HIV-1引起的获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS, 简称艾滋病), 是一种危害严重的病毒传染性疾病^{[1, 2]}。据联合国艾滋病规划署估计, 2014年全球约有3 950万名艾滋病患者, 其中新增感染人数为430万人, 另有290万人死于与艾滋病相关的疾病^[3]。FDA已批准了20多种抗HIV-1的药物, 这些药物组成的高效抗逆转录病毒治疗 (highly active antiretroviral therapy, HAART) 提高了艾滋病患者的生活质量, 也延长了患者的生命^[4]。

目前, 临床上使用的抗HIV-1药物主要是逆转录酶抑制剂 (reverse transcriptase inhibitors, RTIs)、蛋白酶抑制剂 (protease inhibitors, PIs)、融合抑制剂和整合酶抑制剂 (integrase inhibitors, INIs)。RTIs包括核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NRTIs), 如齐多夫定 (zidovudine, AZT)、拉米夫定 (lamivudine, 3TC) 和司他夫定 (stavudine, D4T) 等; 非核苷类逆转录酶抑制剂 (non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NNRTIs), 如依法韦仑 (efavirenz, EFV)、奈韦拉平 (nevirapine, NVP) 和地拉夫定 (delavirdine, DLV) 等。PIs主要有沙奎那韦 (saquinavir, SQV)、茚地那韦 (indinavir, IDV) 和 (ritanovir, RTV) 等。融合抑制剂主要有西夫韦地 (enfuvirtide, T20) 和马拉韦罗 (maraviroc, MVC)。INIs主要有埃替格韦 (elvitegravir, EVG) 和雷特格韦 (raltegravir, RAL)^{[5, 6]}。

尽管药物治疗已经取得极大的成功, 但是由于没有疫苗, HIV-1感染的预防仍然面临严重挑战。近几年, HIV-1的暴露前预防性治疗 (pre-exposure prophylaxis, PrEP) 受到广泛关注和高度重视。PrEP即将抗HIV-1药物用于HIV-1感染高危人群, 使其获得预防主动权的方法, 是降低感染HIV-1风险的一项新型干预措施。目前应用于PrEP的候选药物较少, 常见的候选药物有替诺福韦 (tenofovir, TDF) 和3TC。此外, 一些抗HIV-1药物是否可以用于PrEP目前尚在研究中。HIV-1融合抑制剂可以直接阻断病毒感染, 因此在PrEP中的应用显得尤为重要。但是, T20作为一种多肽药物, 半衰期较短且使用剂量比较大, 因此用于预防给药的可行性不大。而MVC是一种CCR5拮抗剂, 它在PrEP的应用目前尚存争议。虽然在人源化小鼠模型中MVC可以有效地预防HIV经阴道感染^[7], 但有报道MVC不能预防猕猴模型的HIV经直肠感染^[8], 并且有证据显示MVC在人源化小鼠体内半衰期比较短^[9]。

在HIV-1黏膜传播过程中, 病毒的遗传多样性是显著减少的, 表现出严重的“遗传瓶颈”效应和有限的早期进化。研究发现, 只有少数的一株或几株HIV-1病毒可以建立有效感染, 这种病毒被称为初始传播病毒 (transmitted/founder virus, T/F病毒)^{[10, 11]}。研究T/F病毒的生物学和早期进化特征, 有助于阐明HIV-1建立感染的关键因素。目前, T/F病毒的研究多侧重于包膜蛋白的进化特征^{[11, 12]}。T/F病毒对抗HIV-1药物敏感性的系统研究, 将为艾滋病高危人群预防性治疗提供最优的药物选用策略, 为PrEP方案的优化提供重要的实验依据, 然而此方面的研究国内外尚未见报道。

因此, 本文首先构建了含荧光素酶报告系统T/F病毒的克隆, 以荧光素酶作为报告基因, 进而在几大类抗艾滋病药物中分别选取了两种有代表性的药物用于研究T/F病毒HIV-1药物的敏感性, 以期为艾滋病高危人群预防性治疗提供最优的药物选用策略。

质粒pZM246F-10、pZM247Fv2和pZM247Fv1^[13] (NIH AIDS Reagents Program Catalog分别为11828、11829和11941) 由NIH AIDS Reagent Program惠赠。pIndie-C1质粒由加拿大梁臣教授惠 赠; pNL4-3(Luc) 和pHCMV-G (VSV-G) 质粒由美国Johnny He教授提供; puc19质粒购自美国Invitrogen公司。抗HIV-1药物3TC、D4T、EFV、NVP、RAL、SQV和IDV均由美国国立卫生研究院 (NIH) 惠赠, 且都溶于二甲基亚砜 (DMSO)。转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司; 同源重组试剂盒 (In-Fusion^®HD cloning kit) 购自美国Clontech公司; 荧光素酶活性测定试剂盒Luciferase Assay System购自美国Promega公司。

应用同源重组技术, 将T/F病毒及同一亚型的慢性感染病毒Indie-C1 5' 端长末端重复序列 (5'-long terminal repeat, 5'-LTR) 至包膜蛋白之前的序列 (nt) 与NL4-3(Luc) 包膜蛋白至3' LTR之间的序列 (nt) 融合并连接到puc19载体, 从而构建一个含荧光素酶报告系统的嵌合病毒。具体步骤: 首先将T/F病毒株pZM246F-10、pZM247Fv2和pZM247Fv1及慢性感染株pIndie-C1通过PCR扩增得到各自5' LTR至包膜蛋白之前的序列 (其中在PCR引物上增加了SalI和SacII两个限制性内切酶位点), 随后利用同源重组技术, 将各自对应的序列连接到puc19载体, 最后转化E.coil DH5α, 通过测序验证获得相应质粒。利用SalI将上述构建得到的克隆切成线性片段, 同时利用PCR将pNL4-3(Luc) 包膜蛋白至3' LTR之间的序列进行扩增, 应用同源重组技术将两个片段进行连 接, 即得到含荧光素酶报告系统T/F病毒的克隆。这些嵌合病毒载体分别命名为11828(Luc)、11829(Luc)、11941(Luc) 和Indie(Luc)。构建所用引物如表 1所示。

表1(Table 1)

Table 1 Sequences of primers for T/F virus(Luc). F: Forward; R: Reverse Primers Sequences (5'→3') pZM246-F AGC TCG GTA CCC GGG TGG AAG GGT TAA TTT ACT CTA AGA A pZM246-R TGC CTG CAG GTC GAC CTA TAA ATC ATC AAA AAG CCT AAT A pZM247-F AGC TCG GTA CCC GGG TGG AAG GGT TAG TTT ACT CCA AGA pZM247-R TGC CTG CAG GTC GAC TTA TAA GTC AAT AGC ACC CAA AAG C pIndie-C1-F AGC TCG GTA CCC GGG TGG AAG GGT TAA TTT ACT CCA AGA pIndie-C1-R TGC CTG CAG GTC GAC TTA CAA ATC ATT AAC ATC CAA AAG C pNL4-3(pZM246)-F TGA TTT ATA GGT CGA TGC TAC AGA AAA ATT GTG GGT pNL4-3(pZM246)-R TGC CTG CAG GTC GAC TGC TAG AGA TTT TCC ACA CT pNL4-3(pZM247)-F TGA CTT ATA AGT CGA TGC TAC AGA AAA ATT GTG GGT pNL4-3(pZM247)-R TGC CTG CAG GTC GAC TGC TAG AGA TTT TCC ACA CT pNL4-3(pIndie-C1)-F TGA TTT GTA AGT CGA TGC TAC AGA AAA ATT GTG G pNL4-3(pIndie-C1)-R TGC CTG CAG GTC GAC TGC TAG AGA TTT TCC ACA CT

Table 1 Sequences of primers for T/F virus(Luc). F: Forward; R: Reverse

293T细胞培养于含10% 胎牛血清 (FBS) 的DMEM培养基中。6孔板每孔接种细胞数为4×10⁵个, 培养24 h后用Lipofectamine 2000转染, 详细参见使用说明。SupT1细胞 (本室保存) 培养于含10% FBS的RPMI 1640培养基中。

构建得到的质粒转染293T细胞, 48 h后收获细胞。弃旧培养基, 加入预冷的PBS 1 mL, 吹打并收集细胞, 2 000 ×g离心5 min, 1× Luciferase Cell Culture Lysis 100 μL冰上裂解细胞30 min, 每10 min涡旋振荡一次。取样品6 μL加入荧光素酶底物40 μL, 使用试剂盒Luciferase Assay System测定裂解液的荧光素酶活性。

96孔板每孔接种1×10⁵个SupT1细胞(200 μL)。取所得上清病毒液10 μL感染SupT1细胞。培养48 h后, 移液器反复吹打混匀细胞, 取出细胞悬液50 μL, 加入等体积2× Luciferase Cell Culture Lysis裂解细胞。使用试剂盒Luciferase Assay System测定裂解液的荧光素酶活性。根据报告基因荧光素酶活性的大小得出感染性病毒的量。

收集含病毒颗粒的上清液, 使用人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒 (万泰生物药业), 参照说明书进行。除空白孔外, 每孔加入生物 素试剂20 μL, 同时梯度稀释标准样品, 然后每孔加入标准样品和病毒上清100 μL, 轻轻振荡混匀, 37 ℃孵育60 min。洗涤液清洗5遍; 每孔各加入酶标试剂100 μL, 37 ℃静置60 min, 洗涤液清洗5遍; 然后 每孔加入显色试剂A和B各50 μL, 轻轻振荡混匀, 37 ℃下反应不超过30 min (视反应物颜色深浅决定) 后, 加入反应终止液50 μL, 轻轻振荡, 于450 nm波长下测定吸光度值。

检测细胞蛋白样品收取: 弃旧培养基, 预冷PBS清洗, 加入预冷PBS 1 mL, 刮取6孔板中细胞, 2 000×g离心5 min去上清液。加入预冷PBS 50 µL重悬, 再加入2×蛋白上样缓冲液50 µL裂解细胞。沸水浴10 min, 每隔3 min涡旋振荡。蛋白样品储存于-20 ℃或者-80 ℃。Western blot流程: 12% SDS-PAGE分离蛋白样品。70 V恒压湿法转膜 1 h后, 5%脱脂奶粉室温封闭1 h。先后与一抗和二抗孵育, 然后ECL显色。 抗体使用浓度为α-Gag (1∶5 000, 由本实验室自制), β-actin (1∶5 000, Abcam); 二抗山羊抗兔IgG (1∶5 000), 山羊抗小鼠IgG (1∶5 000)。

293T细胞于6孔板每孔接种5×10⁵个。500 ng T/F virus(Luc) 或Indie-C1(Luc) 与500 ng pHCMV-G质粒共转染细胞。转染48 h后, 取上清, 0.22 μm滤膜过滤, 测定细胞内荧光素酶活性。SupT1细胞以每毫升5×10⁵个接种于96孔板中, 每孔接种200 μL, 并加入上述293T细胞中获得的上清液 (病毒与细胞的体积比为1∶20) 10 μL, 然后每孔加入不同浓度的待测化合物2 μL, 每种药物设3组平行孔, 并设空白和DMSO阴性对照, 培养48 h后, 使用试剂盒Luciferase Assay System测定裂解液的荧光素酶活性。根据报告基因荧光素酶活性的高低来衡量感染病毒的量。随后利用得到的感染病毒的量计算药物对不同毒株的IC₅₀值。对蛋白酶抑制剂等药物晚期活性的测定, 选在转染293T细胞产生假病毒后6 h加入阳性药物, 48 h收获假病毒感染SupT1细胞。其余步骤与早期药物测定方法相同。

每组实验重复3次, 组间比较采用t检验。

为了便于测定T/F病毒及同一亚型的慢性感染病毒的药物敏感性, 首先利用同源重组技术, 构建 了含有荧光素酶报告基因的单循环HIV-1克隆。其 中, T/F病毒分别命名为11828(Luc)、11829(Luc) 和11941(Luc), 以及慢性感染病毒Indie(Luc)。将构建的质粒与表达VSV-G的质粒共转染293T细胞, 以常用的单循环HIV-1克隆NL4-3(Luc) 为对照。48 h收获细胞, Western blot检测主要蛋白的表达, 实验结果显示, 病毒蛋白Gag能够高效表达 (图 1A)。利用酶标仪检测荧光素酶的活性, 荧光素酶值均在10⁷ RLU以上, 说明报告基因荧光素酶成功表达 (图 1B经)。随后, 通过ELISA定量的等量假型病毒感染SupT1细胞, 检测感染细胞中荧光素酶的活性。结果显示, 荧光素酶值大于10⁵ RLU, 说明所产生的假型HIV-1病毒能有效感染细胞, 尽管感染性低于对照NL4-3(Luc) (图 1C)。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Regulated T/F virus (Luc) and Indie-C1(Luc) expression in 293T cells. (A) Expression of T/F virus and chronic virus constructs; (B) Luciferase activity in producer cells expressing T/F or chronic viruses constructs; (C) Luciferase activity of pseudotyped T/F and chronic viruses in SupT1 cells. RLU: Relative light units

为了比较T/F病毒对NRTIs的敏感性, 作者选择了有代表性的两种药物3TC和D4T用于实验, 两种药物都以浓度梯度添加SupT1, 空白组加入DMSO。对两种药物的敏感性验证中, 经t检验, T/F病毒 11828(Luc)、11829(Luc) 和11941(Luc) 与慢性感染株Indie-C1(Luc) 相比, 均无显著性差异 (P > 0.05) (图 2)。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Effects of 3TC (A) and D4T (B) on viral replication. Compounds were added at different concentrations. Error bar represents the standard errors of three independent experiments. D4T: Stavudine; 3TC: Lamivudine

作者进一步研究了T/F病毒对NNRTIs的敏感性, 选择了有代表性的两种药物EFV和NVP。在EFV的实验中, 11828(Luc) 和11941(Luc) 与Indie-C1(Luc) 相比, 表现出显著性差异 (P < 0.05); 而11829(Luc) 与Indie-C1(Luc) 相比, 并没有显著性差异 (P > 0.05) (图 3A)。在NVP的实验中, 11828(Luc)、11829(Luc) 和11941(Luc) 与慢性感染株Indie-C1(Luc) 相比, 均表现出显著性差异 (P < 0.05), 且11828(Luc) 与Indie-C1(Luc) 的IC₅₀值相比, 提高了6倍以上 (图 3B)。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Effects of EFV (A) and NVP (B) on viral replication. Compounds were added at different concentrations. Error bar represents the standard errors of three independent experiments. P < 0.05, **P < 0.01 vs Indie-C1(Luc). EFV: Efavirenz; NVP: Nevirapine

选择INIs的代表性药物RAL来比较T/F病毒对INIs的敏感性。结果显示, 11828(Luc)、11829(Luc) 和11941(Luc) 与Indie-C1(Luc) 相比, 无显著性差异 (P > 0.05) (图 4)。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Effects of raltegravir (RAL) on viral replication. Compounds were added at different concentrations. Error bar represents the standard errors of three independent experiments

T/F病毒对PIs敏感性的影响选择了有代表性的两类药物SQV和IDV。对两种药物的敏感性验证中, T/F病毒11828(Luc)、11829(Luc) 和11941(Luc) 与慢性感染株Indie-C1(Luc) 相比, 均无显著性差异 (P > 0.05) (图 5)。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Effects of SQV (A) and IDV (B) on viral replication. Compounds were added at different concentrations. Error bar represents the standard errors of three independent experiments. IDV: Indinavir; SQV: Saquinavir

鉴于T/F病毒对NNRTIs表现出一定的耐药性, 作者对T/F病毒与慢性感染病毒逆转录酶的蛋白序列进行了比对, 以期发现与敏感性下降相关的序列变异。结果显示, 与慢性感染病毒相比, T/F病毒11828株的蛋白同源性为95%, 其中以下位点发生突变, D39E、I60V、I69T、Y121D、D123G、I165T、R166K、E207N、I292V、S322A、R357M、T359S、M377T、T400I、D432E、I434V、A435P、E449D、L452I、P461K、K464I、I465V、T477A、Y483Q、S491L、I521V、S554N和K558R。11829与慢性感染株相比, 蛋白序列同源性为95.4%, 其中以下位点发生突变, A36V、D39E、I60V、I69T、Y121D、I165T、R166K、I202V、Q245K、R277K、Q278N、A286T、Q334N、N348I、M377L、S379G、T386I、D432E、A435I、V437A、L452I、I466V、Y483Q、K527Q、S554T和K558R。11941与慢性感染株相比, 蛋白序列同源性为95.7%, 其中T27S、A36E、D39M、I69T、I165T、R166K、R277K、Q278N、A286T、Q334H、M377L、T386I、D432E、A435L、V437A、L452I、I466V、Y483Q、S491L、K527Q、S554T和K558R位点发生突变。通过比对, 作者发现11828、11829和11941三株病毒存在多个相同或相似的位点突变, 如相同突变: I69T、I165T、R166K、D432E、L452I、Y483Q和K558R; 相似突变: M377T(L)、A435P(L, I) 和S554N(T) (表 2),这些位点的突变在已知NNRTIs的耐药性突变中尚未发现。

表2(Table 2)

Table 2 Key non-consensus residues in the reverse transcriptase of T/F virus Indie-C1 11828 11829 11941 Region I69 T T T Catalytic domain I165 T T T Catalytic domain R166 K K K Catalytic domain D432 E E E RVT_connect L452 I I I RNaseH Y483 Q Q Q RNaseH K558 R R R RNaseH M377 T L L RVT_connect A435 P I L RNaseH S554 N T T RNaseH

Table 2 Key non-consensus residues in the reverse transcriptase of T/F virus

由于HIV病毒基因组相对比较复杂, 部分HIV-1病毒会在感染初期通过快速的基因组重组从而逃逸宿主体内的免疫反应, 在受感染者体内存活并进一步繁殖, 这样在感染者体内HIV-1病毒就形成了一个以优势株为主的相关突变株病毒群即称为T/F病毒, 以利于其在不良环境下生存。目前, 对HIV-1的治疗主要是利用药物针对病毒生命周期的各个重要环节进行阻断, 因此, 进一步了解T/F病毒对不同药物的敏感性, 将为艾滋病PrEP提供重要的理论支持。

本研究首次构建了含荧光素酶报告系统的T/F病毒克隆, 进而验证了T/F病毒对目前临床上使用的几大类抗HIV-1药物的敏感性。研究发现, T/F病毒对NNRTIs的敏感性较差。通过氨基酸序列比对, 作者发现11828、11829和11941三株病毒存在多个相同或相似的突变位点, 且主要集中于RNaseH结构域。NNRTI的已知耐药性突变位点则集中于聚合酶附近, 可以抑制dNTP的结合。作者推测在C亚型的T/F病毒中, 这些RNaseH位点的突变可以通过影响RNaseH活性而影响逆转录酶的活性和对NNRTIs的敏感性。因为T/F病毒的突变并非由于药物的选择压力所致, 所以上述突变可能是病毒建立感染过程中自然选择的结果, 为病毒的复制与传播提供一定的进化优势。尽管目前T/F病毒对NNRTIs敏感性下降的机制尚不清楚, 但该研究结果提示作者, 当对高危人群进行PrEP时, 医生选择RTIs时应尽量避免选择NNRTIs。