盐酸黄酮哌酯 (3-甲基黄酮-8-羧酸乙哌啶基酯盐酸盐,flavoxate hydrochloride,FX) 属于黄酮类化合物,是一种平滑肌松弛药,对泌尿生殖系统的平滑肌有选择性解痉作用,可以消除尿频、尿急、尿失禁及尿道膀胱平滑肌痉挛引起的下腹部疼痛^{[1, 2]},临床上以片剂或胶囊的形式用于治疗各种下尿路感染或梗阻性疾病^[3]。药代动力学研究表明^[4],FX在静脉给药或口服给药时,在体内迅速吸收并代谢成3-甲基黄酮-8-羧酸(3-methylflavone-8-carboxylic acid,MFA),从尿中排出。由于药物分析、药理学、药代动力学和临床分析等方面研究的需要,关于FX及其代谢产物MFA在药剂、血液、尿液等样品中的分析方法已有诸多研究报道,包括紫外分光光度法^[5]、高效液相色谱法^{[6, 7, 8, 9, 10]}、毛细管电泳法^[11]、伏安法^[12]和膜电位法^{[13, 14]}等。最近,Zaazaa等^[15]报道了尿液中FX代谢产物MFA的荧光分析方法,并用于泌尿灵片剂中FX的测定。

黄酮类化合物 (包括天然的和经过结构改造的衍生物) 数目众多,具有抗癌、抗氧化、抗炎、保肝、舒张血管、抗病毒、抗菌和抗过敏等多种药理活性,在药品、食品和饮品中广泛存在^{[16, 17]}。但是,此类化合物由于分子结构方面的原因,其内源荧光普遍不强,有应用价值的荧光分析方法不多。作者在研究黄酮类化合物的荧光性质时,发现FX在强碱性水溶液中有荧光增强现象,加热可加速荧光反应。深入研究发现,这种荧光既非FX的荧光,亦非其水解产物MFA的荧光,而是MFA分子中γ-吡喃酮环裂解后 所形成产物的荧光。本文研究了pH和温度对FX荧光增强反应的影响,探讨了反应机制。在此基础上,建立了测定药物中FX的荧光分析新方法,检测限为1.1 ng·mL^-1。将该方法用于盐酸黄酮哌酯片中FX含量的测定,结果与对照方法一致,表明方法可靠。与文献^{[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14]}报道的各种分析方法相比,本法的灵敏度高2～3个数量级,且简便、快速。与文献^[15]的荧光分析法相比,本法灵敏度约高70倍,且操作简便、环境友好。文献^[15]需在甲醇溶液中测定,本法在水溶液中测定。文献^[15]先将片剂样品在1.0 mol·L^-1 NaOH溶液中水解3 h,然后用盐酸调节pH至中性,蒸干溶液,再用甲醇溶解残渣后测量荧光; 而本法将样品在0.20 mol·L^-1 NaOH溶液中沸水浴分解2 h,冷却至室温后测量荧光,手续简便、省时。

黄酮类化合物在碱性条件下的γ-吡喃酮环裂解反应早已被人们所知^[18],但这种反应所导致的荧光增强现象未见研究报道。由于黄酮类化合物的γ-吡喃酮环碱裂解反应具有普遍性,而且反应所产生的酚酸类化合物很可能具有荧光,因此,本研究为黄酮类化合物的荧光分析提供了一种新思路。

F-7000型荧光分光光度计 (Hitachi),配备150 W氙灯,1 cm荧光池,选择激发和发射狭缝 (slit) 为5.0 nm,UV-29滤光片,光电倍增管负高压 (PMT) 为700 V; UV-2501PC型紫外-可见分光光度计 (Shimadzu),1 cm吸收池; Mercury-500型核磁共振仪 (瑞士BRUKER); PE-M-1730型红外分光光度计 (美国BIO-BAD); 3200-Q-Trap型质谱仪 (美国AB SCIEX); Vavio-EL-Ⅲ元素分析仪 (德国); 828型pH/ ISE测试仪 (Orion); 十万分之一分析天平 (Shimadzu)。

(日本TCI,F0717,M_W: 427.93): 以甲醇 (美国Tedia公司,色谱级) 配制成101.4 μg·mL^-1储备液; 3-甲基黄酮-8-羧酸 (日本TCI,M2371,M_W: 280.28): 以甲醇配制成147.2 μ g·mL^-1储备液; 盐酸黄酮哌酯片 (优必达,吉林金恒制药股份有限公司); Britton-Robinson缓冲溶液: 将磷酸、硼酸和乙酸混合溶液 (浓度均为0.20 mol·L^-1) 与NaOH溶液(1.0 mol·L^-1) 以一定比例混合,用于调节pH; 十二烷基磺酸钠 (SDS): 0.025 mol·L^-1; β-环糊精 (β-CD): 16.2 mg·mL^-1; 溴化十六烷基三甲胺 (CTAB): 0.025 mol·L^-1; 硫酸奎宁: 1.00×10^-4 mol·L^-1; 二次去离子水; 辅助试剂均为分析纯。

在10 mL量瓶中,加入FX溶液,以pH缓冲溶液或NaOH溶液调节pH,在水浴中加热一定时间,冷却至室温,以水定容,摇匀,扫描二维或三维荧光光谱。在相同的仪器条件下测量纯水在激发波长350 nm的拉曼散射强度R,以R为步长 (contour interval) 对三维荧光图谱进行校正。

在25 mL量瓶中加入适量硫酸奎宁溶液,以0.05 mol·L^-1 H₂SO₄溶液定容,摇匀。在25 mL量瓶中加入适量FX溶液和2.0 mL 1.0 mol·L^-1 NaOH溶液,加水约20 mL,沸水浴中加热2 h,冷却,以水定容,摇匀。扫描两种溶液的紫外吸收光谱和荧光光谱,测量激发波长处的吸光度和积分荧光强度,以硫酸奎宁在激发波长313 nm的荧光量子产率0.55为参比,计算待测物质的荧光量子产率^{[19, 20]}。

把盐酸黄酮哌酯片研碎,精密称取0.050 9 g粉末,置于100 mL量瓶中,用甲醇浸泡过夜,密封。精密移取一定体积的上清液于25 mL量瓶中,以甲醇稀释,定容,备用。

在一系列10 mL量瓶中,分别加入一定量的FX标准溶液或样品溶液,加入2.0 mL 1.0 mol·L^-1 NaOH溶液,加水至约7 mL,在沸水浴中加热2 h,冷却,以水定容,摇匀,扫描荧光光谱,测量荧光强度。以标准曲线法和标准加入法分别测定样品中FX的含量。

在一系列10 mL量瓶中,分别加入一定量的FX标准溶液或样品溶液,以甲醇定容,扫描紫外吸收光谱,测量290 nm吸收度。以标准曲线法和标准加入法分别测定样品中FX的含量。

1 FX 碱性溶液的三维荧光光谱

FX水溶液在酸性、中性和碱性条件下基本无荧光。图 1a是FX碱性溶液放置0.5 h后的三维荧光光谱,图中没有荧光峰。在FX溶液中分别加入表面活性剂SDS、CTAB或β-CD,也未发现敏化荧光。FX碱性溶液在放置过程中逐渐产生荧光,加热可促进FX碱性溶液荧光增强,如图 1b。图中出现2个强荧光峰,激发波长 (λ_ex) 分别为223 nm和302 nm,发射波长 (λ_em) 均为410 nm。这种现象说明FX在碱性热溶液中转变为强荧光物质。

Figure 1

Figure 1 Three dimensional fluorescence spectra of flavoxate hydrochloride (FX) alkali solution under different conditions. cFX: 0.252 μg·mL-1,pH 13.30,MeOH: 10%. a: Lay aside for 0.5 h at room temperature; b: Heat for 2 h at 100 ℃. Contour interval: R

pH值: 在一系列10 mL量瓶中分别加入FX溶液,不同的pH缓冲溶液,以水稀释至约7 mL,在沸水浴中加热2 h,冷却,以水定容,扫描荧光光谱,如图 2a,图中λ_ex为223、302 nm,λ_em为410 nm。当FX溶液pH < 9.0时,基本无荧光; pH > 9.0之后,荧光强度随pH上升而增强,pH > 13.0时达到最大,且稳定,如图 2b。本文选择在pH 13.30进行荧光增强反应。

Figure 2

Figure 2 Fluorescence spectra of FX aqueous solution at different pHs (a) and influence of pH on fluorescence intensity (b). cFX: 0.404 μg·mL-1,heat for 2 h at 100 ℃,λex/λem: 302/410 nm

加热时间: 配制一系列FX碱性溶液,加热不同时间,扫描荧光光谱,得图 3a。荧光强度随加热时间的延长而增强,在加热1.5 h之后,荧光强度趋于稳定,如图 3b。在氙灯持续照射下 (时间扫描),荧光强度在300 s内基本无变化,表明荧光物质性质稳定。本文选择加热时间为2 h。

Figure 3

Figure 3 Fluorescence spectra of FX alkali solutions heated for different times (a),influence of heating time on fluorescence intensity (b). cFX: 0.404 μg·mL-1,pH 13.30,λex/λem: 302/410 nm

综上所述,适宜的实验条件为: pH 13.30,沸水浴加热2 h,冷却至室温,在λ_ex / λ_em= 302 / 410 nm测量荧光强度。

按照荧光量子产率的实验方法,以硫酸奎宁为参比,测量了FX碱分解产物的荧光量子产率。在最大激发波长302 nm,测得荧光量子产率为0.50,属于强荧光物质。

标准曲线法: 配制不同浓度的FX标准溶液,按照前述方法实验,绘制标准曲线,在0.020 3～0.487 μg·mL^-1,回归方程为: I_F = 23.9 + 5 357.3 c,r = 0.999 7 (n = 8)。检测限D = 3 × s_b / S = 3 × 1.9/ 5 357.3 = 0.001 1 (μg·mL^-1) = 1.1 ng·mL^-1 (s_b为空白信号标准偏差,S为方法的灵敏度)。取样品溶液,以同样方法实验,由回归方程计算FX的含量,4次测定平均值为41.34%,标准偏差 (RSD) 为0.48%。见表 1。

(Table 1)

Table 1 Determination of FX in Flavoxate Hydrochloride Tablets by standard method No. cS /μg·mL-1 IF cFX /μg·mL-1 FX content/% Average content/% RSD /% 1 0.203 6 481.9 0.085 5 41.98 41.34 0.48 2 0.407 2 927.5 0.168 7 41.42 3 0.610 8 1 369 0.251 1 41.11 4 0.814 4 1 807 0.332 8 40.87

Table 1 Determination of FX in Flavoxate Hydrochloride Tablets by standard method

标准加入法: 取相同体积的盐酸黄酮哌酯片样品溶液若干份,分置于10 mL量瓶中,加入不同量的FX标准溶液,按照前述方法实验,测量荧光强度,绘制标准加入曲线,回归方程为: I_F = 474.9 +5 564.9 c (μg·mL^-1),r=0.999 7 (n=6)。用外推法算得样品中 FX的含量为41.91%,与标准曲线法一致。标准加入法中5个加标实验点的加标回收率平均值为100.2%,标准偏差为3.8%。

准确度: 用中国药典中测定盐酸黄酮哌酯片剂中FX含量所使用的紫外分光光度法验证了本法的 准确度。标准曲线法测定同一样品中FX的含量为39.60%,标准偏差为0.53%,标准加入法测定结果为39.93%,与本法测定结果基本一致。

精密度: 标准曲线法4次测定结果的标准偏差 为0.38%,5次加标回收的标准偏差为3.8%,表明方法的精密度良好。

灵敏度: 检测限D = 1.1 ng·mL^-1,灵敏度远高于现有其他方法。

线性范围: 标准曲线回归方程的相关系数r = 0.999 7,线性关系良好; 浓度范围至少为0.020 3～0.487 μg·mL^-1。

专属性: 根据中国药典,对盐酸黄酮哌酯原料药需检测微量重金属和砷等杂质,但这些杂质对本方法不造成干扰。有关物质主要是MFA,测定结果应当是FX和MFA的总量,这一点与紫外分光光度法相同。

耐用性: 本法实验条件易于控制,FX分解产物的荧光性质在加热和光照情况下均在较长时间内稳定,因而方法的耐用性好。

本法基于FX的荧光增强反应,对荧光增强机制进行了深入探讨。据文献^{[4, 7, 8, 11, 15]}报道,FX可以在酸性、碱性条件下或体内代谢时发生酯键水解反应,生成MFA。在碱性条件下,MFA羧基质子电离,成为阴离子。

Figure 4

Figure 4 Hydrolysis reaction of FX ester bond

作者比较了MFA碱液加热后的荧光光谱与FX碱液加热后的荧光光谱,发现两者完全相同。为了进一步证实上述反应,作者在FX加热后的碱液中加入盐酸,调节至pH 1.0,得到析出产物。对该产物进行了IR、¹H NMR、¹³C NMR、MS和元素分析,结果表明所得产物确为MFA。

本文观测到的荧光是否属于MFA？首先,从荧光峰的位置来看,文献^[15]报道,4 μg·mL^-1 MFA甲醇溶液的荧光峰位于λ_ex/λ_em = 338/390 nm; 但本文测得的荧光峰位于λ_ex/λ_em = 302/410 nm,与文献^[15]明显不同。其次,从荧光强度来看,文献^[15]中MFA的浓度为本文浓度的10倍,说明MFA即使在有机溶剂中也是弱荧光物质; 而本文测得FX分解产物在碱性水溶液中的荧光量子产率为0.50,属于强荧光物质。再者,本文实验方法与文献^[15]有显著差异。因此,本文观察到的荧光不属于MFA。

MFA分子属于有机弱酸,在碱性条件下质子离解,变为阴离子。根据分子荧光理论,有机弱酸的分子态与离子态通常呈现不同的荧光性质,可以看作两种不同的荧光体。本文观察到的荧光是否属于阴离子态的MFA？由于羧基的酸性较强,一般在pH < 7.0的弱酸性条件下即可电离,且不必加热; 而本文所观察到的荧光只有在强碱性且加热条件下才能产生。因此,本文观察到的荧光也不属于MFA阴离子。

由此可见,FX在水解生成MFA之后,必定又发生了进一步反应,生成了新的荧光物质。鉴于黄酮类化合物的强碱溶液加热或者是紫外光照射时,γ-吡喃酮的碳氧键可发生开环反应^[18],作者推断,MFA在强碱加热条件下发生了如图 5所示的裂解反应。

Figure 5

Figure 5 Cleavage reaction of MFA

反应产物为α,β-不饱和酮。根据强荧光物质的一般结构特征^[21],反应产物应该具备较大的共轭π键体系、刚性平面结构、有给电子取代基,而反应物则缺乏这些结构特征。晶体结构测定表明^[22],黄酮类化合物的γ-吡喃酮环 (C环) 与骈合的苯环 (A环) 并不在同一平面,B环与C环单键相连,也不在同一平面,并且C环是扭曲的,3个环之间不能形成共轭π键体系。这是MFA荧光不强的主要原因。而裂解反应产物看似共轭程度不高,但由于A环上的羧基与邻位羟基构成了邻羟基苯甲酸 (水杨酸) 结构,羧基氧与邻羟基之间可形成氢键^{[21, 23]},在A环的侧面又形成一个6元环,此环可与A环形成共轭体系,使分子共轭程度提高,刚性加强。从取代基的角度看,MFA分子A环上的羧基是吸电子取代基,对荧光有猝灭作用; 而MFA裂解产物分子A环上增加了羟基,是给电子取代基,有增强荧光作用,而且羟基和邻位羧基形成氢键,也有利于荧光增强。因此,图 5中反应产物的共轭程度、刚性和取代基都有利于荧光增强,而反应物MFA则相反。从荧光与分子结构的关系来 看,裂解反应导致荧光增强是合理的。

从荧光光谱特征与分子结构的关系来看,裂解产物的荧光发射峰位于410 nm,比含一个苯环的酚酸类化合物的荧光峰 (300～350 nm) 红移了几十纳米,表明共轭程度增大,这是裂解产物分子中存在两环共轭体系的有力实验证据。从光谱形状来看,裂解产物的荧光光谱与水杨酸^[23]、磺基水杨酸^[20]和铝试剂^[19]的荧光光谱极为相似,这表明它们含有相同的荧光团: 邻羟基苯甲酸结构。

作者曾试图制备α,β-不饱和酮纯品,并进行结构表征。但是,由于FX碱液加热后再经酸化得到MFA,而不是期望的产物 (这说明γ-吡喃酮的碳氧键开环反应是可逆的),这一设想未能实现。作者又测试了相同摩尔浓度的FX、MFA与FX碱液加热后溶液的紫外吸收光谱,发现FX与MFA的吸收光谱在300 nm附近基本相同,而裂解产物的吸收光谱与前两者明显不同,表明MFA确实发生了裂解反应。

综上所述,FX荧光反应原理为: 在热碱性溶液中FX首先发生酯键水解反应,生成MFA,进而发生γ-吡喃酮碳氧键开环反应,生成α,β-不饱和酮。该产物包含邻羟基苯甲酸结构,在碱性条件下由于羧基质子的电离而使羧基氧与邻位羟基之间形成氢键,分子的共轭程度增加,刚性增强,因而产生荧光。