2016, Vol. 51
脂质体 (liposomes) 是一种由类生物膜结构的磷脂双分子层构成的封闭囊泡, 粒径大小在几十纳米到几十微米范围, 属于热力学不稳定体系。作为一种新型药物传递载体, 脂质体具有无免疫原性、良好生物相容性、提高药物稳定性和降低药物毒性等优点, 在体内可浓集于肝脏、脾脏等组织, 具有被动靶向性, 也可通过抗体或配体进行修饰, 选择性释放药物而具有主动靶向性[1, 2]。
由于脂质体在体内外的弱稳定性, 产生了一系列问题[3]。体外问题包括: 制备工艺不成熟, 包封率低; 基本理化性质变化, 粒子易聚集、融合; 磷脂膜不稳定, 加剧药物泄露; 运输储存成本高; 制剂保质期短。体内问题包括: 在血液、消化液中易被消除, 影响治疗效果; 热不稳定等使药物有突释风险; 氧化产物或药物泄露; 体内毒性增加。这大大限制了其作为药物载体的应用。因此运用有效、可靠的研究技术和方法, 对脂质体制剂学稳定性进行评价十分重要。本文根据脂质体稳定性影响因素和研究策略不同, 从物理、化学和生物3个方面, 对近年来脂质体研究中制剂学稳定性的研究技术与方法进行综述。
1 物理稳定性脂质体由流动的动态磷脂膜构成, 磷脂不断自由地跨膜交换位置, 从而引起脂质体粒子自发地聚集、沉降, 磷脂膜不稳定、粒径和zeta电位的变化会造成脂质体物理形态结构的不稳定。考察脂质体的基本理化性质, 是评价其制剂学稳定性的常用方法。
1.1 制剂性状从外观形貌上观察稳定的脂质体, 对于脂质体混悬制剂, 肉眼观察应无沉淀、无絮凝分层、分散均匀和流动性好, 对光可见明显的乳光现象, 且有腥气味; 对于冻干制剂, 其外观应为疏松均匀的块状物或粉末, 平滑饱满且表面光整。Manosroi等[4]用多种处方制备人胰岛素阳离子脂质体, 将脂质体于多个温度下存储4个月, 观察记录脂质体颜色、气味、澄清度和沉淀的变化情况, 通过这种直接方式考察脂质体稳定性。Chun等[5]制备用正电性材料 (壳聚糖) 和负电性材料 (高甲氧基果胶和角叉菜胶) 层层包裹的多层脂质体, 观察记录24 h内脂质体沉降高度的变化以及脂质体悬液形态变化, 比较不同处方脂质体的稳定性。
1.2 微观形态结构脂质体是一种纳米药物载体, 制剂稳定性与粒子微观形态性质相关, 稳定脂质体应粒子边缘圆整, 为封闭多层的圆球体或囊状, 且粒度大小均匀。Guan等[6]以明胶作为脂质体内部支撑, 制备紫杉醇冻干脂质体, 用扫描电子显微镜 (scanning electron microscopy) 观察发现明胶优化的脂质体球形结构完整, 无紫杉醇晶体泄露, 说明该脂质体更能抵抗冷冻干燥的压力破坏, 物理稳定性好。Wang等[7]用壳聚糖修饰表阿霉素脂质体, 用透射电子显微镜 (transmission electron microscopy) 对储存前后的脂质体粒子进行对比观察, 发现壳聚糖修饰的脂质体具有完整球形形态, 无粒子聚集现象。Stark等[8]使用了小角X射线散射法 (small angle X-ray scattering) 考察冻干再水化的脂质体, 发现脂质体出现脂质双层膨胀, 该现象在粒径分析中无法检测, 膨胀会影响药物释放从而破坏制剂稳定性。
原子力显微镜 (atomic force microscope, AFM) 能够通过极敏感的微小探针扫描样品来获得更加真实的三维图像, 不需要对样品进行任何特殊处理, 最大程度保留样品的真实形貌, 还可利用AFM所获 的微粒信息和力学信息, 进一步考察稳定性。Saesoo等[9]考察了制备处方中添加不同浓度非离子表面活性剂 (Montanov 82) 包载亚洲积雪草提取物脂质体的稳定性, 用AFM多次观察储存中脂质体的形貌变化, AFM图像表明较高浓度的Montanov 82脂质体 粒子不易聚集粘连, 脂质体的稳定性提高。脂质体 的刚性会影响其结构稳定和药物释放, Nakano等[10]经AFM测得的粒子吸附高度 (H) 与激光粒度仪测量的粒子粒径 (P) 比值, 即R = H/P, 表征脂质体刚性, R值越接近1的脂质体刚性越强, 具有更好的稳定性。Liang等[11]应用AFM力曲线测量技术研究Pluronic脂质体的纳米力学特性, 以脂质体粒子间结合常数的大小来评价脂质体稳定性。
1.3 粒径和zeta电位脂质体的粒径大小及其分布与制剂稳定性直接相关, 影响脂质体在生物体内的行为和处置, 是评价脂质体稳定性的重要参数。高质量脂质体粒径大小、分布应较为稳定, 粒径呈正态分布, 且分布范围窄。Zeta电位是体系中颗粒之间相互排斥或吸引强度的衡量标准, 适宜的zeta电位能够减少脂质体的聚集和融合, 且在脂质体与药物之间具有稳定作用。Wieber等[12]对多肽脂质体在储存期间的粒径大小、分布和zeta电位进行连续测定, 结果表明冻干储存的多肽脂质体稳定性更好。Pippa等[13]制备了聚环氧乙烷-b-聚己内酯 (PEO-b-PCL) 修饰二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC) 脂质体, 通过粒径大小、分布和zeta电位, 确定适合处方比例的PEO-b-PCL能提高脂质体的物理稳定性。Natsume等[14]通过考察包载羧基荧光素脂质体在椎板流变仪产生的剪切流中粒径大小变化来研究脂质体稳定性。Benedini等[15]添加维生素C棕榈酸酯作为抗氧化剂制备碘胺酮脂质体, 通过粒径和zeta电位, 运用DLVO理论计算粒子引力和斥力, 研究不同浓度抗氧化剂对脂质体稳定性的影响。
1.4 泄漏率脂质体不稳定造成包载药物泄露, 不仅会使药物代谢动力学过程和药效发生改变, 还可能增大药物的毒性, 泄漏率是评价脂质体稳定性的重要指标。Ghanbarzadeh等[16]将雷帕霉素冻干脂质体在不同温度下储存6个月, 期间测定脂质体包封率变化, 计算泄漏率评价脂质体的稳定性, 结果表明葡聚糖作为冻干保护剂的脂质体稳定性更好。Zhou等[17]研究分别用高甲氧基果胶和低甲氧基果胶包裹修饰的维生素C脂质体, 在不同温度下果胶修饰的脂质体泄漏率变化更小, 表明其稳定性更好。Lehofer等[18]通过肺人工表面活性剂 (Alveofact) 与脂质体相互作用的泄漏率变化, 考察气雾剂脂质体不同处方的稳定性。
1.5 热力学参数脂质体膜升温达到相变温度 (phase transition temperature, Tm) 时, 脂质膜由胶晶态变为液晶态, 可液态、液晶态和胶晶态共存, 膜横切面和流动性增加, 双分子层厚度减小, 出现相分离, 导致包封药物的泄露。可借助热分析方法对脂质体热稳定性进行研究, Detoni等[19]通过差热分析 (differential thermal analysis) 研究花椒精油脂质体热稳定性, 结果表明, 对比空白脂质体, 花椒精油提高脂质体的Tm, 改善了脂质体热稳定性。Liu等[20]制备联合包载辣根过氧化物酶和盐酸米托蒽醌的多囊脂质体, 用差示扫描量热法 (differential scanning calorimetry) 测定不同处方比例的脂质体Tm。结果表明, 不同处 方制备的脂质体Tm无显著性差异且均大于37 ℃, 说明米托蒽醌和辣根过氧化物酶的加入对脂质体性 能基本没有影响, 在人体正常体温下稳定, 能避免药物在体内突释的风险。等温滴定量热法 (isothermal titration calorimetry, ITC) 能在恒温下连续、准确地测量由结合成分添加而引起化学反应热量的变化, 从而得到分子间相互作用大小, Lin等[21]用ITC分别测定DPPC脂质体和二棕榈酰磷脂酰甘油 (DPPG) 脂质体混悬制剂的稀释热并结合第二维里系数 (second virial coefficient) 大小进行分析, 结果表明DPPG脂质体稳定性比DPPC脂质体稳定性更好。Szczes等[22]运用朗缪尔单层膜 (langmuir monolayer) 理论, 建立关于DPPC/Chol (胆固醇) 这一系统的表面压力 (π) 和面积 (A) 的等温线, 基于π-A等温线, 确定化合物的相容性、分子包载和分子相互作用的种类和大小, 确定最稳定脂质体的DPPC/Chol处方比例, 该法对多种磷脂脂质体稳定性研究同样适用。
1.6 聚集状态脂质体不稳定产生的聚集现象与粒径、zeta电位和膜稳定性等多方面复杂因素相关, 可直接从脂质体制剂整体的聚集状态研究脂质体稳定性。脂质体聚集会使制剂吸光度产生较大的变化, Wang等[23]将制备的羟基积雪草苷脂质体在不同温度下存储, 期间测定脂质体悬液吸光度 (500 nm), 随着时间推移和温度升高, 不稳定的脂质体制剂聚集融合, 吸光度逐渐增大, 结果表明聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG) 修饰可以减缓脂质体聚集融合从而提高稳定性。Cheng等[24]通过离心-分光光度法, 以稳定系数Ke作为评价指标研究甘草次酸阳离子脂质体稳定性, 测定制剂高速离心前后吸光度 (500 nm) (Ao: 离心前, A: 离心后) 的变化, 根据Ke = (Ao-A)/Ao, Ke值越小的脂质体制剂越稳定。Liu等[25]通过凝聚动力学实验研究灯盏花素脂质体冻干粉的稳定性, 测定重悬的脂质体混悬制剂电导率在不同温度下随时间的变化, 通过聚集速率方程计算脂质体聚集活化能, 结果表明冻干脂质体聚集活化能低, 说明冻干制剂稳定性更好。Tan等[26]向叶黄素脂质体悬液中添加非离子表面活性剂Triton X-100, 每隔5 min测制剂吸光度 (500 nm), 膜不稳定的脂质体易受Triton X-100破坏而聚集沉降, 吸光度变小, 结果表明2% 叶黄素能提高脂质体的稳定性。Yang等[27]研究处方添加胆固醇衍生物脂质体的储存稳定性, 脂质体聚沉会使制剂上清液含磷量减少, 用微量定磷法分析上清液含磷量来评价脂质体的聚集稳定性。
2 化学稳定性脂质体一般由磷脂、胆固醇和包封药物组成, 化学稳定性与脂质体的制备处方、储存条件如pH、温度、氧气和光照等影响因素有关, 主要由磷脂氧化和水解造成, 磷脂变性从根本上导致脂质体膜不稳定、包封药物泄露和产生有毒产物, 破坏脂质体的稳定性。
2.1 磷脂氧化大多构成脂质体的磷脂分子含有极易氧化的不饱和键, 氧化使脂质体膜流动性降低, 药物渗透性增加, 产生脂质体聚集、沉淀或破裂等现象, 稳定性遭到破坏, 同时磷脂氧化生成的过氧化物、丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 等氧化产物对人体有一定毒性。Mosca等[28]用氧化指数评价不同处方脂 质体的抗氧化稳定性, 氧化指数为脂质体悬液在233 nm与210 nm的吸光度比值, 由于氧化产物生成使制剂紫外吸收值随之增加, 氧化指数大小可反映单位磷脂氧化的程度, 说明脂质体的抗氧化稳定性。Gibis等[29]制备用壳聚糖和果胶层包裹的木槿花提取物多层脂质体, 通过顶空气相色谱测定储存期间己醛含量变化来评价脂质体的抗氧化稳定性。实验表明, 添加木槿提取物作为天然抗氧化剂的脂质体己醛含量低, 其抗氧化稳定性更好。Deygen和Kudryashova[30]用红外光谱法研究PEG壳聚糖脂质体的稳定性, PEG壳聚糖脂质体的C-H和C=O红外振动频率在储存期间变化更小, 说明PEG壳聚糖修饰的脂质体磷脂抗氧化稳定性更好。由于磷脂的氧化过程缓慢, 可使用加速氧化的试剂研究脂质体抗氧化稳定性, Geng等[31]用Fenton反应加速脂质体磷脂氧化, 硫代巴比妥酸 (thiobarbituric acid) 法测定脂质体氧化产物MDA含量, 并通过芘和脂质体相互作用的荧光强度确定脂质体膜的微极性变化, 从而考察脂质体稳定性。
2.2 磷脂水解脂质体的磷脂水解是自发过程, 而且随着水解进行, 水解产物游离脂肪酸 (free fatty acid, FFA) 增多使体系pH值随之下降, 进一步促进磷脂水解, 造成脂质体包封药物泄露及产生溶血磷脂等有毒的水解产物。Ding[32]通过Dole法测定补铁剂脂质体磷脂水解产物FFA含量, 结果表明, 在优选处方条件下制备的脂质体FFA含量低, 制剂稳定性较好。Liu等[33]通过检测脂质体在添加水解酶模拟肠液中水解产生的FFA含量来评价脂质体的抗水解稳定性。
3 生物稳定性脂质体在到达生物病灶或靶区前, 应保持其形态和功能的完整, 复杂的生物体内环境对脂质体稳定性是一大挑战, 如体内的多种蛋白、降解酶、免疫系统甚至血液流动都会破坏脂质体的稳定性, 进行脂质体的体内外生物稳定性考察, 不仅是脂质体制备和优化的重要基础, 同时也对临床试验和应用提供重要依据。
3.1 血液稳定性脂质体的普遍给药形式是静脉给药, 血液中存在多种破坏脂质体的因素: 循环系统中的磷脂酶会水解磷脂, 高密度脂蛋白破坏磷脂膜形成孔洞, 补体系统的多种调理素如抗体、补体等与脂质体结合, 使磷脂膜出现亲水通道而造成包封药物泄漏和水、电解质进入, 加速脂质体清除[34]。因此在模拟体内循环系统中孵育, 考察脂质体与血清、血浆相互作用对评价脂质体稳定性十分重要。Ramana等[35]制备PEG修饰的沙奎那韦脂质体, 研究其在体外模拟动态血液 (37 ℃血清蛋白磷酸盐溶液) 流动中脂质体粒径、zeta电位大小的变化, 结果表明PEG修 饰有助脂质体抵御血清蛋白的破坏。Li等[36]制备不同磷脂处方、不同主动载药方式并包载具有放射性99mTc-BMEDA的脂质体, 在37 ℃下、50% 胎牛血清中孵育, 测定脂质体的粒径大小、分布及放射性变化。结果表明, 柠檬酸盐梯度法载药的阴离子脂质体稳定性更好。
Jung等[37]制备热变性牛血清白蛋白修饰的阿霉素脂质体, 将脂质体在37 ℃大鼠血浆中孵育, 通过测定脂质体在血浆中的粒径变化来评价体外生物稳定性, 结果表明牛血清白蛋白能改善脂质体血浆中的稳定性。Nguyen等[38]将顺铂脂质体与人血浆37 ℃共孵育, 用电感耦合等离子体质谱 (inductively coupled plasma mass spectrometry) 测定铂的含量, 结果表明PEG修饰的顺铂脂质体泄漏率低。Radhakrishnan等[39]制备具有造影功能的超声波敏感脂质体, 研究脂质体在溶解氧气、不同温度、不同血压 (健康人血压或高血压患者血压) 及不同介质 (猪血清或人全血) 的模拟循环系统中的体外生物稳定性。
3.2 消化液稳定性口服给药作为一种便捷的给药方式, 研究开发口服脂质体具有广阔的发展前景, 由于口服脂质体会经消化道吸收, 可通过研究脂质体在模拟人体胃肠液中性质的变化来考察其稳定性。Parmentier等[40]制备包载渗透促进剂和四醚脂的脂质体, 分别在模拟胃液、肠液中孵育, 通过测定脂质体孵育期间粒径和泄漏率变化来评价其在消化液中稳定性。Agrawal等[41]将口服胰岛素脂质体在模拟 胃液、肠液中孵育, 根据食物排空时间规律测定脂质体粒径、zeta电位和包封率变化, 结果显示聚丙烯酸树脂和聚烯丙胺盐酸盐共修饰的脂质体稳定性更好。Hu等[42]制备禁食和进食状态的两种模拟肠液, 以及提取大鼠体内的胃肠液, 研究所制备的口服胰岛素脂质体在胃肠液中的稳定性。
3.3 体内生物稳定性脂质体在体内稳定是发挥载体作用的关键, 体内环境相比体外稳定性评价的模拟环境更加复杂和真实, 更具意义。Epstein等[43]将阿仑膦酸钠脂质体通过静脉注射用于新西兰兔, 多次取血采用分子排阻色谱处理样品, 通过脂质体泄漏率和粒径分布变化评价脂质体的体内生物稳定性。Seo等[44]用正电子发射断层成像 (positron emission tomography) 比较64Cu-DSPE (二硬脂酰磷脂酰乙醇胺) 和64Cu-DPPE (二棕榈酰磷脂酰乙醇胺) 脂质体在小鼠体内放射性的衰减程度来评价脂质体的体内生物稳定性。Sax等[45]使用高频超声成像系统, 研究可用于超声成像的全氟丙烷脂质体, 通过脂质体在体内回声反射率随时间的变化评价脂质体的体内稳定性, 研究发现PEG不仅可以增强脂质体的体内生物稳定性, 同时能提高脂质体的载气量。
4 结语稳定性问题是脂质体目前工业化所面临和必须解决的关键问题, 而在脂质体稳定性研究方法上还存在一些问题: 稳定性研究方法和参数繁多, 脂质体 在体内外稳定性评价上没有形成一致的标准; 很多研究对脂质体稳定性评价并不全面或不成体系; 体内生物稳定性评价的研究相对较少等。作者对脂质体稳定性评价提出以下几点建议: ① 建立综合物理、化学和生物稳定性3方面的稳定性评价体系; ② 新型脂质体在研究中应进行有针对性的稳定性考察, 如靶向脂质体应体外考察其在模拟靶区环境的制剂学稳定性; ③ 结合脂质体稳定性的影响因素, 将其他领域的新仪器、新技术应用到脂质体稳定性考察中。只有脂质体制剂学稳定性的研究技术和方法进一步的完善发展, 才能更好发挥脂质体的巨大优势和应用价值。
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