引发Ca2+超载,导致神经元死亡,相反NMDAR拮抗剂可以减少神经元死亡[19]。临床上用于治疗AD的美金刚为NMDAR 抑制剂。
国内外学者在钩藤对抗谷氨酸兴奋性毒性方面也做了大量的研究。抑肝散由钩藤和其他六味中药 组成,研究发现抑肝散和钩藤能有效地增加细胞内谷胱甘肽 (glutathione,GSH) 水平,减轻谷氨酸对PC12细胞的损伤作用,减少乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase,LDH) 的释放[16]。HEUS可以上调X连锁凋亡抑制蛋白和Bcl-2的表达,下调死亡受体4的表达,抑制Bid裂解,阻断caspase级联反应从而 减轻谷氨酸诱导的原代皮层神经元凋亡[36]。在体外培养海马组织切片实验中,UR总生物碱可通过抑制c-jun、p53和Bax等基因的表达,减轻NMDA引起的神经元损伤[19]。
对药理活性成分进一步研究表明: HS、去氢毛钩藤碱 (hirsuteine,HST)、缝籽嗪甲醚(geissoschizine methyl ether,GM)、3-epi-geissoschizine methyl ether、Rhy、IRhy、Cory和ICory等多种生物碱可有效减轻谷氨酸对PC12、HT22或小脑颗粒细胞的毒性损伤,该作用主要与提高细胞内GSH水平和阻断NMDAR介导的Ca2+内流有关[16, 17, 18, 20]。此外,钩藤中的非生物碱成分也可以显著减轻谷氨酸兴奋毒性损伤: 表儿茶素、儿茶素、原花青素B1和原花青素B2可抑制Ca2+超载,能够减轻谷氨酸对小脑颗粒细胞的损伤[21]; MOD (1-methoxyoctadecan-1-ol) 可明显抑制谷氨酸激活GluN2B-NMDAR,抑制钙蛋白酶介导的纹状体富集的蛋白酪氨酸磷酸酶的裂解,从而抑制p38 MAPK活性,减轻谷氨酸诱导的原代皮质神经元凋亡[37]。
从以上结果可以看出,钩藤中多种成分能够抑制谷氨酸兴奋毒性,但存在差异。Shimada等[17]研究认为Rhy、IRhy和ICory可减轻谷氨酸对小脑颗粒细胞的损伤,而Kawakami等[16]研究认为这3种成分不能减轻谷氨酸对PC12细胞的损伤; 此差异可能与细胞种类、给药方式、谷氨酸浓度和作用时间等因素有关,具体原因应进一步考察。钩藤中的多种成分可抑制谷氨酸兴奋毒性,但目前的作用机制研究较少,尚未开发成AD治疗药物,而美金刚亦为NMDAR拮抗剂,药效和作用机制较为明确,可为开发钩藤抗谷氨酸兴奋毒性提供参考。
3 Aβ毒性淀粉样前体蛋白 (amyloid precursor protein,APP) 经β-分泌酶和γ-分泌酶参与的酶切过程形成一系列长短不等的Aβ (39～43个氨基酸),其中Aβ1-40和Aβ1-42有病理意义,Aβ25-35是有效毒性片段,常代替Aβ1-40和Aβ1-42用于相关研究。Aβ生成后在体内有单体、寡聚体和纤维状3种存在形式,Aβ的聚集和纤维化是AD患者脑内重要的病理改变,在凝聚形成Aβ纤维的过程中,具有过氧化损伤、引起炎症反应和损伤突触等多种神经毒性[38]。
3.1 体内或体外抑制Aβ聚集Aβ沉积是AD患者脑部的重要病理特征,抑制Aβ纤维形成和促进Aβ纤维解聚是治疗AD的有效策略。Fujiwara等[6]通过硫黄素T结合实验发现,抑肝散 (100 μg·mL-1) 在体外可有效抑制Aβ1-40和Aβ1-42的聚集,抑肝散和钩藤还可抑制APP转基因小鼠脑部Aβ1-42聚集,有利于改善模型小鼠的记忆能力。UR水提物、甲醇和乙醇提取物在体外均可抑制Aβ1-40和Aβ1-42聚集,还可使已经形成的Aβ1-40和Aβ1-42纤维解聚,成分分析表明AEUR主要含柯诺辛、柯诺辛B、Rhy、IRhy、GM、HST和HS[39]。Frackowiak等[23]利用毛细管电泳技术发现帽柱叶碱与Aβ1-40有较强结合能力,提示其可能有效抑制Aβ聚集,缓解AD发病进程。
3.2 抑制Aβ引起的神经元损伤和记忆障碍抑肝散及钩藤、钩藤中的原花青素B1可抑制Aβ寡聚体诱导的caspase-3/8/9的激活,阻断caspase依赖的凋亡通路,从而减轻Aβ寡聚体引起的神经元凋亡[40, 41]。台湾钩藤乙酸乙酯提取物 (ethyl acetate extract of Uncaria hirsuta Haviland,EAUH) 可抑制Aβ25-35诱导的线粒体中色素C释放、阻断caspase级联反应,降低细胞内活性氧簇 (reactive oxygen species,ROS) 含量,减轻Aβ25-35引起的神经元凋亡[42]。
目前对抑制Aβ诱导的神经元损伤活性成分研究主要集中于Rhy和IRhy,两者可降低神经元Ca2+超载,减少tau蛋白磷酸化,抑制聚集态Aβ25-35损伤PC12细胞[24]。进一步研究发现IRhy主要从以下3个方面减轻Aβ25-35诱导的神经元凋亡: 升高GSH水平、提高抗氧化能力,降低细胞内ROS、丙二醛 (methane dicarboxylic aldehyde,MDA) 含量,减轻Aβ25-35引起的氧化应激损伤; 上调Bcl-2/Bax比例,使线粒体膜通透性维持稳定,抑制线粒体中细胞色素C释放到胞浆,抑制caspase-3及caspase-9的活化,从而阻断线粒体凋亡通路; 上调磷脂酰肌醇-3激酶/Akt信号通路,抑制糖原合成激酶-3β活性,抑制tau蛋白过度磷酸化,减轻tau蛋白过度磷酸化引起的细胞损伤[7, 25, 26]。
抑肝散和钩藤不仅对体外培养的神经元有保护作用,还可抑制脑部Aβ沉积,从而减少Aβ沉积引起的神经元损伤,改善APP695和Tg2576转基因小鼠的记忆损伤和焦虑、激越等行为障碍[6, 43]。研究表明,IRhy可通过抑制tau蛋白过度磷酸化和神经元凋亡改善Aβ25-35引起的记忆损伤,钩藤中其他成分能否减轻Aβ引起的记忆损伤有待研究[7]。
3.3 改善Aβ引起的突触功能障碍可溶性Aβ寡聚体是引起突触损伤的主要因素,逆转Aβ诱导的突触损伤可能是改善AD认知功能障碍有效的治疗方案[44]。促红细胞生成素产生肝细胞受体A4 (erythropoietin- producing hepatocellular A4,EphA4) 介导了Aβ引起的海马神经元丢失,Rhy为EphA4抑制剂,能抑制APP/PS1转基因小鼠海马中EphA4的活性,阻断海马神经元中EphA4依赖的信号通路,修复APP/PS1转基因AD小鼠长时程增强损伤,改善Aβ引起的突触功能障碍[45]。
4 胆碱能学说AD患者胆碱能神经系统受损,突触部位乙酰胆碱 (acetylcholine,Ach) 含量降低,而ACHE参与了Ach的水解过程,因此抑制ACHE活性,提高脑中Ach含量有利于缓解AD病程[8]。临床上用于治疗 AD的药物多奈哌齐、加兰他敏和石杉碱甲等均为ACHEI。
通过Ellman法或薄层色谱生物自显影技术对ACHE活性抑制作用研究发现,UR总生物碱对ACHE活性抑制率为88.8%[46],钩藤水提物对ACHE活性抑制率为55.23%[47]。活性追踪实验发现GM、缝籽嗪甲醚-N-氧化物 (geissoschizine methyl ether-N-oxide,GM-N-oxide) 两种生物碱对ACHE活性抑制作用最强[27, 28],但不同方法测出的数值相差较大。Yang等[28]用Ellman法测出GM的半数抑制浓度 (half-inhibitionconcentration,IC50) 为10 μmol·L-1,Jiang等[27]用Amplex Red法测出GM的IC50为82.8 μmol·L-1,因此需要更为客观的测定方法及评价标准。
东莨菪碱为M受体拮抗剂,可模拟Ach分泌不足引起的记忆功能障碍,常用于抗老年性痴呆药物研究[48]。Shin等[8]以ACHE活性抑制作用为导向从UR中分离得到4种化合物,其中trans-anethole可剂量依赖地抑制ACHE活性,改善东莨菪碱记忆损伤模型小鼠的学习记忆能力,而且记忆改善效果优于他克林。绒毛钩藤总生物碱和5种氧化吲哚生物碱 (钩藤碱E、钩藤碱C、帽柱叶碱、Rhy和IRhy) 可明显改善东莨菪碱引起的记忆损伤,但文中未考察它们对ACHE活性的抑制作用[9],改善记忆能力的作用机制需进一步探究。Xian等[10]发现D-半乳糖衰老模型小鼠脑部的Ach含量有所下降,UR 70% 乙醇提物可抑制ACHE活性,提高脑组织中Ach含量,改善该模型小鼠的学习记忆能力。
5 氧化应激中枢神经系统耗氧量高、抗氧化系统弱,极易遭受氧化应激损伤。D-半乳糖衰老动物模型多与氧化应激 (如: 自由基损伤、钙稳态失调与线粒体老化) 有关,常用于抗衰老及改善记忆功能药物的评价[49]。UR 70% 乙醇提物 (含Rhy、IRhy、Cory、ICory) 和IRhy可升高脑组织中GSH、过氧化氢酶水平,提高脑组织中的抗氧化能力,降低MDA含量,有利于改善D-半乳糖引起的记忆损伤[10, 11]。
氧化应激也参与了Aβ损伤和谷氨酸兴奋毒性,EAUH[42]、IRhy[26]减轻Aβ神经细胞损伤和抑肝散[16]、MOD[22]对抗谷氨酸兴奋毒性,均与升高细胞内GSH水平,降低ROS和MDA含量,增强脑组织抗氧化能力有关。
UR甲醇提取物含有丰富的酚类和黄酮类化合物,在horseradish peroxidase-luminol-H2O2、CuSO4-Phen- Vc-H2O2和luminol-H2O2 体系中清除过氧化氢能力强于维生素C,UR甲醇提取物和UR总生物碱还可明显改善过氧化氢诱导的PC12细胞死亡[50, 51]。
6 Tau蛋白异常磷酸化Tau蛋白属于微管相关蛋白家族,主要表达于神经元中,在神经微管网络的形成中起到重要作用,而异常过度磷酸化的tau蛋白形成的神经纤维缠结是AD突出的病理特征[52]。Rhy、IRhy可抑制聚集态Aβ25-35损伤PC12细胞,以及减少Tau蛋白磷酸化[24]。IRhy改善Aβ引起的大鼠认知功能障碍也与其抑制脑中tau蛋白在丝氨酸396位点 (Ser396)、 丝氨酸404位点(Ser404) 和酪氨酸205位点 (Thr205) 过度磷酸化有关[7]。柯诺辛和柯诺辛B为自噬诱导剂,可以促进tau蛋白降解,保护神经元[29]。
7 问题与展望钩藤具有息风止痉的功效,常用于癫痫、脑卒中等中枢神经系统疾病,随着化学成分和药理作用研究日臻成熟,新的药用价值也逐渐被挖掘出来。钩藤中的化学成分在体内、体外AD模型中均表现出良好的药理活性,可从抑制神经炎症、减轻谷氨酸和Aβ毒性损伤、减少tau蛋白异常磷酸化、抑制ACHE活性和减轻氧化应激等方面发挥神经保护作用,提高AD动物模型的学习记忆能力。钩藤在防治AD方面有巨大的药用潜能,值得深入研究。
虽然以钩藤为君药的复方 (钩藤散、抑肝散和天智颗粒) 在临床上有所应用[5, 53],但是钩藤单味药及其化学成分尚未开发成AD治疗药物,其主要原因在于目前的研究不够系统和深入。钩藤的多种提取物表现出良好的药理活性,如AEUR可改善Aβ引起的记忆损伤[6],UR 70%乙醇提取物改善D-半乳糖引起的记忆损伤[10],但研究者未对提取物进行成分分析,而作者前期研究发现不同基源的钩藤所含化学成分存在差异[54]。因此在进行药效研究时有必要对提取物进行成分分析,便于后期活性成分追踪及作用机制研究。HS、HST、GM、Rhy、IRhy、Cory和ICory等多种成分可减轻谷氨酸兴奋毒性,但目前机制研究较少,仅在提高抗氧化能力和减轻Ca2+超载方面有文献报道,能否如同美金刚通过阻断NMDAR缓解AD的病理进程、改善AD患者的认知能力有待研究。AEUR、Rhy和IRhy可改善AD动物模型的记忆损伤,抑制LPS引起的体外培养小胶质细胞的炎症反应,但极少有研究者观察它们能否减轻模型动物脑部炎症。GM和GM-N-oxide对ACHE活性抑制作用较强,然而能否改善胆碱能系统损害引起的认知障碍尚不可知,可将两者用于东莨菪碱记忆损伤模型观察其对模型动物的学习记忆改善作用。此外钩藤中不同成分的作用靶点和药理作用强弱各不相同,IRhy抑制小胶质细胞炎症作用较强,MOD抑制谷氨酸兴奋毒性作用较好,Rhy明显减轻Aβ引起的神经元死亡,GM抑制ACHE作用较强。如何获得最佳有效成分群,通过各成分间的协同作用充分发挥钩藤治疗AD的潜能,值得深入探讨。综上,钩藤中多种成分在不同AD模型中表现出良好的药理活性,但目前的研究尚不够系统、不够透彻,存在提取物成分不明、作用机制研究较浅、体内体外药效研究联系不紧密等诸多问题。若要充分挖掘出钩藤治疗AD的药用潜能必须将分子、细胞、离体组织和整体动物多个水平的药效研究与钩藤化学成分研究有机地结合起来,互相补充、互相佐证。相信随着高效液相、液相色谱-质谱联用、核磁共振等技术在化学成分研究中的普及以及分子对接、系统生物学和网络药理学在药效研究中的应用,钩藤的化学成分将逐渐清晰,作用机制研究逐渐深入,其防治AD的药用价值将得到发挥。
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