黄芩是唇形科植物黄芩 (Scutellaria baicalensis Georgi) 的干燥根,具有清热燥湿、泻火解毒、止血和安胎的功效。现代学者对其药理活性的研究主要集中在抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、抗氧化、清除自由基和对缺血再灌注损伤的保护作用^{[1, 2, 3]}等方面。近年来研究^{[4, 5]}表 明,黄芩水提物可以提高快速老化模型小鼠的胸腺指数,同时可升高小鼠体内抗氧化酶的活性,黄芩醇提物能改善老年痴呆小鼠体内的氧化损伤、神经炎症和记忆损伤,但黄芩对D-半乳糖致衰老大鼠模型的研究则未见报道。

衰老是机体组织、器官功能随年龄增长而发生的退行性变化^[6],是基因、环境和生活方式等多种因素共同作用的结果。随着年龄增长,一些疾病例如阿尔茨海默症^[7]、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病和癌症等发生的风险会明显增加。具有抗衰老活性的天然产物如 中药和植物药的应用日益广泛,这对于抗衰老知识的积累具有重要意义。

代谢组学是研究机体代谢产物谱变化的一种新的系统方法,可通过揭示新陈代谢动态进程中代谢产物的变化规律,全面理解病理变化过程及机体内物质的代谢途径。目前,基于核磁共振 (nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR) 的代谢组学技术已经成为一种强有力的工具,广泛应用于基础生物学、分子病理学、临床诊断、生物医药和环境科学等领域。由于衰老过程的复杂性,目前对于衰老的发生机制尚未完全清楚。近年来,包括代谢组学技术在内的高通量技术的应用,为衰老的病理生理学机制提供了新的解释,并且可以在不同物种中鉴定与衰老相关的特异标志物^{[8, 9]}。

D-半乳糖致衰老模型目前应用最多,该模型具有寿命缩短、学习记忆障碍、神经系统退行性改变、免疫力和繁殖力低下等多种衰老表 现^{[10, 11]},在多种器官组织形态及生理生化的许多指标上呈现出与自然衰老相似的改变,广泛用于衰老机制研究及抗氧化剂、延缓衰老药物的药效学评价。许多研究^{[12, 13]}表 明,D-半乳糖致衰老大鼠的自发行为 (旷场实验) 会减少,空间记忆能力也会有损伤 (水迷宫实验)。

本文拟采用D-半乳糖致衰老大鼠模型,通过行为学考察,验证黄芩的抗衰老作用,采用基于¹H NMR的代谢组学方法对大鼠尿液代谢物的变化进行测定分析,初步阐明黄芩延缓衰老的作用机制,为黄芩的开发利用提供一定的理论基础。

黄芩药材购自山西陵川县六泉中药材合作社,由山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为唇形科植物黄芩 (Scutellaria baicalensis Georgi) 的干燥根,样品保存于山西大学中医药现代研究中心。

SPF级雄性SD大鼠,体重 (180 ± 20) g,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物许可证号 SCXK (京) 2012-0001; 动物饲养室保持温度 (23 ± 1.5) ℃,相对湿度 (45 ± 15) %。动物适应1周后开始实验。

Bruker 600-MHz AVANCE III核磁共振检测仪 (德国布鲁克公司); Sartorius BSA124S 分析天平 (德国Sartorius公司); Morris水迷宫 (北京众实迪创公司)。HPLC分析用甲醇为色谱纯 (Fisher公司); D-半乳糖 (Amresco公司),三甲基硅烷丙酸钠盐 (TSP,Cambridge Isotope Laboratories Inc.,MA),NMR试剂重水 (Norell,Landisville,USA),娃哈哈纯净水。

取黄芩粉末20 g ,分别用10倍量的60% 乙醇和蒸馏水作溶剂回流提取2次,每次2 h,合并两次提取液,减压回收溶剂,冷冻干燥得粉末。分别取黄芩水提物和醇提物适量,按照药典方法测定黄芩苷的含量,以其含量的高低作为溶剂选择的依据。

雄性SD大鼠50只,随机分为空白 组,模型组,黄芩低、中、高剂量组,每组10只。模型组与黄芩低、中、高剂量组每天皮下注射D-半乳糖100 mg·kg⁻¹,连续10周,空白组注射等体积的生理盐水。黄芩低、中、高剂量组每天分别按剂量50、100和200 mg·kg⁻¹灌胃给药,空白组与模型组每天灌胃等体积的蒸馏水,连续10周。

旷场实验 旷场实验于造模第10周进行,参照文献[14],将大鼠放入自制旷场行为测试箱的中心位置,适应2 min后,观察4 min内大鼠的直立次数、静止时间和穿越格数。

Morris水迷宫实验 旷场实验结束后,开始Morris水迷宫实验。采用MT-200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统进行测试,实验器材由圆形水池和自动录像分析系统两部分组成。圆形水池由不锈钢制成,直径120 cm,高50 cm。水池被等分为4个象限: SW、NW、SE、NE,水深30 cm,平台位于任一象限的中间,且表 面低于水面l～2 cm。水温保持在25 ℃左右。池上方的摄像机同步记录大鼠的运动轨迹。经软件分析 处理,得到实验数据。水迷宫实验环境要求安静,避免一切外界干扰,保持房间安静,温度适宜,光线柔和,实验期间迷宫外的参照物始终保持不变以供大鼠定位。

实验程序参照 Morris^[15]等的方法进行,测试包括: ① 定位航行实验,用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力,即记录其潜伏期。历时5天,训练时随机选择一个象限将大鼠面向池壁放入水中,迫使大鼠学习寻找设于水面以下的平台。电脑中记 录60 s内寻找平台所需时间即潜伏期。如果60 s内未能找到平台,可将其引导至平台并在平台停留20 s,潜伏期记录为60 s。每天训练4次,每次训练间隔 10 min。系统自动记录多项参数; ② 空间探索实验,用于测量大鼠学会寻找平台后,对平台空间位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后撤去平台,将大鼠面向池壁任选一个入水点放入水中,可以记录60 s内穿越原平台位置的次数及在目标象限的活动路程和活动时间并进行比较分析。数据收集和处理由Morris水迷宫系统软件完成。

尿样采集与储存: 所有大鼠于第10周末晚上18:00至第二天早上8:00放入代谢笼,冰上收集尿液,12 000 r·min⁻¹离心,取上清液,于 −80 ℃储存。

样品前处理: 解冻样品,摇匀,在4 ℃下12 000 r·min⁻¹离心10 min,取尿液0.4 mL,置于核磁管,加PBS (pH 7.0) 0.2 mL,再加入D₂O 0.1 mL,放置10 min,进行核磁测定。

样品于600 MHz NMR (25 ℃) 仪上测定,采用NOE-2D Spectroscopy (NOSEY) 脉冲序列。测定频率为600.13 MHz,扫描次数为64,谱宽12 345.7 Hz,脉冲时间14 s,采样时间2.654 s,延迟时间1.0 s,采样数据点65 536,FID分辨率0.188 Hz,采样间隔40.5 s,内标为TSP。

¹H NMR谱图 数据处理与分析 核磁图 谱采用MestReNova (version 8.0.1,Mestrelab Research,Santiago de Compostella,西班牙) 进行处理。所有光谱进行手动相位、基线调整。图 谱中,以TSP的化学位移δ 0.00为标准进行定标,以δ 0.04对化学位移区间δ 0.00～9.40进行分段积分,其中δ 4.60～5.00 (残余水峰,尿素峰) 不进行积分,并将积分数据进行归一化,导入Excel软件中进行下一步多元统计分析。将上述处理的积分数据导入SIMCA-P 13.0 (Umetrics,Sweden) 软件中进行主成分分析 (principal component analysis,PCA),再用偏最小二乘法判别分析 (partial least squares discriminant analysis,PLS-DA) 和正交偏最小二乘法判别分析 (Orthogonal PLS-DA,OPLS-DA) 找出样品间差异代谢产物。

数据采用SPSS 17.0软件处理,以x±s表 示,采用单因素方差分析及t检验对行为学 指标及差异代谢产物进行统计学分析和比较,以P < 0.05,P < 0.01为差异具有显著性。

黄芩提取方法考察结果见表 1,由表 1可知,黄芩醇提物中黄芩苷的含量高于黄芩水提物,故选择60%乙醇为提取溶剂。

表 1(Table 1)

Table 1 1H NMR assignments of major metabolites from rat urine. TMA: Trimethylamine No. Metabolite Moiety δ 1H/(multiplicity) 1 Pantothenate CH3, CH3 0.94 (s), 0.90 (s) 2 Β-Hydroxyisovalerate CH3 1.21 (s) 3 Β-Hydroxybutyrate CH3 1.24 (d) (J = 6.6) 4 Lactate βCH3 1.33 (d) (J = 7.2) 5 Alanine βCH3 1.48 (d) (J = 7.2) 6 Acetate CH3 1.92 (s) 7 Pyruvate CH3 2.37 (s) 8 Succinate CH2 2.41 (s) 9 α-Ketoglutarate αCH2, βCH2 2.44 (t), 3.01 (t) 10 Citrate half CH2, half CH2 2.54 (d), 2.70 (d) 11 Methylamine CH3 2.61 (s) 12 Dimethylamine CH3 2.73 (s) 13 TMA CH3 2.88 (s) 14 Dimethylglycine N-CH3 2.92 (s) 15 Creatinine CH3, CH2 3.04 (s), 4.06 (s) 16 Taurine N-CH2 3.42 (t) 17 Betaine N(CH3)3 3.27 (s) 18 Guanidinoacetate CH2 3.80 (s) 19 Malate CH 4.31 (dd) 20 N-Methylnicotinate N-CH3 4.44 (s) 21 1-Methylnicotinamide CH3 4.48 (s) 22 Allantoin CH 5.38 (s) 23 Hippurate CH, CH, CH 7.56 (t), 7.49 (t), 7.87 (d) 24 Trigonelline 1-CH 9.13 (s) 25 N-Methylnicotinamide 2-CH, 4-CH 9.29 (s), 8.97 (d)

Table 1 1H NMR assignments of major metabolites from rat urine. TMA: Trimethylamine

造模10周后,大鼠出现毛色枯槁无光泽、皮肤弹性差、精神萎靡、倦怠嗜睡、进食明显减少、形体瘦弱、行动迟缓等衰老体征。

旷场反映了大鼠在新环境中的探索能力和自主行为以及紧张恐惧状态^{[16, 17]}。与空白组相比,模型组大鼠穿越格数和直立次数明显偏少 (P < 0.05),表 明D-半乳糖致衰老大鼠的运动能力和探索能力下降,模型复制成功。连续给予黄芩干预后,与模型组相比,黄芩中、高剂量组大鼠的穿越格数与直立次数明显增强 (P < 0.05),表 明黄芩能明显改善衰老大鼠的自发行为。

水迷宫实验主要通过定位航行和空间探索两部分实验考察大鼠的空间学习记忆能力^{[18, 19]}。图 1A反映了定位航行实验第1～5天各组大鼠的潜伏期变化,从实验第3天开始,模型组与正常对照组比较显示,潜伏期明显延长(P < 0.05),黄芩各剂量治疗组潜伏期较模型组缩短,其差异均具有统计学意义 (P < 0.05)。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Effects of Scutellaria baicalensis Georgi ethanol extract (SBG) on the spatial learning and memory of rats in the Morris water maze test. Mean latency in the hidden platform test during five consecutive days of training (A). The number of crossings over the exact location of the former platform on probe test (B), the swimming distance in the target quadrant on probe test (C), the time spent in the target quadrant on probe test (D). n = 10, x±s. P < 0.05, **P < 0.01 vs model group

对空间探索实验中大鼠穿越站台的次数 (图 1B),目标象限内的活动距离 (图 1C) 和活动时间 (图 1D) 进行了分析。模型组与空白组相比,穿越站台次数与目标象限活动路程都明显缩短 (P < 0.05),表 明造模成功。黄芩各剂量组的穿越站台次数与模型组相比 都明显增加 (P < 0.05),对于目标象限活动路程,黄芩中、高剂量组与模型组相比均显著增加,其中黄芩中剂量组与模型组有极显著差异 (P < 0.01)。模型组与空白组及各给药组相比,目标象限内的活动时间无显著性差异,但有降低的趋势。

参照文献报道、结合公共数据库HMDB (http://www.hmdb.ca/)、BMRB (http:// www.bmrb.wisc.edu/),对图 谱中的主要化合物进行归属,结果在大鼠尿液共指认出25种内源性代谢产物,包括氨基酸、脂质以及有机酸等,如表 2所示。代谢产物化学信号归属如图 2所示。

表 2(Table 2)

Table 2 1H NMR assignments of major metabolites from rat urine. TMA: Trimethylamine No. Metabolite Moiety δ 1H/(multiplicity) 1 Pantothenate CH3, CH3 0.94 (s), 0.90 (s) 2 Β-Hydroxyisovalerate CH3 1.21 (s) 3 Β-Hydroxybutyrate CH3 1.24 (d) (J = 6.6) 4 Lactate βCH3 1.33 (d) (J = 7.2) 5 Alanine βCH3 1.48 (d) (J = 7.2) 6 Acetate CH3 1.92 (s) 7 Pyruvate CH3 2.37 (s) 8 Succinate CH2 2.41 (s) 9 α-Ketoglutarate αCH2, βCH2 2.44 (t), 3.01 (t) 10 Citrate half CH2, half CH2 2.54 (d), 2.70 (d) 11 Methylamine CH3 2.61 (s) 12 Dimethylamine CH3 2.73 (s) 13 TMA CH3 2.88 (s) 14 Dimethylglycine N-CH3 2.92 (s) 15 Creatinine CH3, CH2 3.04 (s), 4.06 (s) 16 Taurine N-CH2 3.42 (t) 17 Betaine N(CH3)3 3.27 (s) 18 Guanidinoacetate CH2 3.80 (s) 19 Malate CH 4.31 (dd) 20 N-Methylnicotinate N-CH3 4.44 (s) 21 1-Methylnicotinamide CH3 4.48 (s) 22 Allantoin CH 5.38 (s) 23 Hippurate CH, CH, CH 7.56 (t), 7.49 (t), 7.87 (d) 24 Trigonelline 1-CH 9.13 (s) 25 N-Methylnicotinamide 2-CH, 4-CH 9.29 (s), 8.97 (d)

Table 2 1H NMR assignments of major metabolites from rat urine. TMA: Trimethylamine

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Typical 1H NMR spectrum of control rat urine

为了分析各组间代谢产物的差异,对实验所得的复杂数据通过降维处理进行多元统计分析。首先应用PCA分别对模型组与空白组、黄芩 (低、中、高剂量) 组进行单独分析,结果如图 3所示。由图 3可知,模型组与空白组明显分开,说明造模成功。模型组与黄芩低剂量组有部分重叠,而黄芩中、高剂量组与模型组明显区分,说明黄芩中、高剂量比黄芩低剂量对D-半乳糖致衰老大鼠代谢轮廓的影响更明显。PCA作为无监督的分析方法,只反映了数据的原始状态,但在实验过程中,环境、饮食等因素,以及实验的一些系统误差都会影响实验结果。为了过滤与实验目的不相关因素所引起的代谢变化,获得更为准确的结果,本研究采用有监督的PLS-DA分析和OPLS-DA分析对数据进行进一步处理。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 PCA scores plot (A) of control group () and model group (), PCA scores plot (B) of model group and SBG (50 mg·kg−1) group (), PCA scores plot (C) of model group and SBG (100 mg·kg−1) group (), PCA scores plot (D) of model group and SBG (200 mg·kg−1) group ()

应用PLS-DA方法对所有尿液样本数据矩阵进行统计分析,结果如图 4A所示,模型组与空白组明显区分,黄芩低剂量组与模型组有部分重叠,黄芩中、高剂量组均与模型组明显区分,但黄芩中剂量组内差异较大,黄芩高剂量组与空白组更为接近。外部模型验证方法 (排列实验) 常用于模型有效性判定。由图 4B可见,两条回归线斜率较大,左端任何一次随机排列产生的R²和Q²均小于右端,且最右端的两个值差距较小,说明原始模型的预测能力大于任何一次随机排列y变量的预测能力,证明模型有效,可进一步分析。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 PLS-DA (A) and corresponding validation plot (B) derived from 1H NMR spectra of urine from rats in contonl group (), model group (), SBG (50 mg·kg−1) group (), SBG (100 mg·kg−1) group () and SBG (200 mg·kg−1) group (). OPLS scores plot (C) and corresponding S-plot (D) of the control group and model group

为了能最大程度确定造模前后大鼠尿液中内 源性代谢产物发生的差异,采用OPLS-DA分析对模型组与空白组分析,得到OPLS-DA得分图 (4C) 和S-plot图 (4D)。通过S-plot结合VIP 值 ( > 1) 寻找差异代谢物,并对这些代谢物所属的相对峰面积进行独立t检验,从而得到8个峰面积具有显著性差异的潜在生物标志物。与空白组比较,模型组大鼠尿液中乳酸、三甲胺、泛酸、丙酮酸、β-羟基丁酸和β-羟基异戊酸升高,而柠檬酸和α-酮戊二酸下降。给予黄芩干预后,黄芩低、中、高剂量组大鼠尿液中丙酮酸、柠檬酸、三甲胺、β-羟基丁酸、乳酸和泛酸等6种潜在的生物标志物均得到了不同程度的回调,黄芩中剂量组对柠檬酸、乳酸和β-羟基丁酸等生物标志物的回调程度低于黄芩低剂量组,可能与黄芩中剂量组的组内差异大有关,黄芩高剂量组干预后,生物标志物的水平更接近正常组,结果如图 5所示。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 The relative peak area of potential biomarkers in urine of rats. *P < 0.05, **P < 0.01 vs model group

本研究复制了衰老模型,使大鼠明显出现了以学习记忆能力下降为主要表 现的认知功能障碍。

尿液是机体整体代谢终产物输出的主要途径之一,尿液中代谢物的变化不仅能够反映机体整体代谢的特征,还可能是局部组织或器官功能异常的外在表 现。本研究采用¹H NMR分析手段检测出20多种尿液中代谢产物,主要包括脂肪酸类、氨基酸类和有机酸类等代谢产物。

本研究进行组间两两比较发现,柠檬酸、乳酸、泛酸、三甲胺、α-酮戊二酸、丙酮酸、β-羟基异戊酸和β-羟基丁酸受D-半乳糖影响较大,可能为D-半乳糖致衰老模型的潜在生物标志物。给予黄芩干预后,柠檬酸、乳酸、泛酸、丙酮酸、三甲胺和β-羟基丁酸有不同程度的回调,其中以黄芩高剂量效果最为显著。

通过对潜在生物标志物分析,发现黄芩延缓衰老主要涉及两条代谢路径: 三羧酸 (TCA) 循环和丙酮酸代谢。TCA循环产生的ATP是组织细胞能利用的主要能源来源,在这一过程中产生的ATP都是经由呼吸链产生的,模型组中TCA循环的中间体柠檬酸和α-酮戊二酸均降低,说明机体衰老也使得TCA能量代谢水平降低,其中间代谢物水平也相应降低。研究 ^{[20, 21, 22, 23]}表 明,如果与能量代谢相关的基因下调会造成能量产生减少,损伤ATP依赖的下游过程,如突触结构和功能的完整,泛素依赖的蛋白降解途径,而这两者都在阿尔茨海默症 (AD) 中受影响。

丙酮酸是体内产生的三碳酮酸,在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用^[24]。丙酮酸的变化对于评价体内炎症发生有重要的作用。在炎症 时,即使有氧条件下机体优先进行丙酮酸转化为乳酸的代谢,这种现象被称为有氧糖酵解或Warburg效应^[25]。丙酮酸的变化与糖酵解及TCA循环等密切相关。D-半乳糖刺激时,丙酮酸明显增加,其原因是糖酵解和TCA循环发生障碍。黄芩可以降低尿液中丙酮酸的含量,使糖酵解和TCA循环代谢恢复。

丙酮酸代谢和TCA循环都发生在线粒体内,这就提示黄芩可能通过代谢路径的调节促进线粒体呼吸,保护线粒体功能,最终与延缓衰老有关。线粒体广泛分布于各种真核细胞内,是进行氧化代谢的部位,是糖类、脂肪和氨基酸代谢释放能量的场所。除为细胞活动提供能量外,线粒体还参与一些重要代谢通路,参与细胞凋亡、信号转导调控等生化功能,大量实验研究表 明线粒体在衰老进程中发挥着至关重要的作用。

与空白组相比,模型组中乳酸含量升高。在认知严重损伤的犬和早发性AD患者中也出现类似的结果,乳酸含量是正常组的4倍^[26]。乳酸水平的升高不仅说明糖异生、碳水化合物和能量代谢发生变化,还说明脑中糖代谢损伤,这是造成认知损伤的一部分原因。此结果与行为学结果吻合。

三甲胺是由胆碱和肉碱在肠道细菌酶作用下的降解产物,肠道菌群代谢的改变与衰老相关的疾病有关^{[27, 28, 29]}。模型组三甲胺含量升高,表 明随着年龄的增长,肠道菌群代谢会发生紊乱。而黄芩高剂量可以降低三甲胺含量,说明黄芩发挥抗衰老作用与调节肠道菌群的正常代谢有关。

本研究结果表 明,黄芩对衰老大鼠的记忆损伤及自发行为的下降均有改善,黄芩延缓衰老的作用机制可能与调节能量代谢、糖代谢和肠菌代谢等代谢途径有关。