糖尿病是一种慢性疾病,随着病情的发展,长期高血糖会引起大血管及微血管病变并最终引发多种并发症,严重影响患者的生活质量。随着生活水平的提高,糖尿病的发病率也逐年提高。我国的成年人中糖尿病患病率约为11.6% 且好发于老年人、城市地区与经济发达地区。预计到2030年,糖尿病患病人数将增至3.66亿^[1]。在所有的糖尿病患者中,2型糖尿病 (type 2 diabetes mellitus,T2MD) 患者约占95%。T2MD主要由高脂饮食、运动缺乏和肥胖引起,患者表现为胰岛素抵抗、胰岛细胞功能障碍和胰岛素分泌减少。近年来大量的研究表明糖尿病患者发生肿瘤的风险明显高于一般人,并且远高于预期^{[1, 2]}。流行病学研究显示T2MD患者肝癌、胰腺癌和子宫内膜肿瘤的发病率为一般人的2倍,结直肠癌、肾脏肿瘤、膀胱癌和乳腺癌的发病风险为一般人的1.2～1.5倍。T2MD患者的结肠癌、肝癌、胰腺癌、子宫内膜肿瘤和肾脏肿瘤的标准化发病率在1964～2010年间一直保持增长,至2010年胰腺癌与肝癌的标准化发病率最高,分别为2.98和2.43^{[1, 2]}。

二甲双胍是双胍类口服降糖药,因其兼具有效性、安全性和经济性,自20世纪50年代研制成功后一直在临床使用至今。2014年美国糖尿病学会制定的《糖尿病医学诊疗标准》中指出: 如果没有禁忌症且能够耐受,二甲双胍是T2MD起始治疗的首选药物^[3]。二甲双胍通过降低胰岛素抵抗和空腹血浆胰岛素水平,在降低血糖的同时不会引起明显的低血糖。因此二甲双胍是一个良好的降糖药和胰岛素增敏药。自从2005年一项回顾性调查发现使用二甲双胍的T2MD患者患肿瘤的风险明显低于使用其他降糖药的患者^[4],二甲双胍作为抗肿瘤药物的研究便成为研究热点。大量的队列研究和流行病学调查显示使用二甲双胍可以降低多种肿瘤的患病风险,包括胰腺癌、直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、甲状腺肿瘤和喉癌等。虽然有队列研究表明二甲双胍的使用与乳腺癌风险无关,但一项回顾性研究指出长期应用二甲双胍可以增加糖尿病乳腺癌患者的生存率^[5]。然而,在一项德国与英国的糖尿病人数据库分析中,Kowall等^[6]通过建立COX回归模型(Cox’s proportional hazards regression model) 分析最终认为二甲双胍对结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌并没有明显的保护作用。在荷兰,对胰腺癌患者进行的一项双盲实验结果同样显示二甲双胍的使用并不能改善患者的预后^[7]。但是大量的实验室研究已将二甲双胍抗肿瘤的机制逐渐阐明。随着机制的阐明,二甲双胍很有可能作为抗肿瘤药物或者辅助用药用于临床。本文将综述二甲双胍抗肿瘤分子机制的研究进展。

已经有多项临床试验将二甲双胍作为抗肿瘤辅助用药。47名被确诊为乳腺癌的患者在手术前随机给予二甲双胍一段时间。结果显示,与对照组相比,使用二甲双胍的患者Ki67 (一种核蛋白,判断乳腺癌预后的重要标志) 染色的细胞明显减少^[8]。有趣的是在另一项临床试验中,将200名非糖尿病乳腺癌患者随机分为两组,在术前一段时间分别给予安慰剂和850 mg二甲双胍 (一天两次),结果显示二甲双胍仅显著降低胰岛素抵抗患者的Ki67阳性细胞数^[9]。这个结果提示二甲双胍的抗肿瘤活性与胰岛素抵抗密切相关。26名结肠直肠癌患者连续每天使用250 mg的二甲双胍后,与对照组相比异常隐窝病灶明显减少^[10]。在甲状腺肿瘤的临床试验中,合用二甲双胍 较单用化疗药物可以有效减小患者的甲状腺肿瘤体积^[11]。这些结果直接证明了二甲双胍在治疗肿瘤方面有很大的研究潜力。

虽然二甲双胍作为降糖药物已经被使用60多年,但二甲双胍降糖的机制在近几年才被慢慢阐明。其中最重要的机制便是AMPK依赖的降糖机制。二甲双胍可以在很多种组织细胞内特异性地抑制线粒体呼吸链酶复合体 I,包括肝细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、胰岛β细胞和神经细胞^[12]。线粒体呼吸链酶复合体 I被抑制会引起线粒体有氧呼吸功能减弱、三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate,ATP) 生成减少,导致细胞内ATP生成与消耗的平衡被打破、AMP/ATP的比例升高。AMP比例的升高可以直接激活AMPK,继而通过磷酸化一些关键性的代谢酶或者激活转录因子调节基因表达,使细胞从合成代谢状态转换为分解代谢状态,从而维持细胞内的能量代谢平衡^[13]。因此,激活的AMPK抑制糖质新生、脂肪生成和蛋白质合成的同时,还刺激脂肪酸的氧化和肝细胞对葡萄糖的摄取^[14]。正常的细胞主要通过线粒体氧化磷酸化获得ATP,而多数的肿瘤细胞发生代谢方式的突变,其在氧气充足的条件下也会通过大量的糖酵解来获得ATP,称为有氧糖酵解。这种现象在1924年被Otto Warburg发现,称为Warburg效应。Warburg效应为肿瘤的快速增殖提供了大量营养物质包括核苷酸、氨基酸和脂质^[15]。因此AMPK可以通过抑制肿瘤细胞糖质新生、脂肪生成和蛋白质合成从而抑制肿瘤细胞的增殖。AMPK是一个高度保守的磷酸激酶,存在于几乎所有的真核细胞。虽然多种肿瘤细胞的AMPK功能都有不同程度的抑制,但肿瘤细胞直接出现AMPK突变的情况并不多见,多数的肿瘤细胞通过突变肝脏激酶B1 (liver kinase B1,LKB1) 基因纯合子使其功能退化。LKB1是AMPK的上游信号因子,LKB1的突变直接导致AMPK对代谢应激的反应减弱甚至消失。约30% 非小细胞肺癌和20% 宫颈癌都会出现LKB1的突变^[16]。AMPK作为细胞内 保持代谢平衡重要的调控因子已经被证明可以作为抗肿瘤的重要靶点。二甲双胍特异性激活AMPK从而抑制多种肿瘤细胞的增殖。研究表明二甲双胍通 过激活AMPK增加乳腺癌细胞MCF-7对放疗的敏感性^[17]。而且二甲双胍还可以通过激活AMPK诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡^[18]。

值得一提的是二甲双胍在激活AMPK后,激活的AMPK可以进一步激活其下游的信号通路来发挥抗肿瘤的作用。最近有研究显示AMPK可以通过调控炎症来抑制肿瘤形成。环氧酶-2 (cyclooxygenase-2,COX-2) 是一个重要的炎性因子,目前已经发现COX-2在多种肿瘤细胞中高表达,可能与肿瘤形成有关^[19]。在结直肠癌、白血病和黑色素瘤细胞系中,通过AMPK的激活剂与COX-2抑制剂的使用已经发现AMPK与COX-2之间存在确定的联系^[20]。因此激活AMPK来抑制COX-2或许可以作为一个抑制肿 瘤形成的新方法。在一项合用二甲双胍与阿司匹林 作用于胰腺癌的实验中,二甲双胍激活AMPK从而抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,mTOR) 磷酸化,阿司匹林抑制环氧酶-1 (cyclooxygenase-1,COX-1)/COX-2抑制炎症,两药在胰腺癌的治疗中发挥协同作用^[21]。p53基因是一个可以对DNA损伤、癌基因激活、缺氧、细胞周期阻滞或细胞衰老等细胞内压力做出应激反应从而抑制肿瘤发展的肿瘤抑制因子^[22]。约50%的肿瘤中p53基因出现失活现象。p53基因的缺失赋予了肿瘤细胞选择性生长优势。AMPK可以磷酸化p53的46位丝氨酸,促进p53基因的表达^[23]。AMPK很可能是通过 磷酸化并激活p53结合蛋白同系物来磷酸化并激活p53。持续激活AMPK可以加速p53依赖的细胞老 化^[24]。p53缺失后, 肿瘤细胞对二甲双胍造成代谢改变的应激能力明显减弱,使得肿瘤细胞可以在营养物质缺乏的情况下生存。二甲双胍与2-脱氧果糖合 用引起前列腺肿瘤细胞发生p53依赖的凋亡^[25]。在鼠黑色素瘤的外渗和转移模型中,二甲双胍通过激活AMPK/p53有效地抑制了黑色素瘤的转移与发展^[26]。在肝癌细胞中,低浓度的二甲双胍可以通过激活AMPK引起p53依赖的细胞衰老^[27]。乙酰辅酶A羧化酶 (acetyl CoA carboxylase,ACC) 已经被明确证明为AMPK的下游信号因子,ACC与脂质代谢密切相关。肿瘤进展与脂质代谢平衡相关的酶的表达变化有着密切的联系,其中包括ACC。肿瘤细胞的增殖有明显的ACC依赖性,抑制ACC活性可以引起肿瘤细胞的凋亡。在雌激素受体阳性与阴性的MCF-7细胞中,二甲双胍都可以通过激活AMPK来磷酸化ACC,引起两种细胞的细胞周期G₁期阻滞,抑制细胞增殖^[28]。

mTOR通路是调控细胞生长、增殖、转移、蛋白合成和转录的重要通路。mTOR包括两个功能不同 的配合物: mTOR复合物1 (mTORC1) 和mTOR复 合物2 (mTORC2)。二甲双胍抑制肿瘤生长与mTOR通路有着密切的联系,其可以通过两种方式抑制mTOR的活性: AMPK依赖的mTOR抑制作用和非AMPK依赖的mTOR抑制作用。

AMPK依赖的mTOR抑制作用: 二甲双胍激活AMPK后,引起结节性硬化复合物2 (tuberous sclerosis 2,TSC2) 的磷酸化,TSC1/TSC2复合体的形成能够直接抑制mTOR并最终抑制下游的信号因子核糖体蛋白激酶 (ribosomal protein S6 kinase,p70s6K) 和磷酸化4E结合蛋白1抗体 (eIF4E-binding protein phosphorylation,4EBP1) 的活性,而这两者直接影响到蛋白的转录与合成^[29]。二甲双胍作用于AMPK/ mTOR通路的作用机制首先被Dowling等^[30]阐明,在乳腺癌MCF-7细胞中,二甲双胍可以抑制MCF-7细胞的翻译起始过程,该过程是通过激活AMPK后抑制mTOR介导的。并且对小鼠喂食一段时间二甲双胍后,小鼠胰腺组织中mTOR被明显抑制同时磷酸化的AMPK和TSC2增加^[31]。在胃癌细胞中,干扰AMPK表达以及高表达mTOR通路重要下游信号因子p70s6K后,二甲双胍引起的凋亡现象消失或减弱,表明二甲双胍通过激活AMPK抑制mTOR通路引起胃癌细胞的凋亡^[32]。在人前列腺癌细胞DU145中,二甲双胍通过AMPK/mTOR通路抑制DU145细胞的增殖,并且维他命D3与二甲双胍发生协同作用^[33]。但是,Gwinn等^[34]发现AMPK可以不通过TSC2而是直接磷酸化Raptor (一个150 KDa的mTOR结合蛋白) 来抑制mTOR活性。但是二甲双胍是否有这样的作用并没有相关报道。

非AMPK依赖的mTOR抑制作用: 首次在小鼠肺癌细胞中报道,在小鼠肺组织中二甲双胍通过抑制胰岛素样生长因子-1受体 (insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)/胰岛素受体 (insulin receptor,IR) 及蛋白激酶B (protein kinase B,AKT) 抑制mTOR 的活性而并不影响AMPK的活性^[35]。Kalender等^[36]证明在干扰AMPK表达后,二甲双胍仍能抑制果蝇Kc167细胞内的mTOR活性,并且揭示了二甲双胍可以通过溶酶体GTP酶抑制mTOR活性。另有研究表明二甲双胍可以通过降低人类表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor-2,HER2) 水平抑制乳腺癌细胞活性,并且此效应是通过抑制mTOR及其下游信号因子p70S6K介导的^[37]。Ben Sahra等^[38]报道了一个新的二甲双胍引起的非AMPK依赖的mTOR抑制作用,在前列腺癌细胞中二甲双胍可以增强发育及DNA损伤反应调节基因1的作用,该基因是mTOR的一个负性调控因子,二甲双胍通过增强其作用从而抑制mTOR活性。二甲双胍还可以通过下调细胞型Fas相关的死亡区域蛋白样白介素-1转换酶抑制蛋白,来增加人膀胱癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的细胞凋亡的敏感性,并且该作用是通过非AMPK依赖的mTOR通路介导的^[35]。

胰岛素和IGF-1是刺激细胞生存和有丝分裂的潜在的生长因子。当IGF-1与IGF-1R结合后,激活磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K),紧接着PI3K激活AKT,形成IGF-1/PI3K/AKT通 路^[39]。而且胰岛素受体可以通过生长因子受体结合蛋白2 (growth factor receptor-bound protein 2,GRB2) 传递信号到Ras/Raf/ERK形成IR/GRB2/Ras/Raf/ERK通路。这两条通路在调节细胞生存与增殖方面都起着至关重要的作用。胰岛素和IGF-1的受体在乳腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌和皮肤癌都有不同程度的高表 达。并且在动物模型中,通过限制能量减少胰岛素和IGF-1可以减少癌症的发病率^[40]。因此二甲双胍很可能是通过降低血清胰岛素和IGF-1的水平来减少胰岛素和IGF-1对肿瘤细胞的生长刺激作用。二甲双胍可以通过抑制胰岛素/IGF-1通路,从而抑制子宫乳头状浆液性癌细胞的增殖^[41]。并且有报道指出二甲双胍降低胰腺癌的发病率并提高糖尿病合并胰腺癌患者的生存率主要是通过抑制胰岛素/IGF-1信号通路、破坏线粒体呼吸和抑制mTOR介导的^{[21, 42]}。最近研究表明二甲双胍可以阻滞甚至阻断IGF-1R信号通路的反馈调节,与IGF-1R抑制剂合用产生协同作用杀伤肿瘤细胞^[43]。

临床上对肿瘤经过多次化疗后,该肿瘤可能对其他不同结构、不同作用靶点的抗肿瘤药物也具有 耐药性,称为多药耐药现象。多药耐药现象的出现是目前临床上化疗失败的最主要原因。肿瘤细胞多药 耐药现象最主要的机制为ATP结合盒式转运体 (ATP binding cassette transporter,ABC转运体) 的过表达。ABC转运体为外排型转运体,过表达的ABC转运体可以将作为底物的化疗药物排出肿瘤细胞外从而增加肿瘤细胞对化疗药物的耐受性。重要的多 药耐药转运体包括: P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp,亦作multidrug resistance 1,MDR1)、多药耐药相关蛋白-1 (multidrug resistance protein-1,MRP1) 和乳腺癌耐药蛋白 (breast cancer resistance protein,BCRP)^[44-46]。2009年,Vazquez-Martin等^[47]发现二甲双胍可以恢复乳腺癌耐药细胞对HER2抑制剂的敏感性。目前阐明的二甲双胍逆转多药耐药现象的机制主要是二甲双胍通过调节细胞内信号通路,抑制外排型转运体蛋白的表达从而增加抗肿瘤药物细胞内的蓄积后,恢复耐药细胞对抗肿瘤药物的敏感性。Kim等^[48]发现二甲双胍通过激活AMPK并抑制核因子κB和环磷腺 苷效应元件结合蛋白的活性,下调P-gp的表达来逆转MCF-7耐药细胞对阿霉素的耐药现象。还有研究表明二甲双胍下调P-gp和MRP1的表达,恢复肝癌耐药细胞对氟尿嘧啶的敏感性。同时,该研究发现二甲双胍通过AMPK/mTOR通路介导的抑制缺氧诱导因子-1α表达或许也与其逆转多药耐药现象有一定的联系^[49]。

自噬是当细胞营养物质不足或暂时不能利用时,细胞通过降解自身细胞质蛋白或细胞器为细胞完成基础功能提供能量的过程。因此,自噬对细胞度过各种压力条件提供了优势,压力条件包括缺氧、生长因子剥夺、营养物质缺乏、活性氧蓄积以及各种抗肿瘤的治疗等。恶性肿瘤因为快速增殖而更容易处于缺氧及营养物质缺乏的状态,因此自噬的存在为恶性肿瘤细胞营养匮乏时提供一个适应机制。但是自噬与恶性肿瘤的发生及发展的关系目前并没有定论。有研究表明胰腺癌中高的自噬水平对肿瘤细胞的生存有着显著的增强作用^[50]。但是,在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中存在自噬调控因子基因的缺失,因此自噬的减少也有可能对肿瘤的发展有益^[51]。二甲双胍在不同的肿瘤细胞系中对自噬也表现出了完全不同的调节效果。mTOR信号通路是调控自噬的一条经典通 路,二甲双胍可以通过激活AMPK抑制mTOR,增 加自噬水平从而抑制淋巴瘤的增殖,同时提高淋巴瘤对多柔比星的敏感性^[52]。目前已经发现一些新的调控机制,在食管鳞状上皮细胞中,二甲双胍下调信号传导与转录活化因子3引起肿瘤自噬与凋亡水平的升高。但是在某些肿瘤细胞株中,二甲双胍则表现为抑制自噬的作用。如硼替佐米通过葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78) 上调骨髓瘤的自噬水平,相反二甲双胍可以通过抑制GRP78从而抑制其自噬^[53]。在前列腺癌细胞中,二甲双胍不仅能够抑制自噬,并且可以逆转脱氧果糖引起的自噬水平升高,因此两药合用可减少自噬,使肿瘤细胞凋亡增加^[25]。

二甲双胍因其有效性、安全性和经济性作为2型糖尿病的首选用药,同时也因为它本身的诸多优点使得在发现二甲双胍可以降低肿瘤风险后,二甲双胍抗肿瘤的研究便成为研究热点。科研人员希望通过对二甲双胍抗肿瘤的机制研究使得二甲双胍可以真正科学、安全和有效地作为临床抗肿瘤的治疗手段或者辅助治疗手段。遗憾的是并不是所有的体外实验或者动物模型体内实验的结果都可以在临床体内研究中体现出来。虽然大量的实验结果支持二甲双胍在多种肿瘤治疗中起到积极的作用,但是实际上最大的问题在于实验室研究所用的二甲双胍浓度远大于临床体内的二甲双胍治疗浓度。而且,并不是所有的癌症类型或亚型对二甲双胍的治疗产生同样的效应。目前并没有明确的证据证明二甲双胍可以作为抗肿瘤的治疗手段或者辅助治疗手段应用于临床。尽管如此,大量的流行病学调查、队列研究、回顾性调查等提示的二甲双胍降低肿瘤风险、改善肿瘤预后等积极的结果仍然让二甲双胍抗肿瘤的研究有重大的临床意义。

恶性肿瘤是目前威胁人类生命健康最大的疾病。传统的化疗药物不良反应大且容易出现多药耐药现象。流行病学调查显示二甲双胍可以降低多种肿瘤发病率并能改善T2MD合并肿瘤患者的预后。大量的实验证明二甲双胍有抑制肿瘤细胞增殖甚至可以杀伤肿瘤细胞的功能。这些结果都显示了二甲双胍有作为抗癌药物或者辅助抗癌药物的美好前景。本文综述了二甲双胍抗肿瘤分子机制的研究进展。二甲双胍主要通过影响AMPK、mTOR和胰岛素/IGF三条信号通路在不同的肿瘤细胞中产生不同程度的抗肿瘤作用,并能通过影响ABC转运体的表达逆转多药耐药现象。虽然二甲双胍的抗肿瘤机制研究仍然存在明显的不足,相信随着研究水平的提高,在对二甲双胍的抗肿瘤机制进行更深入透彻的了解后可以帮助二甲双胍真正在临床上起到理想的抗肿瘤作用。