生物医药纳米技术是纳米科学与生命科学交汇所产生的重要研究领域, 近年得到飞速发展。据查Web of Science数据库, 截至2015年5月, 在生物医药领域有关“纳米”的论文已有6万余篇。生物医药纳米技术在基础医学、药学、临床医学和预防医学方面均有涉及, 许多实验研究已经评估了纳米材料的应用潜力^[1], 目前发展依然处于知识积累阶段, 面临巨大挑战, 尚需化学、物理、纳米技术、生物技术、药学和医学等领域的研发人员协同攻关。

2014年6月美国食品药品监督管理局 (FDA) 发布纳米技术产品指南性文件, 将至少在一个维度上尺寸小于100 nm的人造粒子定义为纳米材料, 同时将尺寸小于1 μm但能表现出纳米颗粒性质的材料也囊括在内^[1]。一些备选纳米材料的结构单元不仅具有比细胞更小的体积, 同时具有腔−壳结构, 所以是理想的微载体。经改造后, 其光、电、磁和热等方面的物理特性不仅为操控这些微结构提供了宏观手段, 也为观察纳米颗粒同机体的相互作用提供了信号媒介。生物纳米材料在诊断、治疗、修复或替换病损组织、器官以及增进生物体功能等方面发挥着不可忽视的作用。

纳米材料的出现为医学检测技术带来了革命性的进步, 成为当前人们普遍关注的前沿领域之一。纳米诊断是利用纳米技术极高的传感灵敏效应对疾病进行早期诊断。这就要求被检测分子能与纳米粒作用并产生较强的信号, 以便对样品进行检测^[2]。

纳米材料在生物医学成像应用中表现出许多优良的物理特性。在纳米成像领域, 生物分子包被的小型超顺磁性氧化铁纳米颗粒已被广泛用作磁共振成像 (magnetic resonance imaging, MRI) 造影剂, 进行癌症成像检测, 有助于提供解剖学细节以及实现对治疗的实时监控。与传统的诊断方法相比, 可以提前 (几个月或几年) 发现一些癌症细胞, 纳米成像技术也可用于化疗后对残余或转移的癌细胞检测^[3]。

蛋白质在构建健康及病变生物组织中均发挥着核心作用, 因此, 蛋白质组学在疾病诊断和药学领域极其重要。蛋白质芯片是近几年发展起来的一种技术, 可以同时检测上百种蛋白质的表达水平。目前全球主要有两大公司致力于蛋白芯片的开发, 其中安捷伦公司主要采用喷墨打印化学原位合成技术 (ink-jet chemical in situ synthesis), 在纳米尺度下, 非接触式的探针合成技术保证了每一个基因探针样点的制作准确度。NanoInk公司使用原子力显微镜的纳米刻蚀技术 (dip pen nanolithography, DPN), 通过对被转移材料或物质的精确控制, 可以在衬底表面构造出任意的纳米结构^[4]。

目前对利用量子点的荧光效应、磁性纳米材料的磁效应的纳米探针研究较为广 泛, 其中半导体纳米粒 (量子点) 有望取代传统的生物荧光标记物, 如一种由超顺磁性氧化铁和近红外荧光染料组成的双模态纳米探针逐渐发展起来^[5]。由于细胞免疫疗法成功与否很大程度上与树突细胞是否导向至引流淋巴结有关, 该新型的荧光磁性纳米探针可用来追踪体内树突细胞导向到淋巴结的迁移过程, 具有磁性和光学对比的特点, 可在临床上用来评价肿瘤免疫治疗的疗效。

DNA电化学传感器为检测由基因突变引发的疾病提供了灵敏度高、特异性强和成本低的方法^[6]。所有这类传感器都是基于溶液、识别层及固体电极表面之间纳米尺度下的相互作用, 创新之处在于传感器的电化学作用方式。Alharbi等^[7]遵循可重现、简单及快速的原则, 利用纳米传感器明确解析了DNA上所有可能引发严重凝血障碍的三段基因序列。

稀少细胞是异于周围生理条件下正常细胞的罕见细胞, 如肿瘤细胞、异型淋巴细胞、胎儿细胞和艾滋病毒感染T细胞, 是检测和诊断各种遗传缺陷的重要标志物。但识别并分离这些细胞极具挑战性, 而利用稀少细胞在形状、表面电荷及与特异性受体 (配体) 亲和力方面表现出独特属性, 纳米技术实现了将稀少细胞从血液和其他组织中有效分拣。康奈尔大学纳米生物技术中心目前正在应用这些技术开发新型的诊断方法。

随着纳米材料和纳米技术的进步,“魔弹”的概念也逐渐进入了药学领域, 并发展成纳米药物递送系统 (nanodrug delivery system , NDDS) (表 1), 标志着药物制剂研发进入了创新时代。首先, 通过将药物纳米化, 可以显著改善药物的溶出, 提高药物的生物利用度。其次, 纳米药物可绕过某些生理屏障, 分布范围更广, 增强了药物利用效率。再次, 利用纳米材料作为药物递送载体可增加药物对肿瘤组织的靶向性。脂质体是第一批被应用到临床的纳米药物递送载体, 随后又出现了纳米粒、纳米胶束、纳米混悬剂、纳米囊、纳米乳以及纳米晶等。其中微胶粒是一种新型的纳米载体, 通过将药物与治疗型抗体结合成抗体−药物偶联物或纳米−白蛋白结合物, 能更有效地将活性成分递送到靶部位并从包囊结构中释放到相应的介质^[8]。

表1(Table 1)

Table 1 纳米药物递送系统上市制剂。PEG: 聚乙二醇; PLA: 聚乳酸 产品 (公司) 载体 主药 适应证 批准年份 DepoCyt® (Pacira) 脂质体 阿糖胞苷 脊膜瘤 1999 Myocet® (Cephalon) 脂质体 多柔比星 乳腺癌 2000 Mepact® (Takeda) 脂质体 米伐木肽 骨肉瘤 2009 Marqibo® (Talon) 脂质体 长春新碱 急性淋巴样白血病 2012 Abraxane® (Abraxis/Celgene) 白蛋白纳米粒 紫杉醇 乳腺癌; 胰腺癌; 非小细胞肺癌 2005 Ontak® (Eisai Inc) 免疫融合蛋白 白细胞介素-2融合毒素 T细胞白血病 1999 Zoladex® (AstraZeneca) 乳酸−乙醇酸交酯共聚物 戈舍瑞林 前列腺癌; 乳腺癌 1990 SMANCS® (Yamanouchi Pharma) 蛋白−苯乙烯马来酸聚合物 净司他丁斯酯 肝癌; 脑癌 1994 Oncaspar® (Enzon/Sigma-tau) PEG−蛋白共聚物 左旋天冬醯胺 白血病 2006 Genexol-PM® (Samyang Biopharm) PEG-PLA多聚体胶束 紫杉醇 乳腺癌; 肺癌; 卵巢癌 2007 Zevalin® (Cell Therapeutics Inc.) 放射−免疫结合物 放射性同位素钇90和CD20单抗组成 非霍奇金淋巴瘤 2002 Bexxar® (Corixa) 放射−免疫结合物 碘-131与 CD20抗体结合 惰性淋巴瘤 2003

Table 1 纳米药物递送系统上市制剂。PEG: 聚乙二醇; PLA: 聚乳酸

当前基因治疗的困难在于递送效率低且无导向性, 而使用病毒载体具有潜在的风险。为了合理设计定向整合的载体, 研究者将纳米技术引入人类基因治疗, 应用非病毒型的纳米颗粒载体递送质粒DNA已经取得成功, 为基因治疗提供了极具潜力的应用前景。如Chen等^[9]将pH敏感材料环糊精和低分子量的聚乙烯亚胺整合成纳米载体, 并负载寡聚核苷酸, 该载体可以有效地转染人肺腺癌细胞, 并对肿瘤生长、Bcl-xl/mRNA/蛋白质的表达抑制效能显著, 可加速细胞凋亡。

最近几年纳米技术在牙科复合材料、玻璃−离子黏固剂、牙髓密封材料和牙齿再造方面均得到广泛应用^[10]。纳米填充材料和纳米杂化物是两种最常用的纳米材料。纳米填充材料粒径主要分布在1～100 nm, 而纳米杂化物是由0.4～5 μm的颗粒组成, 如市售产品NANOSIT^TM是一种粒径在7～2 000 nm的无机光固化复合充填树脂, 主要用于各类孔洞填充, 可有效增加填充密度。另一种上市纳米填料3MESPE^TM由纳米树脂颗粒和纳米簇组成, 具有与牙釉质近似的耐磨耗性。

尽管医疗机器人预期无法在短时间内应用于口腔的治疗, 但目前也并不能忽略其巨大的应用潜力。牙科纳米机器人通过执行特定的移动程序, 能以最快10 μm·s⁻¹速度移动, 通过在牙龈上下表面移动清洗牙齿的咬合面, 防止牙石的积累^[11]。

随着纳米技术在诊断、成像和组织工程治疗中的应用, 研究者可在细胞水平探求有效治疗各种心血管疾病的手段, 如小型的纳米传感器, 包括量子点、纳米晶体和纳米条形码等, 能监测和响应由心脏或炎症反应所产生复杂的免疫信号, 以此检测各类心脏疾病并研究其发病机制^[12]。在治疗方面, 纳米技术在动脉粥样硬化治疗中尤其引人关注, Peters等^[13]合成一种纳米级别的微胶粒, 携带了抗凝药物比伐卢定和靶向因子融合蛋白, 以纤维蛋白为治疗靶点执行抗凝功能。

粒径在1～100 nm的有机和无机纳米材料可用于构建新型功能性骨成分, 如纳米聚合物、纳米碳纤维、碳纳米管和陶瓷纳米复合材料能起到增加含钙矿物质在植入部位的沉积作用, 通过增强骨细胞的相互作用可改善植入物与周围骨组织的连接, 这将有助于改善整形外科植入手术的预后, 大幅度改善患者的顺应性。Wang等^[14]用甲基丙烯酰氧基硅烷作偶联剂修饰羟基磷灰石 (hydroxyapatite, HAP) 纳米颗粒的表面, 制成纳米纤维网状复合支架。其压缩模量及对蛋白质的吸附性优于单纯HAP纳米材料, 是一种增加骨植入物生物活性的有效方法, 可用于骨组织工程及承载骨的修复。

随着纳米技术在生物医药领域的应用, 有关纳米材料潜在的安全性问题受到人们关注。大量研究证明, 纳米粒会与生物大分子和细胞发生作用, 引起严重的毒性反应。近年来, 绝大多数研究都集中在金属纳米粒、碳纳米粒 (纳米管、活性碳和富勒烯)、氧化物纳米粒和陶瓷纳米粒等材料对生物和环境的危害上, 试图揭示毒性原因并寻求减毒的方法。

当前许多研究者从纳米材料的形状、尺寸、表面电荷、表面官能团、反应活性及在生命系统中的稳定性入手, 试图通过化学修饰或物理处理来降低某些纳米材料的毒性^[15], 但由于不能从根本上改变材料的特性, 收效甚微。

Drezek等^[16]曾针对目前对不同粒径的金属纳米粒、金属氧化物纳米粒、碳纳米粒和陶瓷纳米粒等材料大范围研究提出过质疑。Keck等^[17]认为与专门从事药物递送系统研究的药剂学工作者不同, 许多生物纳米材料的开发者来自其他领域, 往往对外源物在生物体内的处置规律缺乏了解, 以致于将碳纳米管 (carbon nanotubes, CNTs) 等类材料应用于药物递送, 大量研究表明CNTs将会永远滞留在体内, 并且没有治疗的手段, 将会产生类似石棉纤维的危害^[18], 但到目前为止, CNTs等不可降解的纳米材料仍在作为药物递送载体进行开发。

由于纳米材料毒性实验结果难以重现, 采用经典化学毒理学原理与方法解决纳米毒性问题几乎一筹莫展^{[19, 20]}。尽管主流观点认为纳米毒性源于尺寸效应和表面效应, 但此结论面临3大问题^[21]: ① 量−效关系不明确; ② 毒性效应属非特异性; ③“尺寸效应”不具普适性。Norppa等^[22]认为将纳米毒性笼统地归咎于颗粒尺寸并将纳米载体贴上有毒的标签是极其武断的。研究表明纳米粒引发的毒性效应往往以 氧化应激或炎症反应为表现, 但目前并没有任何证据证明粒子的尺寸降低到100 nm, 其毒性会发生质变^[23]。

许多纳米生物材料尽管拥有优良的性能, 但由于在设计之初对生物安全性缺乏认识, 也未充分考虑到后期可能出现的毒性问题, 使得大量研究只停留在实验阶段, 不能创造真正的产业价值。对于纳米粒生物毒性产生机制的迷茫, 导致对纳米毒害的种种困惑与恐惧, 成为生物医药纳米技术发展迟缓的重要原因。有人指出^[24], 想要推动纳米技术在医药领域应用发展, 解决纳米材料生物毒性难题是必经之路, 需要政府部门、公司机构和研究团体一起努力, 共同迎接挑战。

针对纳米材料生物毒性的困惑, 作者系统研究了生物系统的结构特点与运行规则, 揭示了水介质中溶质分子以及物理颗粒的化学和物理学性质与运动规律, 以及与生物体之间的相互作用方式, 提出了“纳米毒性的本质是物理损伤”新学说: ① 生物体是分子建筑, 生命的本质是水中的有序化学运动。生物膜内外的物质交换是基于溶于水中的分子, 对分子质量有明确的要求, 通常需小于500道尔顿, 因此, 那些不溶于水的刚性纳米粒在生物体内缺乏合法存在的空间与转运途径; ② 生命运动的一切过程均基于分子与分子之间的相互作用, 物理粒子不能参与此过程。因此, 纳米粒与生物系统之间没有相应的作用位点和直接的生物学效应; ③ 纳米材料不同于独立化学分子, 在水介质中不具溶质分子的依数性, 在水介质中缺乏扩散平衡动力, 所以其在生物体内不能遵循化学分子的ADME (absorption、distribution、metabolism、excretion) 规则; ④ 生物相容性与生物可降解性是生物体内物质交换、代谢平衡的前提。机体清除、分解内源及外源颗粒 (衰亡的细胞、变性的大分子、病毒、细菌等) 的机制与途径, 只能有效清除生物相容性、生物可降解性的粒子; 而对于生物不相容性、不可生物降解的粒子而言, 机体不仅不能消化, 而且不能有效排出体外; ⑤ 纳米尺寸的“相当相应”(like interfere with like) 原理^[26]: 即空间体积相当或空间互补的纳米结构之间易于产生接触扰动的相互作用, 如: 卡嵌、栓塞、黏附和聚集等。具体而言, 纳米尺寸的确是影响其毒性的因素之一, 但这种“尺寸效应”本质上是因为纳米颗粒的尺寸与生物大分子、细胞器与细胞膜的基本单元结构处在同一数量级水平上, 具备了发生相互扰动作用的基础。

纳米材料与生物体的相互作用符合“相当相应”规则, 对于生物相容和生物可降解性的粒子而言, 由于生物系统内具有清除、分解这类颗粒的能力, 所以这种接触扰动作用的影响是可逆的、可消除的; 而对于生物不相容性、不可生物降解的粒子而言, 由于体内不具有清除、分解这类颗粒的能力, 所以这种接触扰动作用的影响是破坏性的、持续的且累积的。

综上所述, 可以认为经典化学毒理学原理与方法不适合研究和评价纳米材料的生物毒性。经过系统的理论证明和实验研究, 证明了“纳米材料生物毒性的本质是源于不可生物降解、生物不相容性纳米材料与生物体相互作用导致的物理损伤”的新机制, 即刚性纳米粒与生物大分子、细胞器和细胞间的相互作用, 造成生物体的微结构改变或破坏, 其直接作用是物理损伤, 由物理损伤诱发的生化反应 (毒性效应) 现象是后效应。“纳米毒性源于物理损伤”学说对于纳米技术在生物医药领域的应用具有重大科学意义与应用价值, 为安全纳米药物载体的设计与应用提出了明确的科学依据。此观点一旦被广泛认识和接受, 将使生物医药纳米技术研究走出误区, 实现良性发展, 也可望改变政府部门对纳米医药发展的政策导向。

2013年第一届国际纳米医药转化大会发布消息, 全球每年约有180亿美金投入到纳米药物领域, 然而近10年推向市场的产品寥寥无几, 除了毒性的争议, 工艺流程也存在诸多瓶颈^[26]。

与生物工程和化学合成不同, 生物纳米颗粒的制备是物理过程, 颗粒中材料分子与活性物分子间有无数的排列组合方式, 而制备过程无法用简单的方法进行监测, 随工艺条件的变化, 具有很大的不确定性, 精确调节和控制各个组分剂量比以及粒子的形态和粒度等都须基于分子药剂学层面的设计与计算, 传统经验模式早已不再适用。

大规模生产中, 制造成分准确、粒度均匀和表面功能团稳定的高质量微粒工艺设计复杂, 产品重现关键技术环节多, 往往牵一发而动全 身, 尤其是纳米载体制剂, 需要对每个批次产品工艺条件与理化性质进行严格监控。如强生公司曾遭遇的阿霉素脂质体Doxil^®的短缺危机^[27], 由于设备、原材料等原因致使产品无法重现而不合格, Doxil^®不得不在2011年11月暂停生产, 但由于制备过程复杂, 直到2014年才完成生产工艺的转变, 对依赖于Doxil^®药物的患者造成极大影响。

一个生物纳米材料研究成果的数量在实验室可能只是1克, 到了工业化生产阶段可能以“吨”计算。而从1克到1 000克再到1吨, 每一个数量级阶段都需要有相应的设备、辅料及不同的工艺参数。如脂质体、微粒体等纳米制剂由于属于多组分、多相系统, 涉及多相搅拌、挤压和过膜等多单元的操作, 在工艺放大过程中受设备、操作条件和工艺参数的影响很大, 各成分之间的相互作用和物理状态变化程度难以预测, 致使工艺放大效应很强。

20世纪70年代日本丰田公司为提高汽车质量提出质量源于设计 (quality by design, QbD) 的理念, 随后美国FDA及各大医疗企业也将QbD理念贯穿到药品研发的全过程。生物医药纳米材料的开发也需要以QbD为指导。生物纳米材料的制备主要采用物理化学的方法构建药物与材料分子之间的特定空间结构关系。对纳米材料的分子结构、理化性质及生物学特性的充分认知应作为设计研发的起点。

将生物纳米材料和药物本身的属性看作内因, 工艺作为外因, 物质一切变化都源于其自身的属性规律, 而工艺控制就是通过改变环境来创造一个适合药物分子和材料分子相互结合的条件以达到目标, 而控制手段主要是基于化学动力学和化学热力学。以Celsion公司委托本实验室开发的多柔比星热敏脂质体Thermo Dox^TM工艺为例^[28], 通过基于分子水平的理论分析、处方设计和科学计算, 通过化学动力学、热力学进行工艺控制, 克服了载药量低、稳定性差和重现难等诸多技术壁垒, 不仅放大工艺重现性好, 而且产品质量稳定。该新制剂已在美国、中国和韩国等进行多中心 Ⅲ 期临床试验。

评价能力是制约生物纳米材料应用的另一重要因素, 建立基于分子水平、细胞水平、组织水平乃至整体动物的体内外评价系统也至关重要。

总之, 生物医药纳米技术的产业化是一项系统工程。推动纳米技术在生物医药领域的发展需要生物医学、药学、物理化学、分析化学、材料学、分子药剂学和过程工程学等学科理论为基础, 综合运用现代生物医学技术、物理化工技术和精密制造技术, 按照明确的预定目标进行设计、开发、管理与控制。

纳米技术发展至今, 已带来巨大技术进步和经济效益, 2015年市场份额预计将达到2.5万亿美元^[29]。纳米技术在生物医药领域的应用具有巨大潜力, 大量的基础研究成果预示其在药物递送、生物成像和生物传感器等方面将产生巨大优势。研究纳米毒性的根源对纳米载体安全设计有重要意义, 在分子水平对纳米生物材料进行设计和质量控制是实现产业化的必由之路。切不可由于对纳米材料生物毒性的误解而停滞不前。