细胞周期蛋白依赖性激酶 (Cdks) 是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,细胞周期调控、转录起始和某 些特定代谢级联反应控制等过程都需要Cdks参与调控^[1]。Cdk5是Cdks家族中的特殊成员。Cdk5定位于7号染色体长臂3区6带 (7q36),编码蛋白分子质量33 kDa^{[2, 3]}。Cdks单体形态不具有生物活性,大部分Cdks与调控单元——细胞周期蛋白 (cyclins) 结合后,生成活性二聚体,Cdk5不与周期蛋白结合,其结合蛋白为p35或p39,二聚后激活^[4]; Cdks家族成员大部分都参与调控细胞周期相关活动,Cdk5不参与相关调控,主要在神经系统中发挥作用。p35激活蛋白主要分布在大脑中枢神经细胞及胶质细胞中,在神经细胞有丝分裂后期大量表达^[5]。在中枢神经系统中,Cdk5的主要功能包括大脑发育过程中神经细胞的生长、轴突延伸、神经细胞突触的形成和激活以及神经细胞生存信号和死亡信号的调控等。

在大脑中,Cdk5的主要激活蛋白是p35,其在Ca²⁺诱导的蛋白水解酶作用下,将p35剪切为p25后,Cdk5/p25完全激活。p25蛋白序列与cyclins完全不同,但采取的折叠方式、键合位置与cyclins一致。在体外,Cdk5/p35和Cdk5/p25对组蛋白H1和tau的活性相差不大^[6]。但是,多出的10 kDa酰胺化的序列会令p35定位在细胞膜上,只有p35水解为p25后,Cdk5复合物才能释放到细胞质中(图 1)。在细胞中,Cdk5/p25对信号和压力的敏感性高于Cdk5/p35复合物^{[4, 7]}。

图 1

图 1 Cdk5细胞信号通路

Cdk5除了与神经系统发育有关,近年来国内外大量研究表明Cdk5与癌症有着密切的关系。实验表明Cdk5的过度活跃会造成恶性胶质瘤和成神经细胞瘤的形成^[8]。在结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和膀胱癌等癌细胞中,都观察到Cdk5的过表达^[9]。本文将会重点讲述Cdk5与癌症的相关性及Cdk5抑制剂的最新进展。

Cdk5对肿瘤细胞的迁移调控有重要的作用。Kasemeier-Kulesa等^[10]研究发现在胰腺癌细胞中Cdk5-p35以复合物形式存在,处于激活状态。通过药物抑制Cdk5在胰腺癌细胞中的活性后,人胰腺导管上皮细胞 (hTERT-HPNE) 和MIAPaCa-2胰腺癌细胞的迁移性显著下降。同时,Cdk5失活会造成细胞形态改变,从而使细胞的极性改变。Cdk5除了调控细胞迁移,还可以调控细胞伪足的生成,抑制癌细胞浸润。实验证明,抑制Cdk5的活性可以显著降低胰腺癌细胞的生长和转移^[11]。除此之外,单鸟苷酸酶RalA和RalB在胰腺癌细胞发展过程中扮演重要的作用。Feldmann等^[12]认为Ras相关信号传导通路与Cdk5有关。在MIAPaCa-2胰腺癌细胞中,抑制Cdk5会降低RalA-GTP和RalB-GTP的水平,进而抑制胰腺癌细胞的生成能力。同时,发现持续注入活性RalA和RalB会弥补抑制Cdk5所带来的负作用,这表明Ral蛋白是Cdk5的下游信号,Cdk5可以通过控制RalGEFs和RalGAP调控RalA和RalB的激活。因此,可以认为Cdk5是治疗胰腺癌潜在的靶点。

Cdk5与癌症的发生有着紧密关系。Cdk5可以 使STAT3磷酸化,调控其转录活性。在甲状腺髓癌 细胞中,STAT3磷酸化会造成癌细胞的增殖和促进肿瘤生成。另外,实验表明甲状腺髓癌细胞诱导的降钙素聚集会促使Cdk5激活,从而使癌细胞增殖。抑制Cdk5可通过降低STAT3磷酸化水平延缓肿瘤细胞 的生长。这些研究表明Cdk5对甲状腺癌发生发展有重要作用^[13]。

Cdk5激活促进了肿瘤的分化。在骨髓性白血病HL60细胞中,诱导单核白细胞分化可检测到细胞中Cdk5的水平急剧上升和激活。在HL60细胞中,Cdk5与p35二聚激活使白细胞分化抗原 (CD14) 等分化相关基因表达。通过PI3K-p70S6K-Egr1-Cdk5通路激活Cdk5/p35,进而激活MEK、ERK和p27等下游信号,达到细胞分化的过程。Cdk5调控单核细胞的分化,表明其可以作为治疗白血病的重要突破方法之一^[14]。

Cdk5与肿瘤细胞凋亡有关。在前列腺癌细胞中,地高辛可以促使细胞内Ca²⁺浓度升高,导致p25积聚,激活Cdk5造成癌细胞凋亡。实验表明,Cdk5抑制剂可以防止地高辛引发前列腺癌细胞凋亡^[15]。在卵巢癌细胞和胶质瘤细胞中,同样发现Cdk5可以调控细胞的凋亡。从肿瘤细胞凋亡方面治疗癌症,以Cdk5为靶点是一个相当有前景的提示。

Cdk5的失控还会造成转录异常,造成基因表达上调。在乳腺癌细胞中,Cdk5参与TGF-β1诱导的上皮细胞的转录过程^[16]。TGF-β1过表达会使Cdk5的表达上调,进而造成癌细胞转录的紊乱。

综上,Cdk5参与癌细胞的转录、生成、分化、迁移、浸润和凋亡等过程。同时,研究发现Cdk5过表达的癌症患者的预后远远劣于Cdk5未表达的患者^[7]。因此,以Cdk5为靶点进行癌症治疗是十分必要和有希望的策略。

20世纪80年代后期,具有抑制Cdk5过表达活性的化合物开始得到开发。这类化合物首先从天然产物中提取分离得到,是第一代ATP-竞争性Cdk5抑制剂。这类化合物的选择性相对较低,被称之为“pan- Cdk”抑制剂,对Cdk家族具有泛抑制作用。这一阶段,Cdk5抑制剂的开发通常与其生物学行为研究共同发展(如roscovitine)。研究初期认为roscovitine选择性抑制Cdk5、Cdk2和Cdk1,但随着生物学研究发现其同时具有通过调控Cdk7和Cdk9达到抑制转录的作用^[17]。在第一代Cdk5抑制剂中,roscovitine是第一个进入临床评价的药物。在I期临床试验中,56例健康受试者有1例出现轻微不良反应^[18]。在随之进行的临床II期试验中,roscovitine治疗非小细胞肺癌取得了较好的效果,但试验发现roscovitine并不能提高病人生存率,试验已被终止^[19]。目前roscovitine唯一还在进行的临床试验是关于皮质醇增多症疾病的治疗。

基于roscovitine等抑制剂的构效关系,以这类化合物为母核,开发了第二代ATP-竞争性抑制剂。第二代抑制剂显著地缩窄了抑制谱,降低了不良反应,现已有多类药物进入临床阶段。大量第一代ATP竞争性抑制剂机制阐明,ATP竞争性抑制剂选择性的关键是化合物暴露在ATP口袋之外的部分,这部分与Cdks结合程度的不同,决定了选择性的差异。同时,近年来许多非ATP-竞争性抑制剂也开始逐渐研究开发,以非ATP键合的口袋为锚点,有效避开共有的ATP结合位点,选择性和特异性提高,不良反应减少。非ATP-竞争性抑制剂主要分为多肽类和小分子化合物两类,抑制Cdk5与其活化底物p35或p25的结合,达到抑制Cdk5活性的目的^[20]。

第一代Cdk5抑制剂最先是从细菌、真菌和动植物中提取得到的嘌呤、嘧啶类似物。在早期研究中,尽管发现这类化合物具有抗肿瘤的活性,但并不了解其具体作用机制。研究人员以嘌呤和嘧啶作为分 子骨架进行类似物的筛选和构效关系研究,探明了其ATP-口袋为键合位点的作用机制,极大地丰富了这类化合物^[21]。

(olomoucine) 奥罗莫星 (1) 是第一个具有较高Cdk5抑制活性的嘌呤类似物,其以 6-二甲氨基嘌呤为先导化合物衍生而来,选择性地抑制Cdk2、Cdk5和MAPK。构效关系主要受C-2位、N-6位、N-8位影响较大。R₁为2-羟乙氨基活性最好,如化合物2和3分别被氯和氨基取代或者是无取代 活性都会下降。R₁位氨基侧链会与ATP键合口袋中的E81处羰基氧形成氢键; R₂以苄基取代时活性最高,若异戊基或无取代基时活性下降 (化合物4和5); R₃甲基取代时活性最优,羟烷基替代后活性显著下降,无取代基也导致活性下降 (6和7)^[22] (表 1)。

表 1

表 1 奥罗莫星衍生物构效关系 化合物 R1 R2 R3 IC50 /μmol·L-1 1 OHCH2CH2NH- Bn Me 3 2 Cl Bn Me 30 3 NH2 Bn Me >100 4 OHCH2CH2NH- i-Pentyl Me >100 5 OHCH2CH2NH- H Me >100 6 OHCH2CH2NH- Bn H 50 7 OHCH2CH2NH- Bn OHCH2CH2 30

表 1 奥罗莫星衍生物构效关系

Roscovitine也被称作seliciclib或CYC2O2,其与奥罗莫星都是腺嘌呤衍生物,通过相同的修饰位点C-2、N-6和N-8三处关键位置改造衍生而来。Roscovitine对晚期肺癌和鼻咽癌具有很 好的疗效,是第一个进入临床阶段的Cdks抑制剂,其抑制Cdk5的活性为0.16 μmol·L^-1,抑制能力是奥罗莫星的20倍左右^[23]。相比于奥罗莫星,roscovitine对激酶的选择性更高,不良反应更低。Roscovitine的N-6、N-7位共同与Cdks的Cys83的羰基和氨基形成氢键,是其保持活性的关键 (图 2),且R构型的活性高于S型。在R-roscovitine-Cdk5/p25复合物中,R型的手性C取代的羟乙基与Gln130的羰基氧形成氢键; 取代乙基与Ile10和Val18形成疏水作用。Gln130、Ile10和Val18都位于保守区; 手性C的C-N键与取代的两条C链形成的二面角为182°,这与roscovitine- Cdk5/p25晶体中相关氨基酸角度是相符的^[24]。

图 2

图 2 R-Roscovitine生物模拟结合位点

靛玉红 (9) 是一类双吲哚骨架化合物,提取自抗白血病中药当归芦荟丸^[25]。其选择性抑制Cdk5 (5.5 μmol·L^-1),还可抑制Cdk1和GSK-3。靛玉红刚性较强,水溶性和脂溶性均较 差,口服给药吸收差,容易引起腹痛等胃肠道刺激症状^[26]。近年来,许多靛玉红衍生物得到开发,如靛玉红-3'-肟 (10)、5-氯靛玉红 (11)、5-磺酸基靛玉红 (12) 等 (表 2)。靛玉红及其衍生物的双吲哚骨架在2,3位、2,2位、3,3位相连,对活性影响不大; N₁' 位脂肪链取代后,活性增强,但当碳链数大于4后,活性显著降低; 5位引入供电子基团氨基或乙酰氨基比吸电子基团活性高; 3' 位引入肟后,活性显著增强; N₁位甲基化后,活性消失^[27]。靛玉红类化合物通过竞争性拮抗ATP催化位点抑制Cdks活性。靛玉红-3肟的2位羰基和1' 位NH分别与Cys83形成氢键,1位氨基与Glu81形成氢键,3位羰基与Asp86以水分子作桥形成氢键^[28]。此类化合物选择性不高,毒性较强,目前主要在进一步探索构效关系,以期提高选择性,降低不良反应。

表 2

表 2 靛玉红衍生物构效关系 化合物 R1 R2 R3 R4 IC50/μmol·L-1 9 H H O H 5.5 10 H H =NOH H 0.1 11 H Cl O H 0.23 12 H SO3H O H 0.075 13 H H O Me 1.0 14 H H O n-Butyl 30

表 2 靛玉红衍生物构效关系

Aloisine是一类吡咯并吡嗪类Cdk5抑制剂,竞争性拮抗ATP键合口袋,抑制活性为0.2 μmol·L^-1[29]。Aloisine-a与Cdk5结晶复合物如下: Aloisine-a 4位和5位的N原子分别与Cdk5中的Cys83的N和O原子形成氢键; 1位的N原子与ATP催化口袋中与Leu133、Ala31和2分子水分子形成氢键网^[30]。Aloisine的主要构效关系 (图 3): 化合物中和Cdk5形成氢键的N原子被碳原子替换或是烷基化后,由于无法与Cdk5形成氢键,活性急剧下降; R₂用羟基、甲氧基和氯取代后,活性均提高,以羟基活性最高; R₁用短的脂肪链烷基取代后活性提高,大的基团引入后会降低活性 (表 3)。本类化合物抑制活性普遍不高,仍需进一步修饰改造,以期进入临床阶段^[31]。

图 3

图 3 Aloisine生物模拟结合位点

表 3

表 3 Aloisine衍生物的构效关系 化合物 R1 R2 IC50/μmol·L-1 15 H H 4 16 H H 70 17 H OCH3 3 18 H Cl 1 19 H OH 1 20 (CH2)2CH3 OH 1.2 21 Bn OH >100 22 (CH2)3CH3 OH 0.2

表 3 Aloisine衍生物的构效关系

第一代ATP竞争性抑制剂大多选择性差,对多种Cdks具有抑制作用,毒副作用较大。在其基础上优化衍生,得到了大量新颖甚至已进入临床的化合物,称作第二代ATP竞争性抑制剂。第二代ATP竞争性抑制剂对Cdk5选择性更高,对于其他Cdks家族成员活性降低,并进一步降低了不良反应。

第二代ATP抑制剂中,dinaciclib (26) 是临床上研究的最广泛的化合物。Dinaciclib亦称作MK-7965和SCH727965,由默克公司研发。Dinaciclib是吡唑并嘧啶类衍生物,兼具良好的生物活性和耐受性,针对难治性慢性淋巴细胞白血病治疗现已进入临床III期试验^[32]。

Dinaciclib抑制Cdk5活性为2 nmol·L^-1,与roscovitine相比活性更高,对于Cdks家族的选择性更强。Dinaciclib的开发是以化合物23为先导化合物,对关键位置3位和5位进行改造。在5位芳环用一系列的含氮脂杂环替换后,活性显著提升 (25)。先导化合物的3位为溴原子,不利于成药,将其用短的脂肪链替换后,尤其乙基替换后,活性得到提升 (26)。在A2780卵巢癌移植瘤模型中,考察这一系列化合物的最高耐受量和最低有效量,dinaciclib (26) 的二者比值最大 (表 4)。在体内dinaciclib可抑制凋零蛋白的

表 4 (Table 4)

表 4 Dinaciclib衍生物的构效关系 化合物 R1 R2 IC50/μmol·L-1 23 Br 0.03 24 Br 0.018 25 Br 0.001 26 CH2CH3 0.001

表 4 Dinaciclib衍生物的构效关系

转录,抑制人前列腺癌细胞和一些其他癌细胞的生长、迁移和集落的形成。Dinaciclib活性高、耐受性强、清除率高,是目前ATP竞争性Cdk5抑制剂中最有希望进入市场的药物^[33]。

AT7519是吡唑-3-羧基酰胺基类化合物,由Astax Therapeutics公司研发筛选得到^[34]。AT7519抑制Cdk5活性为47 nmol·L^-1,其与bortezomib联合用药治疗多发性骨髓瘤的再次发作进入临床II期。联合用药中,AT7519耐受性高,对超过三分之一的患者有治疗效果^[30]。AT7519是通过Cdk5为靶点进行片段筛选得到。化合物27的IC₅₀为0.85 μmol·L^-1,同时具有成为一个先导化合物的化学潜质。化合物27与Cdks复合物表明,乙酰氨基羰基氧与激酶的Asp145形成氢键,同时乙酰氨基和苯胺羰基形成分子内氢键,使整个分子恰好符合激酶狭窄的催化口袋。以化合物27为先导化合物继续优化,R₁甲基被取代,抑制活性得到提升 (28)。由蛋白-配体的晶体结构解析发现,苯环取代后,少量的氨基酸位置发生移动,允许芳香环嵌入,产生疏水作用力。在复合物中,苯环和酰胺之间的角度是51°,此时构象由于两者在不同的平面,能量较高,不是最优构象。推测使用取代苯环使苯环和酰胺在不同的平面上有可能使得活性提高。邻双氟取代苯环替换苯环后,活性提高45倍 (30)。化合物30具有良好的激酶活性和合适 的血浆消除率等药动学特性,但其在HCT结肠癌细胞中活性一般 (1.4 μmol·L^-1),推测是因为其具有分子内氢键的存在,造成细胞渗透性太差。这种高脂 溶性造成细胞活性的降低,对高脂性基团——对氟苯胺优化,用一系列的环烷烃取代更替。环丙烷取代对氟苯胺,激酶活性提升,但细胞活性较差 (31); 环己烷取代,细胞活性达到纳摩尔水平,但细胞清除率过高 (32); 化合物33哌啶取代后,具有高的激酶和细胞活性和合适的细胞清除率。继续优化,用邻双氯取代双氟取代 (34),活性进一步提升,得到最终产物AT7519^[35] (表 5)。

表 5

表 5 AT7519衍生物的构效关系 化合物 R1 R2 IC50/μmol·L-1 Cdk5 HCT116 27 Me 0.85 ND 28 0.09 3.4 29 0.14 3.9 30 0.003 1.4 31 0.025 2.1 32 0.012 0.55 33 0.14 0.31 34 0.047 0.082

表 5 AT7519衍生物的构效关系

以ATP口袋为锚点的抑制剂大多数都具有细胞毒性大和耐受性差等缺陷。Cdk5与Cdks家族其他成员,尤其是Cdk2同源性很高,ATP催化区域高度保 守相似,具有518个相同的基因组。因此,具有抑制Cdk5活性的抑制剂,一般兼具有抑制Cdk2的活性。

为了进一步提高Cdk5抑制剂的选择性和特异性,提出了新的构建Cdk5抑制剂的思路方法。通过干扰底物的识别、蛋白-蛋白相互作用、过度中间体以及改变构型等非ATP结合模式可以有效地提高选择性和特异性。Cdk5的非ATP竞争性抑制剂主要有两类,一类是多肽类似物,通过干扰Cdk5/p35/p25的相互作用达到抑制Cdk5的效果; 另一类是变构抑制剂。目前研究主要集中在Cdk5/p35/p25多肽抑制剂。

CIP是一段含有125个氨基酸残基的多肽,来自于Cdk5激活蛋白p35的多肽序列154～279,具有特异性抑制Cdk5活性(1 μmol·L^-1),是Cdk5的非ATP竞争性抑制剂^{[11, 35]}。在用Cdk5/p25转染的HEK293细胞中,与roscovitine相比,CIP特异性抑制Cdk5而不抑制Cdk2,而roscovitine则同时抑制Cdk5和 Cdk2。CIP与Cdk5激酶的亲和力大于Cdk5与激活蛋白p35和p25或者是其他多肽序列,但不具有激活能力。在HEK293细胞中,CIP与Cdk5/p25形成三元复合物,影响Cdk5与p25蛋白的相互作用,抑制Cdk5/p25的活性,同时,也可以抑制Cdk5/p25诱导的tau异常磷酸化。但CIP有125个氨基酸,分子太大,不利于成药^{[11, 36]}。

p5是一段含有23个氨基酸残基的多肽 链,来自于CIP肽链Lys245-Ala277。体外实验中,p5的抑制能力比CIP更高 (0.5 μmol·L^-1)。低剂量的p5就可以特异性抑制Cdk5/p25,但不会抑制内源性的Cdk5/p35,不会抑制Cdks家族其他成员。大量研 究^[37]表明,Cdk5表达失控,是由于p25的过分调控,与p35的调控无关。p5具有细胞毒性低,耐受性好,针对性调控Cdk5/p25的表达,不影响细胞正常功能增殖发育,是一个非常有前景的治疗Cdk5过表达的药物。

3α-Amino-5α-androstane (Cpd1) 是第一个拮抗Cdk5的小分子非ATP竞争抑制剂,抑制能力为6 μmol·L^-1。其通过酵母细胞的共振能量转移 (BRET) 方法筛选得到,干预Cdk5与p25相互作用,发挥其抑制活性。Cpd1对于稳定的Cdk5/p25二聚体抑制能力很差,只有在Cdk5未二聚之前,才能形成Cdk5-p25-Cpd1复合物,影响Cdk5/p25的表达。Cpd1通过与Cdk5 C端的Leu49键合,对Cdk5/p25蛋白-蛋白的相互作用影响非常大。同时Cpd1的氨基与Ser235和Tyr236形成氢键,进一步提高了其亲和力。如果Cpd1的氨基处于B位时,则无法形成氢键,造成活性消失。Cpd1通过Cdk5特有的蛋白靶点进行结合,通过非ATP催化口袋发挥作用,有效地避免了对Cdks家族其他成员的抑制作用,是非常有前景的一个先导化合物^{[38, 39]}。

Cdk5是Cdks家族中特殊的一员,其激活蛋白是p25或者p35,而不是细胞周期蛋白,但其激活模式是采用与细胞周期蛋白相同的折叠方式和键合方式。近年来,Cdk5在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要的角色,Cdk5正逐渐成为一个治疗肿瘤的热门靶点。

Cdk5的抑制剂主要根据其键合方式和位置划分为两类。第一类是ATP竞争性抑制剂,主要通过竞 争性抑制ATP与Cdk5的结合。这类药物研究最为 广泛和成熟,现已有几种药物进入临床研究阶段,如R-roscovitine、dinaciclib和AT7519等。但这类药物的选择性不强,不良反应较多,限制了其研究进度。针对选择性不强等缺点,非ATP竞争性抑制剂正在成为Cdk5抑制剂研究的热门区域,主要通过干涉Cdk5与激活蛋白p25相互作用,达到抑制Cdk5的效果。非ATP竞争性抑制剂主要是由多肽类和小分子两类构成,这类化合物有效地避免了选择性和特异性差的特点。伴随着生物技术及筛选手段快速发展,非ATP竞争性抑制剂正在逐步发展。

随着对Cdk5机制的进一步深入了解,以Cdk5为靶点的治疗将会为肿瘤治疗提供新的治疗机制和药物实体。