制粒是制备颗粒剂、胶囊剂和片剂等剂型的基本工艺过程, 通过制粒将粉末、熔融液和水溶液等状态的物料加工制成具有一定形状与大小的粒状物, 以改善药物粉末的流动性, 防止各成分的离析; 保持多成分的混合均匀性, 防止粉尘飞扬及器壁上的黏附, 调整堆密度, 改善溶解性能等^[1]。制粒方法分为湿法制粒、干法制粒、喷雾制粒及液相中球晶制粒等方法, 而湿法制粒根据其工艺与设备不同又分为高速搅拌制粒、流化床制粒、转动制粒、摇摆式挤出制粒及挤出滚圆制粒等^[2]。即便是同样的处方, 不同的制粒工艺所制得的颗粒往往在外观形态、内部结构和粉体学性质上存在差异, 从而影响其崩解性、溶解性和药效。现有技术手段一般通过所获得的图谱对颗粒的表面形态、颗粒中各成分的相互作用及颗粒的二维结构进行描述, 对于颗粒内部精细结构的复杂性和不规则性缺乏高精度的定量表征方法, 如扫描电子显微镜和原子力显微镜等仅对颗粒的表面形态及结构进行表征^[3,4,5]; 粉末X射线衍射、差示扫描量热及傅里叶变换红外光谱法^{[6, 7]}分析表征颗粒结构对物性的影响; 拉曼光谱法可用于动态描述颗粒的形成过程和组成^[8]。

同步辐射显微CT (synchrotron radiation X-ray computed micro tomography, SR-μCT) 技术采用具有高亮度、高光子通量、高准直性、高偏振性及准相干性等优异特性的同步辐射X射线为光源, 实现高分辨率、高区分度和快速的三维结构信息采集, 用于制剂粉体和制剂结构表征具有独特优势。利用SR-μCT成像, 可原位无损伤地观测药剂学粉体、制剂的静态形貌及内部精细结构^{[9, 10]}, 结合三维重建与定量分析技术, 获取的定量结构参数可对颗粒的立体形态进行定量表征。

中药颗粒由于其成分复杂、成分间物理化学性质差异大, 结构形态复杂、不规则, 常规的单一几何变量仅能从某一特定角度反映其形态特征, 难以准确定量描述。分形本意为不规则的、分数的和支离破碎的物体, 分形的两个重要特征是无标度性和自相似性。在分形理论^{[11,12,13,14]}中, 分形维度是一个非常重要的参数, 适用于定量表征自然界物体的形态变化和复杂性, 对物体的不规则程度高度抽象成一个非整数的维度参数“分形维度”(D_f), 为表征颗粒的复杂结构提供了有效的工具。

本文主要对摇摆制粒、流化床制粒和搅拌制粒等湿法制粒工艺制备的中药颗粒, 通过同步辐射显微CT对其内部精细结构进行研究, 获得各组颗粒的高精度的图像数据, 进行三维形态的结构重建和定量。计算颗粒的实体和表面的分形维度, 以分形维度为基本评价指标, 可视化地揭示不同制粒方法对颗粒结构与形态的影响, 为颗粒表征及工艺评价提供新方法。

仪器 MINI GLATT实验型流化床 (德国格 兰特公司); YK-60摇摆制粒机 (中诚制药机械厂); HLSH2-6湿法混合制粒机 (北京航空工业研究所); 粉末BT-1000型粉体综合特性测定仪 (百特仪器有限公司); Accupyc II 1340密度仪 (美国麦克仪器公司); 粉体流动性测定仪 (德国ERWEKA公司); SR- μCT图像采集在中国科学院上海应用物理研究所上海光源BL13W1实验站进行; 相位恢复及三维重建软件X-TRACT (Version 8.1, CSIRO澳大利亚联邦 科学与工业研究组织); 图像处理软件为Image-Pro Analyzer 3D (7.0版, 美国Media Cybernetics公司); 统计分析软件为Matlab (R2012a版, 美国MathWorks公司) 和SPSS (19.0版, 美国IBM公司)。

制备方法 按《中国药典》2010年版一部健胃消食片处方和工艺制得浸膏。

摇摆制粒 (pendular granulation, PG) 将健胃消食片按照《中国药典》提取所得的浸膏和粉碎的山药与糖粉和糊精混匀, 采用湿法摇摆制粒, 所得颗粒于60 ℃烘干2 h, 整粒。

高速搅拌制粒 (high speed stirring granulation, HSSG) 将健胃消食片按照《中国药典》提取所得的浸膏和粉碎的山药与糖粉和糊精放入湿法混合制粒机中, 启动搅拌桨和切碎刀, 将物料干混2 min后, 加入30% 乙醇, 继续切割搅拌4 min, 出料, 60 ℃烘干2 h, 整粒。

流化床制粒 (fluidized bed granulation, FBG) 将健胃消食片按照《中国药典》提取所得的浸膏和粉碎的山药与糖粉和糊精混匀, 放入流化床内, 于流化状态下预热, 达到设定温度后启动蠕动泵喷入30% 乙醇流化制粒, 流速控制在1.0～1.5 mL·min⁻¹内, 喷枪压力0.5～0.66 bar, 制得颗粒。

颗粒粉体学性质测定

松密度和振实密度 采用粉末综合性测定仪测定, 取一个已称重的100 mL圆柱形钢筒, 用漏斗匀速注满待测颗粒, 精确称重, 减除钢筒的重量, 即得填充颗粒重量, 重复测定3次, 取平均值, 计算颗粒松密度。将上述装有一定体积粉末的钢筒, 以25 Hz·min⁻¹振幅振动5 min, 最终体积为100 mL, 记录振实后重量, 减除钢筒的重量, 即得填充颗粒重量, 重复测定3次, 计算振实密度, 并根据公式 (1) 计算出压缩度。

$C = \frac{{{\rho _p} - {\rho _a}}}{{{\rho _a}}} \times 100\% $ (1)

式中C为压缩度, ρ_a为松密度, ρ_p为振实密度。

颗粒真密度 精密称定9.0～15.0 g样品置于铝盒中, 用校正后的真密度测定仪进行测定。设定参数条件为常温, 载气为氦气, 吹扫5次, 测定真体积, 根据质量计算真密度 (ρ_t)。

孔隙率 利用Image-Pro Analyzer 3D软件进行三维重建后, 可定量得到颗粒内部孔隙和颗粒的体积, 并根据公式 (2) 计算孔隙率 (e)。

$\varepsilon = \frac{{{V_0}}}{V}$ (2)

式中, V₀为孔隙体积, V为总体积。

休止角 采用粉末流动性测定仪, 选定内径为f 10 mm的漏斗, 测定3种方法制得颗粒的休止角, 重复测定3次, 求出平均值即为颗粒的休止角 (α)。

颗粒外观 分别取3种制粒方法所得颗粒, 筛分, 得到粒径在60～80目之间的颗粒, 用无水乙醇分散, 置于显微镜低倍镜 (×80) 观察颗粒形态。

同步辐射显微CT 取3种制粒方法所得颗粒, 过筛, 取60～80目粒径的颗粒备用。称取筛分后的颗粒约5.0 mg置于明胶胶囊内, 同时加入共聚维酮 (300目) 约10 mg作为稀释剂, 摇匀, 使颗粒与共聚维酮粉末充分混匀, 避免颗粒间黏连。振实胶囊内的样本, 内容物高度小于3.5 mm。参考前期同步辐射 光源显微CT成像^[15]经验, 经对比性预实验, 针对本文低密度、弱吸收的颗粒样品, X射线能量优选为13.0 kev。X射线穿过样品后经YAG∶Ce闪烁体将光束转变为可见光, 然后利用分辨率为2 048 × 2 048像素的高分辨CCD照相机采集光信号, 形成一系列透射投影图, 所得图像的像素大小为3.7 m, 曝光时间为1 s, 样品到检测器之间的距离为8 cm, 每次扫描得到720张投影 (每张0.25°, 共180°), 同时采集两张背景图像 (样品移除视窗) 及暗场图像 (关闭射线), 以矫正电子噪声优化图像清晰度。

三维重建 对CT扫描采集到的二维透射投影图像分析, 经过优化、降噪、着色和分割等处理后, 实现对成像效果的初步评价及成像参数的优化。同时, 经过背景校正和降噪处理后, 获取样品不同部位对X射线的吸收情况, 定性比对不同样品结构上的差异。基于不同角度的一系列二维投影图像, 采用X-TRACT软件滤波反投影算法模块, 进行重构处理, 得到Slice切片图像^{[16, 17]}。利用Image-Pro Analyzer 3D分析软件对Slice图像进行降噪、优化处理后, 提高不同物质、密度区域的区分度, 采用基于体素的三维方法构建立体结构模型, 计算三维结构参数, 包括体积、表面积、比表面积、孔隙率及球形度等, 实现对目标模型的定量表征。

分维分析 因为盒维数算法^[18]概念比较清晰, 计算相对简单, 对于是否具有自相似特性的图像均适用, 且与经典几何之间有很强的相关性, 使其广泛地应用于分形维度的计算。计算^[19,20]步骤如下: ① 使用Image Pro Plus分析软件对断层扫描图片进行三维重构, 得到其3D Mask图像; ② 利用Sobel算法进行边缘提取, 以获得三维表面结构; ③ 利用盒维数算法, 分别计算实体分形维度和表面分形维度等分形参数。

统计学方法 采用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计学分析, 各组数据间进行差异性和相关性分析。

不同工艺制备的颗粒的真密度 (true density, ρ_t)、振实密度 (tap density, ρ_p)、堆密度 (bulk density, ρ_a)、压缩度 (compressibility, C) 及休止角 (angle of response) 结果表明, 3种颗粒在真密度、振实密度及堆密度上不尽相同, 在压缩度及休止角上差异也较大 (表 1), 不同工艺方法导致同样处方的颗粒内部空腔数量与大小及外部形态存在一定差异。3种颗粒的休止角大小顺序为PG > FBG > HSSG; 压缩度大小顺序为PG > HSSG > FBG; 真密度的大小顺序为PG = HSSG > FBG; HSSG颗粒与FBG颗粒的振实密度和堆密度基本无差异, 但是明显大于PG; 真实密度与振实密度之差的大小顺序为PG > HSSG > FBG; 振实密度与堆密度之差的大小顺序为PG > HSSG > FBG。

表 1(Table 1)

Table 1 Characterization for the density, porosity and angle of response of granules by conventional measurements. n = 10, x ± s. HSSG: High speed stirring granulation; PG: Pendular granulation; FBG: Fluidized bed granulation Measurement HSSG PG FBG True density/g·cm−3 1.52 ± 0.00 1.52 ± 0.00 1.47 ± 0.01 Tap density/g·cm−3 0.74 ± 0.00 0.62 ± 0.01 0.74 ± 0.01 Bulk density/g·cm−3 0.60 ± 0.01 0.47 ± 0.03 0.62 ± 0.01 True density-tap density/g·cm−3 0.78 0.90 0.73 Tap density-bulk density/g·cm−3 0.14 0.15 0.12 Compressibility/% 18.5 ± 0.06 24.7 ± 0.03 15.8 ± 0.01 Angle of response/° 36.4 ± 0.15 44.8 ± 0.01 42.9 ± 0.01

Table 1 TCharacterization for the density, porosity and angle of response of granules by conventional measurements. n = 10, x ± s. HSSG: High speed stirring granulation; PG: Pendular granulation; FBG: Fluidized bed granulation

从上述结果可以看出, PG颗粒的休止角、压缩度、振实密度和堆密度都明显区别于HSSG颗粒和FBG颗粒。休止角在一定程度上可以反映颗粒的流动性, 休止角的大小与摩擦力和球形度有关, 对于越复杂越不规则的颗粒, 休止角越大, 流动性越差, 流动性顺序为HSSG > FBG > PG; 压缩度、真实密度与振实密度之差在一定程度上可以反映颗粒之间的空隙, 同时也可以在一定程度上反映颗粒的三维形态及其复杂性。此结果也证明了PG颗粒的三维形态的复杂性和粗糙性, 真实密度与振实密度的差值越大, 颗粒的表面不规则程度越高; 振实密度与堆密度之差则反映了颗粒内部与颗粒之间的空腔总和, 差值越大, 颗粒内部与外部的空腔体积越大。

在低倍镜下观察3种颗粒的外观形态可知, HSSG大部分呈球形, 表面相对比较光滑, 而用PG得到的颗粒多为不规则形状, 颗粒间的接触点数较多, 附着力和凝聚力较高, PG流动性较差 (图 1)。

Figure 1 Shapes of the granules prepared by different technologies. A: Granules prepared by high speed stirring granulation; B: Granules prepared by pendular granulation; C: Granules prepared by fluidized bed granulation

3种颗粒的CT扫描采集到的二维透射投影图像, 经过反投影算法重建处理获得的二维切片图像显示, HSSG方法制备的颗粒表面相对平滑, 颗粒内部存在大量空腔; PG法制备颗粒形态相对不规则且表面粗糙, 内部同样存在少量空腔; FBG法所得颗粒的形态结构介于上述两种制粒方法得到的颗粒之间, 类似于两种颗粒的混合体系 (图 2)。

Figure 2 The 2D slice pictures of three different granulating process of particles. A: Granules prepared by high speed stirring granulation; B: Granules prepared by pendular granulation; C: Granules prepared by fluidized bed granulation

从3组样本中各随机挑选10个颗粒, 利用Image- Pro Analyzer 3D分析软件, 分别对各个颗粒进行3D重构 (图 3, 上图), 计算其结构参数, 实现对目标模型的定量表征, 并进行半透明处理显示内部空隙结构细节 (图 3, 下图)。

Figure 3 The 3D structural models (upper segment) and the semi-transparent models (lower segment) for the granules prepared by three granulation processes. A: Granules prepared by high speed stirring granulation; B: Granules prepared by pendular granulation; C: Granules prepared by fluidized bed granulation

通过三维可视化分析看出, HSSG得到的颗粒表面较光滑且呈球状; PG颗粒表面较粗糙。3种颗粒的内部均存在空腔, 经HSSG得到的颗粒, 内部空腔较多, 球形度最好; PG得到的颗粒形状扁平且更不规则; 而FBG颗粒的可视化的结构介于前两者之间, 与之前二维切片图的结论一致。

利用三维重建技术, 定量分析可得到颗粒的三维立体结构参数包括: 体积、表面积、比表面积 (SSA)、孔隙率、球形度、Feret比、半径比和盒比等 (表 2)。其中, 孔隙率反映颗粒内部空腔的多少, 与前述Slice图像及粉体学性质所反映的结果一致。Feret比是指在粒子的投影面上按一定方向画出外切平行面, 其平行面间的最大和最小距离之比; 半径比和盒比可以反映颗粒接近球形的程度。通过三维重建得到结构的定量参数, 其中球形度越高说明颗粒的三维形态更圆整、表面更平滑; 半径比和比表面积越大, 表明颗粒表面越粗糙。数据表明, 3种颗粒比表面积和半径比符合PG > FBG > HSSG, 球形度和孔隙率符合HSSG > FBG > PG。压缩度测定是通过振动自然堆积状态下的颗粒群, 使得体系内的颗粒间相对位置通过自适应调节在一定程度上降低颗粒间空腔, 而振动操作前后的相对体积差即为压缩度, 其大小主要由颗粒的形貌特征决定。比表面积、半径比及球形度等三维结构定量参数均表明HSSG法制备颗粒具有规则、圆整的三维形貌, 且表面光滑, 相应的PG法制备颗粒则形态极其不规则、表面粗糙、存在大量凸起及凹陷结构, 从而导致颗粒间摩擦力、彼此间容易发生咬合, 宏观表现即自然堆积状态下颗粒间空隙大、流动性差, 与休止角、压缩度和堆密度测定数据一致。

表 2(Table 2)

Table 2 Structural parameters of the granules calculated by three-dimensional reconstruction technology. n = 10, x ± s Structure parameter HSSG PG FBG Area of surface /μm2 2 814.4 ± 1 965.6 5 187.8 ± 3 773.3 5 615.7 ± 3 860.9 Volume/μm3 4 999.7 ± 3 521.1 4 969.9 ± 3 535.0 6 664.4 ± 5 018.0 Specific surface area/μm−1 0.15 ± 0.03 0.29 ± 0.04 0.24 ± 0.05 Box ratio 1.37 ± 0.26 1.33 ± 0.26 1.37 ± 0.23 Sphericity 0.55 ± 0.13 0.29 ± 0.06 0.33 ± 0.09 Radius ratio 5.64 ± 1.99 11.14 ± 12.98 9.19 ± 5.94 Feret ratio 1.61 ± 0.19 1.72 ± 0.20 1.64 ± 0.21 Porosity 0.026 ± 0.014 0.004 ± 0.002 0.011 ± 0.007

Table 2 Structural parameters of the granules calculated by three-dimensional reconstruction technology. n = 10, x ± s

实际应用中的颗粒结构往往十分复杂, 如3种工艺制备的颗粒虽均经过60～80目过筛以确保粒径的颗粒样本尺寸具有可比性, 三维定量结果显示, 过筛后所得颗粒的粒径分布范围也依然较广, 其立体体积与表面积参数数值分布范围也较广。筛网的目数是指筛网单位面积的孔数, 所筛分颗粒的粒径平行于筛网的孔径, 该粒径忽略了颗粒三维立体特征, 为颗粒垂直于筛网方向的表观粒径, 以此粒径估算的颗粒体积也是忽略了其内部空腔结构的表观体积。而通过高分辨同步辐射显微CT结合三维重建获得的体积和表面积是颗粒真实的体积, 相关定量参数能够客观准确地反映颗粒的三维结构特征。

通过传统常规颗粒评价方法所得的参数如压缩度和真实密度等, 虽然可以在一定程度上对不同工艺条件下得到的颗粒体系进行评价, 但无法明晰工艺条件影响颗粒性质的机制。如压缩度只能反映颗粒间的空腔大小, 无法得到颗粒内部真实空腔的体积。故对得到的二维Slice图像进行三维重构, 得到颗粒的三维结构形态, 结合定量结构参数可以更好地解释宏观测量结果。对计算得到的颗粒结构参数进行组间差异性分析, 结果显示, 表面积、体积、Feret比、盒比、半径比之间无显著性差异; 球形度、比表面积、孔隙率间存在显著性差异 (P < 0.05)。从三维定量数据中可以看出不同工艺制备的颗粒在结构形态上的差异趋势, 但由于颗粒样本粒径分布范围较广, 三维形貌极不规则且颗粒间形态结构差异大, 仅仅通过这些结构参数难以对颗粒的不规则形态特征进行表征。需要建立更灵敏方法及定量参数, 实现对颗粒间不规则形貌特征的微小差别的识别。

鉴于颗粒一般的结构参数不足以对颗粒内部的精细复杂程度进行表征, 因此尝试对3种颗粒进行分形分析, 以精确表征其内部的精细复杂程度。实体分形维度 (D_f,volume) 可以反映颗粒在三维空间上的占据情况; 表面分形维度 (D_f,surface) 可以反映颗粒表面的几何特征。通过分形计算, 所得颗粒的D_f,volume和D_f,surface在各组间并无明显差异 (P值分别为0.312和0.546), 而两者的差值 (D_f,c = D_f,volume − D_f,surface) 在不同工艺所得颗粒之间存在明显区别 (表 3), 同时针对D_f,c , 3种工艺制备颗粒间差异性显著 (P < 0.001, F = 26.48)。因此, D_f,c更能反映颗粒的三维空间复杂度, 故可基于分形维度来表征3种颗粒的差异, 可将参数作为主要评判标准, 评价颗粒剂制粒工艺。

表 3(Table 3)

Table 3 Fractal dimensions calculated based on the box counting method. n = 10, x ± s. Df,volume: Fractal dimension values of volume distribution in space; Df,surface: Fractal dimension values of the surface; Df,c: The difference between Df,volume and Df,surface Granulation process Df,volume Df,surface Df,c HSSG 2.36 ± 0.09 2.05 ± 0.11 0.31 ± 0.06 PG 2.29 ± 0.09 2.13 ± 0.09 0.16 ± 0.03 FBG 2.34 ± 0.08 2.16 ± 0.09 0.19 ± 0.06

Table 3 Fractal dimensions calculated based on the box counting method. n = 10, x ± s. Df,volume: Fractal dimension values of volume distribution in space; Df,surface: Fractal dimension values of the surface; Df,c: The difference between Df,volume and Df,surface

由于3种颗粒在球形度、比表面积、孔隙率之间均存在显著性差异, 其中比表面积的差异性最大, 因此对3种颗粒的比表面积进行分析。结果表明, 该结构参数只能在一定程度上对3种不同的颗粒进行区分 (图 4a)。而通过D_f,c可很好地将HSSG颗粒与另外两种颗粒分开 (图 4b)。其中, 个别FBG颗粒的分析结果与HSSG相近, 其原因可在Slice图像结果看出, FBG制备所得的颗粒在外观形态上类似于HSSG和PG所得颗粒的混合, 而进行同步辐射CT实验所采用的颗粒是随机选取的, 即所选取的FBG的颗粒很可能与HSSG颗粒在外观及三维立体结构上高度相似, 因此, 其分形分析的结果便落在HSSG的区域。分别计算D_f,c与球形度、比表面积和孔隙率间的相关性, 可知其与比表面积相关性最好 (图 4c, R = −0.941)。

Figure 4 Correlation analysis. a: Specific surface area (SSA) and volume; b: Fractal dimension parameter (Df,c) and volume; c: Fractal dimension and specific surface area

因此, 为了考察分形维度与颗粒的各个结构参数的相关性, 分别将D_f,volume、D_f,surface及其差值D_f,c与各结构参数进行相关性分析。结果表明, D_f,volume与体积、表面积和比表面积有相关性; D_f,surface与表面积、球形度、体积和半径比有相关性; D_f,c与比表面积、球形度和表面积有相关性 (表 4)。且颗粒的形态越不规则, 表面越粗糙, D_f,c值就越小。因此, 基于分形维度的D_f,c可以反映比表面积、球形度及表面积所包含的结构特征信息。

表 4(Table 4)

Table 4 Correlation between fractal dimension parameters and conventional geometric parameters indicated by Pearson correlation (*P < 0.05, **P < 0.01) Fractal parameter Surface Volume SSA Box ratio Sphericity Radius ratio Feret ratio Df,volume 0.51** 0.72** −0.50** 0.08 −0.02 0.30 0.05 Df,surface 0.81** 0.72** 0.33 −0.07 −0.78** 0.53** 0.08 Df,c −0.43 −0.10 −0.94** 0.16 0.93** −0.32 −0.05

Table 4 Correlation between fractal dimension parameters and conventional geometric parameters indicated by Pearson correlation (*P < 0.05, **P < 0.01)

同步辐射显微CT作为一种新型的无损伤检测手段, 不仅可以对颗粒的表面结构进行表征, 还能准确定量内部的精细空腔结构, 是颗粒结构研究的有力工具。结合统计学方法, 对获得的数据进行深度分析,

表明分形维度比常规参数更为敏感, 可以反映不同颗粒在结构特征上的微小差异, 展现了多个常规结构参数所集成反映的结构特征信息, 适合于复杂的不规则颗粒的表征。单一的结构参数不足以将颗粒区分, 而分形维度与颗粒的体积、表面积和比表面积等结构参数均具有显著的相关性, 表明其是多个结构参数的共同相关参数。通过同步辐射显微CT对颗粒进行结构重建后, 分形维度不再是一个抽象的参数, 它可以反映多个常规结构参数集成的结构特征信息。与体积、表面积等常规的结构参数相比, 本文提出的D_f,c等分形参数对颗粒结构复杂性的表征更为敏感, 反映了不同颗粒在结构特征上的微小差异, 实现对颗粒的细微内部结构的表征。为定量比较相同处方、不同工艺制备的颗粒体系的结构差异, 评价颗粒结构对其流动性、压缩度等宏观性质的影响, 提供了新的研究工具。