药学学报  2015, Vol. 50 Issue (12): 1545-1550   PDF    
引用本文
WANG Li-li, CHEN Qing, ZHOU Li-na, GUO Ying. Study of gonadal hormone drugs in blocking filovirus entry of cells in vitro[J]. Acta Pharm Sin, 2015, 50(12): 1545-1550.  
王丽丽, 陈勍, 周丽娜, 郭颖. 性激素类药物阻断丝状病毒进入宿主细胞的活性研究[J]. 药学学报, 2015, 50(12): 1545-1550.  
性激素类药物阻断丝状病毒进入宿主细胞的活性研究
王丽丽1, 陈勍1, 周丽娜2, 郭颖1     
1. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室, 北京 100050;
2. 第三军医大学西南医院内分泌科, 重庆 400038
收稿日期: 2015-05-15; 修回日期: 2015-07-01.
基金项目: 国家科技重大专项"重大新药创制"项目(2015ZX09102-023-004);传染病"十二五"重大专项资助项目(2013ZX10004-601).
* 通讯作者: Tel/Fax: 86-10-63161716,yingguo6@imm.ac.cn
摘要: 本研究应用丝状假病毒模型筛选了1600个已上市药物,旨在发现具有阻断丝状病毒感染活性的药物。首先应用扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白(Zaire Ebola virus glycoprotein, ZEBOV-GP)包装HIV-1核心的假病毒(ZEBOV-GP/HIV)感染细胞,并在感染前加入受试药物,通过检测被感染细胞中报告基因表达水平评价病毒的感染程度。研究发现, 12个性激素类药物可抑制ZEBOV-GP/HIV感染,其中IC50< 1μmol·L-1的药物有3个,分别是枸橼酸托瑞米芬(IC50:0.19±0.02μmol·L-1)、枸橼酸他莫昔芬(IC50:0.32±0.01μmol·L-1)和枸橼酸克罗米芬(IC50:0.53±0.02μmol·L-1)。IC50介于1~10μmol·L-1的药物有7个,分别是雌二醇苯甲酸酯(IC50:1.83±5.69μmol·L-1)、盐酸雷洛昔芬(IC50:3.48±0.07μmol·L-1)、马烯雌酮(IC50:4.00±9.94μmol·L-1)、雌二醇(IC50:5.26±9.92μmol·L-1)、炔雌醚(IC50:6.36±5.37μmol·L-1)、雌激素酮(IC50:6.87±0.03μmol·L-1)及非那雄胺(IC50:9.94±0.45μmol·L-1)。此外,己烷雌酚(IC50:14.20±0.55μmol·L-1)和醋酸氯地孕酮(IC50:24.60±0.36μmol·L-1)也有弱活性。其中枸橼酸托瑞米芬、枸橼酸他莫昔芬、枸橼酸克罗米芬、盐酸雷洛昔芬及炔雌醚对丝状假病毒苏丹型埃博拉病毒(SEBOV-GP/HIV)和马尔堡病毒(MARV-GP/HIV)也有抑制作用。
关键词: 丝状病毒     糖蛋白     假病毒     侵入抑制     性激素类药物    
Study of gonadal hormone drugs in blocking filovirus entry of cells in vitro
WANG Li-li1, CHEN Qing1, ZHOU Li-na2, GUO Ying1     
1. Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Materia Medica, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China;
2. Department of Endocrinology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract: This study was designed to discover filovirus entry inhibitors in a drug library of commercial medicines. One thousand and six hundred drugs were screened using the ZEBOV-GP/HIV model, a pseudovirus formed by an HIV-core packed with the Zaire Ebola virus glycoprotein. We identified 12 gonadal hormone drugs with inhibitory activities in ZEBOV-GP/HIV entry at final concentration of 10μmol·L-1. Among them, three drugs exhibited strong activities with IC50< 1μmol·L-1, such as toremifene citrate(IC50:0.19±0.02μmol·L-1), tamoxifen citrate(IC50:0.32±0.01μmol·L-1) and clomiphene citrate(IC50:0.53±0.02μmol·L-1); seven drugs had moderate activities with IC50 between 1 and 10μmol·L-1, such as estradiol benzoate(IC50:1.83±5.69μmol·L-1), raloxifene hydrochloride(IC50:3.48±0.07μmol·L-1), equilin(IC50:4.00±9.94μmol·L-1), estradiol(IC50:5.26±9.92μmol·L-1), quinestrol(IC50:6.36±5.37μmol·L-1), estrone(IC50:6.87±0.03μmol·L-1) and finasteride(IC50:9.94±0.45μmol·L-1); two drugs, hexestrol(IC50:14.20±0.55μmol·L-1) and chlormadinone acetate(IC50:24.60±0.36μmol·L-1), had weak activities against ZEBOV. Further, toremifene citrate, tamoxifen citrate, clomiphene citrate, raloxifene hydrochloride and quinestrol could block both pseudovirus type Sudan ebola virus(SEBOV-GP/HIV) and Marburg virus(MARV-GP/HIV) entries.
Key words: filoviruses     glycoprotein     pseudovirus     entry inhibitory     gonadal hormone drug    


丝状病毒 (filoviruses) 包括埃博拉病毒 (Ebola virus,EBOV) 和马尔堡病毒 (marburg virus,MARV),可感染人类和部分灵长类动物并引起埃博拉出血热 (Ebola hemorrhagic fever,EHF) 和马尔堡出血热 (marburg hemorrhagic fever,MHF)[1],EHF是致命性最强的病毒性出血热,致死率高达40%～90%[2],MHF的致死率可达20%～90%[3]。2014年2月爆发于西非的埃博拉疫情是自1976年该病毒被发现以来规模最大的疫情,截止2015年4月8日,在几内亚、利比里亚和塞拉利昂等国家累计出现埃博拉确诊、疑似和可能感染病例25 551例,其中10 588例死亡[4],然而到目前为止,尚无针对埃博拉病毒的治疗药物或疫苗上市。

丝状病毒是单股负链RNA病毒,基因长度为 19 kb[1]。埃博拉病毒分为5型,其中扎伊尔型 (Zaire) 和苏丹型 (Sudan) 致病能力最强[2],2014年爆发的埃博拉疫情也是由扎伊尔型埃博拉病毒 (Zaire Ebola virus,ZEBOV) 引起的。

针对丝状病毒感染后高致死性和治疗药物缺乏的现状,在短时间内研制治疗药物成为当务之急。已上市药物的安全性、作用机制和不良反应均已明确,且生产工艺成熟,因此以上市药物为物质基础的药物研发有可能实现在短期内找到可用于临床的抗丝状病毒药物,且研发成本较从全新化合物研发大幅度降低。

丝状病毒表面包膜糖蛋白 (glycoprotein,GP) 是此类病毒进入细胞的唯一作用蛋白[5, 6]。本研究采用此糖蛋白 (扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白,ZEBOV-GP; 苏丹型埃博拉病毒糖蛋白,SEBOV-GP; 马尔堡病毒糖蛋白,MARV-GP) 包裹HIV-1核心的假病毒模型 (ZEBOV-GP/HIV、SEBOV-GP/HIV或MARV-GP/HIV),评价包括1 600个上市药物的成药库,结果发现部分性激素类药物可阻断丝状病毒糖蛋白介导的病毒侵入。

材料与方法 药物和试剂

药物库Pharmakon 1600购自美国Microsource Discovery System Inc。依法韦仑 (EFV) 购自上海百世凯化学科技有限公司。二甲基亚砜 (DMSO) 购自美国Sigma公司。细胞培养基 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)、0.25%胰酶-EDTA、1×PBS磷酸盐缓冲液和青链霉素购自美国Life Technologies公司。细胞裂解液、Luciferase试剂盒购自美国Promega公司。jetPEI转染试剂购自美国Polyplus公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

质粒

HIV-1核心基因 (pNL4-3.Luc.R-E-) 由美国国立卫生院 (NIH) AIDS Research and Reagent Program惠赠。编码水泡性口膜炎病毒 (vesicular stomatitis virus,VSV) 包膜糖蛋白 (VSV-G) 表达质粒由美国伊利诺伊大学Lijun Rong教授惠赠。编码扎伊尔型埃博拉病毒Mayinga株 (GeneBank Accession No. L11365) 包膜糖蛋白 (ZEBOV-GP) 表达质粒、编码苏丹型埃博拉病毒Boniface株(GeneBank Accession No. FJ968794.1) 包膜糖蛋白(SEBOV-GP) 表达质粒、编码马尔堡病毒Musoke株 (GeneBank Accession No. NC_001608.3) 包膜糖蛋白 (MARV- GP) 表达质粒由本实验室构建保存。

细胞株培养

人肾上皮细胞系293T细胞购自ATCC。细胞置于含5% CO2的37 ℃培养箱中,用含10% 胎牛血清及100 u·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素的DMEM培养。

假病毒的制备[7, 8, 9]

转染前24 h,按细胞数2.2×106个将293T细胞接种到100 mm培养皿中,转染前1 h更换新鲜培养基。按照PolyPlus公司jetPEI转染试剂操作步骤,将6 μg HIV-1质粒 (pNL4-3.Luc.R-E-) 和3 μg ZEBOV-GP质粒 (或3 μg SEBOV-GP质粒或 3 μg MARV-GP质粒或3 μg VSV-G质粒) 共转染 至293T细胞中,转染后12 h更换新鲜培养基,继续培养36 h,相应包膜糖蛋白GP与HIV-1核心组装成假病毒颗粒ZEBOV-GP/HIV (或SEBOV-GP/HIV或MARV-GP/HIV或VSVG/HIV) 并存在细胞液中,收集上清液并经0.45 μm的滤膜过滤,分装并储存于 -80 ℃超低温冰箱中保存备用。

假病毒的HIV-1p24抗原测定[8, 9]

将假病毒原液进行倍比稀释,各取450 µL,用裂解液50 µL进行裂解,按照p24抗原ELISA试剂盒说明书测定并计算假病毒原液的p24抗原浓度。

待测药物抗丝状病毒活性检测[8, 9]

感染病毒前24 h,按每孔1.4×104～1.6×104个细胞将293T细胞 接种到48孔板中,感染前15 min按每孔0.5 μL加入待测药物,以DMSO为溶剂对照,加入病毒稀释液0.25 mL,培养48 h。用荧光倒置显微镜观察细胞的形态和密度,然后去除上清液,按每孔35 μL加入细胞裂解液裂解30 min,取裂解产物30 μL加入至 30 μL荧光素酶底物中,用FB12化学发光仪测定荧光素酶信号值。通过检测报告基因荧光素酶活性即可反映假病毒感染细胞水平。对于明显抑制丝状病毒感染的药物,进一步检测其半数抑制浓度 (IC50)。

MTS检测细胞增殖率[10]

按细胞数每孔8 000～10 000个将293T细胞接种至96孔板中,培养24 h后加入待测药物,以DMSO为溶剂对照。继续培养44 h后,按每孔20 μL加入MTS/PMS工作液 (MTS与PMS的比例为20∶1),继续培养4 h后用酶标仪 测定A490和A650处光吸收值,计算细胞的存活率,细胞存活率 (%) = (A490待测药物 - A650待测药物) / (A490溶剂对照组 - A650溶剂对照组) × 100。

统计学分析

实验数据由Excel统计软件分析,抑制率/浓度数据作散点图并用指数非线性拟合得到作用曲线,根据公式计算药物半数抑制浓度IC50值,同一实验重复4次,实验结果用均值 ± 标准差 (x± s) 表示。

结果 1 12个性激素类药物可抑制ZEBOV糖蛋白介导的病毒侵入

通过检测HIV-1的p24抗原在假病毒颗粒中的浓度可判断假病毒是否成功包装[8, 9]。经测定,扎伊尔型埃博拉假病毒颗粒p24抗原浓度为5.5 ng∙mL-1,说明此假病毒颗粒具有较高感染能力,将病毒原液稀释至0.5 ng∙mL-1作为感染剂量进行化合物的筛选评价。

应用ZEBOV-GP/HIV假病毒模型体外细胞水平实验对待测药物抗埃博拉病毒活性进行评价 (药物终浓度为10 μmol·L-1),结果显示,药物库32个性激素类药物 (表 1) 中的12个药物 (图 1) 对ZEBOV- GP/HIV的抑制率高于50% (表 1),其中枸橼酸托瑞米芬 (toremifene citrate)、枸橼酸他莫昔芬 (tamoxifen citrate)、枸橼酸克罗米芬 (clomiphene citrate) 及盐酸雷洛昔芬 (raloxifene hydrochloride) 对ZEBOV的抑制率高于95%; 雌激素酮 (estrone)、马烯雌酮 (equilin) 对ZEBOV的抑制率高于80%; 雌二醇苯甲酸酯 (estradiol benzoate)、炔雌醚 (quinestrol)、非那雄胺(finasteride)、醋酸氯地孕酮 (chlormadinone acetate)、己烷雌酚 (hexestrol) 以及雌二醇 (estradiol) 对ZEBOV的抑制率介于50%～80% 之间。上述12个 药物对假病毒VSVG/HIV的抑制率均小于50%,据此认为这12个药物是扎伊尔型埃博拉病毒进入抑 制剂。

Table 1 Effects of 32 gonadal hormone drugs on pseudovirus with an HIV-core packed by Zaire Ebola virus glycoprotein (ZEBOV-GP/HIV) and pseudovirus with an HIV-core packed by Vesicular Stomatitis virus glycoprotein (VSVG/HIV) at final concentration of 10 μmol·L-1 in vitro. ND: Not detected. n = 4,x± s

Figure 1 Structures of 12 gonadal hormone drugs with anti-ZEBOV-GP/HIV entry activities

进一步检测上述12个性激素类药物抗ZEBOV活性,测定其IC50,结果发现 (图 1),12个药物中IC50 < 1 μmol·L-1的药物有3个,分别是枸橼酸托瑞米芬 (IC50: 0.19 ± 0.02 μmol·L-1),枸橼酸他莫昔芬 (IC50:0.32 ± 0.01 μmol·L-1) 及枸橼酸克罗米芬 (IC50: 0.53 ±0.02 μmol·L-1)。1 μmol·L-1 <IC50 < 10 μmol·L-1的 药物有7个,分别是: 雌二醇苯甲酸酯 (IC50: 1.83± 5.69 μmol·L-1)、盐酸雷洛昔芬 (IC50: 3.48 ± 0.07 μmol·L-1)、马烯雌酮 (IC50: 4.00± 9.94 μmol·L-1)、雌二醇 (IC50: 5.26 ± 9.92 μmol·L-1)、炔雌醚 (IC50: 6.36 ± 5.37 μmol·L-1)、雌激素酮 (IC50: 6.87 ± 0.03 μmol·L-1) 及非那雄胺 (IC50: 9.94 ± 0.45 μmol·L-1)。IC50 > 10 μmol·L-1的药物有2个,分别是: 己烷雌酚 (IC50: 14.20± 0.55 μmol·L-1)、醋酸氯地孕酮 (IC50: 24.60 ± 0.36 μmol·L-1)。上述药物在终浓度100 μmol·L-1时对细胞增殖均无明显影响 (结果略)。

2 5个性激素类药物可抑制丝状病毒糖蛋白介导的病毒侵入

SEBOV和MARV同属丝状病毒,并均具有高致病性[11],进一步检测对ZEBOV有抑制活性的12个性激素类药物对SEBOV-GP/HIV和MARV-GP/HIV假病毒的作用,结果发现: 12个药物中有7个对SEBOV有明显抑制作用 (表 2),其中1个药物的IC50 < 1 μmol·L-1,为枸橼酸他莫昔芬 (IC50: 0.77± 0.00 μmol·L-1),6个药物的IC50介于1～10 μmol·L-1,分别是: 枸橼酸托瑞米芬 (IC50: 1.81 ± 0.63 μmol·L-1)、枸橼酸克罗米芬 (IC50: 1.67 ± 0.00 μmol·L-1)、雌二醇苯甲酸酯 (IC50: 5.76 ± 3.37 μmol·L-1)、盐酸雷洛昔芬 (IC50:6.85 ± 0.91 μmol·L-1)、炔雌醚 (IC50:3.91 ± 1.96 μmol·L-1) 及醋酸氯地孕酮 (IC50: 9.28 ± 2.81 μmol·L-1); 对于MARV,有5个药物的IC50均介于1～10 μmol·L-1 (表 2),分别是: 枸橼酸托瑞米芬 (IC50: 8.70 ± 2.71 μmol·L-1)、枸橼酸他莫昔芬 (IC50: 2.40 ± 0.01 μmol·L-1)、枸橼酸克罗米芬 (IC50: 2.14 ± 0.17 μmol·L-1)、盐酸雷洛昔芬 (IC50: 3.40 ± 1.50 μmol·L-1) 和炔雌醚 (IC50:4.91 ± 6.00 μmol·L-1)。

Table 2 The anti-pseudovirus with an HIV-core packed by Sudan Ebola virus glycoprotein (anti-SEBOV-GP/HIV) and anti- pseudovirus with an HIV-core packed by Marburg virus glycoprotein (anti-MARV-GP/HIV) activities of 7 gonadal hormone drugs in vitro. NA: Non active. n = 4,x± s

由于SEBOV-GP/HIV和MARV-GP/HIV假病毒筛选模型都作用在病毒进入细胞环节,因此推测这5个药物是丝状病毒进入抑制剂,具有广谱阻断丝状病毒侵入的活性。

讨论

本研究筛选的药物库中共有32个性激素类药物,其中雌性激素药物24个,雄性激素药物8个。本研究所发现的具有抗ZEBOV活性的12个药物中,有11个是雌激素受体调节剂,只有非那雄胺是雄性激素药物。雌性激素药物中除雌二醇、雌激素酮及雌三醇为内源性激素外[12, 13],其余均是人工合成的药物。以上市药物为物质基础发现抗丝状病毒感染候选药物的方法已被广泛认可并应用[3, 14, 15],其中有研究发现克罗米芬和托瑞米芬具有抗EBOV活性,并且其活性已在体内实验中得到证实[3]。机制研究发现克罗米芬和托瑞米芬是EBOV进入抑制剂,并且是通过非雌激素受体通路发挥抗病毒 作用[3]。

本研究通过评价32个性激素类药物体外抗EBOV活性,发现了除枸橼酸克罗米芬和枸橼酸托瑞米芬外,还有枸橼酸他莫昔芬、雌二醇苯甲酸酯、盐酸 雷洛昔芬、马烯雌酮、雌二醇、炔雌醚、雌激素酮、己烷雌芬、醋酸氯地孕酮以及非那雄胺10个药物也具有抗EBOV感染活性。对于ZEBOV,本研究发现的枸橼酸克罗米芬与枸橼酸托瑞米芬的IC50分别是0.53 μmol·L-1和0.19 μmol·L-1; 文献中发现的克罗米芬与托瑞米芬的IC50分别是3.83 μmol·L-1和0.973 μmol·L-1 [3]。两组实验结果相近,说明本研究方法可靠。此外,作者还发现枸橼酸他莫昔芬、雌二醇苯甲酸酯、盐酸雷洛昔芬和马烯雌酮的抗EBOV活性与枸橼酸克罗米芬及枸橼酸托瑞米芬相当。雌二醇、炔雌醚、雌激素酮和非那雄胺具有中等程度的抗EBOV活性。而己烷雌芬和醋酸氯地孕酮对EBOV具有弱活性。通过对24个雌性激素药物作用机制分析总结,未找到其抗EBOV机制的共性,因此认为雌激素受体调节剂抗EBOV进入的机制与经典的雌激素受体通路无关。

本实验对12个性激素药物抗SEBOV和MARV活性进行测定,结果显示其中5个药物 (枸橼酸托瑞米芬、枸橼酸他莫昔芬、枸橼酸克罗米芬、盐酸雷洛昔芬和炔雌醚) 对上述两种病毒进入细胞有阻断活性。ZEBOV是所有丝状病毒中爆发次数最多且致病能力最强的毒株,本研究发现的5个活性药物中,枸橼酸托瑞米芬、枸橼酸他莫昔芬和枸橼酸克罗米芬抗ZEBOV的IC50介于0.1～0.6 μmol·L-1,而盐酸雷洛昔芬和炔雌醚抗ZEBOV的IC50介于3.0～7.0 μmol·L-1,前三个药物抗ZEBOV的活性比后两个药物强10倍,药效学显著优于后两者。

埃博拉出血热的潜伏期为2～21天,平均为4～10天[16]。早期快速使用药物对于控制病情非常关键。结合埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD) 的发病特点和治疗重点,作者比较了枸橼酸托瑞米芬、枸橼酸他莫昔芬和枸橼酸克罗米芬的原临床适应征、药代动力学特征和毒副作用,枸橼酸托瑞米芬和枸橼酸他莫昔芬主要用于治疗乳腺癌,临床使用剂量分别是每日60 mg及10～20 mg。枸橼酸托瑞米芬口服后血药达峰时间tmax为2～4 h,清除半衰期t1/2为5天,不良反应轻微。枸橼酸他莫昔芬口服后tmax为4～7 h,清除半衰期t1/2为5～7天,不良反应主要是胃肠道反应和神经精神症状。此外孕妇和血栓栓塞患者均禁用此药[17, 18, 19, 20]。枸橼酸克罗米芬主要用于治疗不孕症、闭经和月经紊乱等,口服剂量为每日50～100 mg,清除半衰期t1/2为5～7天。常见不良反应为胃痛和腹腔肿胀疼痛。孕妇、肝肾功能异常及血栓静脉炎患者禁用此药[21]。上述数据显示,枸橼酸托瑞米芬、枸橼酸他莫昔芬和枸橼酸克罗米芬的临床使用剂量、血药达峰时间处于相同数量级,清除半衰期t1/2相近。从3个药物的毒副作用比较可知,枸橼酸托瑞米芬的不良反应最为轻微,枸橼酸克罗米芬次之,而枸橼酸他莫昔芬可能引发神经精神症状,较为严重。因此,综合分析认为3个药物的潜在抗EBOV优势强弱顺序依次为: 枸橼酸托瑞米芬、枸橼酸克罗米芬、枸橼酸他莫昔芬。

本研究发现枸橼酸托瑞米芬、枸橼酸他莫昔芬、枸橼酸克罗米芬、盐酸雷洛昔芬和炔雌醚具有广谱 抗丝状病毒活性,其中克罗米芬和托瑞米芬的抗ZEBOV药效学已被证实[3],本研究的创新点在于发现了包括枸橼酸克罗米芬和枸橼酸托瑞米芬在内的上述5个药物不仅具有抗ZEBOV活性,而且具有广谱抗丝状病毒活性,并且体外实验显示其IC50值相近,因此本研究结果为应对EBOV疫情爆发提供了物质基础和实验数据。

参考文献
[1] Knipe DM, Howley PM. Fields Virology[M]. 6th ed. Philadelphia:Lippincott Williams & Wilkins Health, 2013:923-952.
[2] FeldmannH, Geisbert TW. Ebola haemorrhagic fever[J]. Lancet, 2011, 377:849-862.
[3] Johansen LM, Brannan JM, Delos SE, et al. FDA-approved selective estrogen receptor modulators inhibit Ebola virus infection[J]. Sci Transl Med, 2013, 5:190ra79.
[4] World Health Organization. Ebola situation report-8 April 2015[R]. Geneva:WHO, 2015.
[5] Li HY, Ying TL, Yu F, et al. Development of therapeutics for treatment of Ebola virus infection[J]. Microbes Infect, 2015, 17:109-117.
[6] Nanbo A, Watanabe S, Halfmann P, et al. The spa-tio-temporal distribution dynamics of Ebola virus proteins and RNA in infected cells[J]. Sci Rep, 2013, 3:1206.
[7] Cao YL, Guo Y. Screening of HIV-1 replication inhibitors by using pseudotyped virus system[J]. Acta Pharm Sin(药学学报), 2008, 43:253-258.
[8] Cao YL, Li SX, Chen H, et al. Establishment of pharmacological evaluation system for non-nucleoside re-verse-transcriptase inhibitors resistant HIV-1[J]. Acta Pharm Sin(药学学报), 2009, 44:355-361.
[9] Guo JM, Guo Y. The in vitro HAART pharmacodynamics study with dolutegravir as the "anchor"[J]. Acta Pharm Sin(药学学报), 2015, 50:50-58.
[10] Ba MY, Cao YL, Xu BL, et al. Mechanism and action characteristics studies of a quinoxalinone compound against HIV-1 replication[J]. Acta Pharm Sin(药学学报), 2013, 48:860-865.
[11] Leroy EM, Gonzalez JP, Baize S. Ebola and Marburg haemorrhagic fever viruses:major scientific advances, but a relatively minor public health threat for Africa[J]. Clin Microbiol Infect, 2011, 17:964-976.
[12] Food And Drug Administration. INCURIN(estriol) Tablets and PROIN(phenylpropanolamine hydrochloride) Chewable Tablets-Pharmacy Professionals[EB/OL]. 2015-01-20. http://www.fda.gov/animalveterinary/safetyhealth/productsafetyinformation/ucm277199.htm.
[13] Food And Drug Administration. Estraderm Prescribing Information[R/OL]. http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2004/19081s040lbl.pdf.
[14] Kouznetsova J, Sun W, Martínez-Romero C, et al. Identification of 53 compounds that block Ebola virus-like particle entry via a repurposing screen of approved drugs[J]. Emerg Microbes Infect, 2014, 3:e84.
[15] Veljkovic V, Loiseau PM, Figadere B, et al. Virtual screen for repurposing approved and experimental drugs for candidate inhibitors of EBOLA virus infection[J]. F1000Res, 2015, 4:34.
[16] Goeijenbier M, van Kampen JJ, Reusken CB, et al. Ebola virus disease:a review on epidemiology, symptoms, treat-ment and pathogenesis[J]. Neth J Med, 2014, 72:442-448.
[17] Ye QL, Zhai ZM. Toremifene and tamoxifen have similar efficacy in the treatment of patients with breast cancer:a meta-analysis of randomized trials[J]. Mol Biol Rep, 2014, 41:751-756.
[18] Drug Bank. Tamoxifen[DB/OL]. http://www.drugbank.ca/drugs/DB00675.
[19] Food And Drug Administration. Tamoxifen citrate[R/OL]. http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2002/17970s37s44s49lbl.pdf.
[20] Drug Bank. Toremifene[DB/OL]. http://www.drugbank.ca/drugs/DB00539.
[21] Food And Drug Administration. Clomiphene citrate tablets USP[R/OL]. http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2012/016131s026lbl.pdf.