丁苯酞 (butylphthalide,NBP),又名芹菜甲素,是建国以来我国第4个拥有自主知识产权的一类新药。1978年中国医学科学院药物研究所从芹菜籽挥发油中分离得到左旋NBP,1980年合成了NBP消旋体,该化合物具有较强的抗脑缺血损伤作用,且毒副作用较低^{[1, 2, 3, 4]},目前已广泛应用于缺血性脑卒中的临床治疗^[5]。在临床用药过程中,丁苯酞常与多种药物联用,大大增加了药物-药物相互作用的风险。由于20世纪90年代我国药政管理部门对于新药审批所需提交资料的要求中未包括药物与代谢酶相互作用的研究数据,关于NBP与动物或人药物代谢酶相互作用的研究一直未得到充分开展,相关的文献^[6,7]报道很少。已知CYP1A2、CYP2C8/9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4/5是参与临床药物代谢的主要CYP450同工酶,可代谢95% 的临床药物。因此,本研究拟采用特异性/选择性抑制剂法鉴定参与丁苯酞代谢的大鼠和人肝脏CYP450同工酶种类、采用混合探针底物法研究丁苯酞对肝脏主要CYP450同工酶活性的影响,为丁苯酞的临床合理应用以及与其他药物的相互作用研究提供一定的参考依据。

NBP对照品由石家庄制药有限公司提供,纯度99.8% (批号CPRCL85); 地西泮对照品由中国食品药品检定研究院麻醉品实验室提供 (批号1230-9601); 氯唑沙宗 (批号084K1111)、氨苯砜 (批号40923)、右美沙芬 (批号024K1186)、非那西丁 (批号103K2519)、奥美拉唑 (批号034K1387) 对照品均购自美国Sigma公司; 双氯芬酸对照品 (批号100334) 购自中国食品药品检定研究院。地塞米松磷酸钠注 射液购自天津金耀氨基酸有限公司 (批号: 0608081,5 mg·mL^-1)。呋拉茶碱 (批号123K4700)、磺基苯吡啶 (批号054K0975)、噻氯吡啶 (批号113K0804)、奎尼丁 (批号113K2505)、戒酒硫 (批号119H0936)、酮康唑 (批号121H0524) 对照品均购自美国Sigma公司。乙腈为色谱纯,购自美国Burdick & Jackson公司; 乙醇、乙酸、甲酸、乙酸铵、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、氯化镁、蔗糖和盐酸均为分析纯,购自北京化学试剂公司; 葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶和氧化型辅酶Ⅱ购自美国Sigma公司。还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 发生系统包括34 mg·mL^-1葡萄糖-6-磷酸、10 U·mL^-1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和8.5 mg·mL^-1氧化型辅酶Ⅱ。

API-4000型三重串联四级杆质谱仪: 美国Applied Biosystems公司,配备电喷雾离子源 (Electrospray Ionization,ESI) 以及Analyte 1.5.1数据处理软件; DGU-20A型高效液相色谱仪: 日本岛津公司,包括LC-20AD型二元泵、SIL-20AC型自动进样器; CTO-20A型柱温箱和SCL-10Avp型控制器。其他设备还有Mettler AX-150型十万分之一分析天平、Heraeus Pico型台式离心机、Millipore Q型纯水机和Corning 320型pH计等。

雄性SD大鼠,体重 (200 ± 10) g,购于北京维通利华实验技术动物公司,动物许可证编号: SCXK。将大鼠随机分组,每组5只。CYP2E1高诱导大鼠处理: 大鼠于处死前20 h一次性灌胃20% 乙醇溶液5 mL·kg^-1。CYP3A4/5高诱导大鼠处理: 大鼠腹腔注射地塞米松磷酸钠100 mg·kg^-1 (20 mL·kg^-1),每日1次,连续4日^[8]。NBP给药大鼠处理: 大鼠灌胃给予160 mg·kg^-1 NBP (色拉油溶液,10 mL·kg^-1),每日1次,连续5日,或尾静脉给予20 mg·kg^-1 NBP (0.3% Tween-80,5 mL·kg^-1),每日1次,连续4日。溶剂对照组灌胃给予色拉油 (10 mL·kg^-1) 或尾静脉给予0.3% Tween-80 (5 mL·kg^-1)。

人肝微粒体购自上海瑞德肝病研究所,具备医学伦理批件,为10例中国人混合肝微粒体,蛋白含量为20 mg·mL^-1,批号SUBK。大鼠断头处死后取出肝脏样本,立即用冰生理盐水浸泡冲洗,采用差速离心法制备肝微粒体^[9],使用考马斯亮蓝法,以牛血清白蛋白作为标准蛋白进行肝微粒体蛋白浓度的测定^[10],使用Omura法测定肝微粒体中CYP450含量^[11]。配制标准曲线和质控样本所需失活微粒体由正常微粒体经煮沸制得。另取正常大鼠10只,按照上述方法分别制备肝微粒体。

分别取乙醇/地塞米松诱导组和正常大鼠肝微粒体蛋白1.0 mg,加入适当浓度的探针药物——氯唑沙宗和氨苯砜,使其终浓度分别为6和10 μmol·L^-1,以Tris-HCl缓冲液补充至0.9 mL,于37 ℃水浴中预温孵2 min后,加入NADPH发生系统0.1 mL继续温孵20 min,1 mL乙腈终止反应。测定孵育液中氯唑沙宗 (CYP2E1底物) 和氨苯砜 (CYP3A4底物) 的浓度,计算其代谢速率,并与正常组大鼠进行比较。

加入NADPH发生系统组: 取10只正常大鼠混合肝微粒体蛋白 0.5 mg,分别与不同浓度NBP工作液混合 (有机试剂比例小于0.5%),使NBP终浓度分别为25 μmol·L^-1 (大鼠) 和10 μmol·L^-1 (人),终体积为1 mL。以Tris- HCl缓冲液补充至0.9 mL,于37 ℃水浴中预温孵 2 min后加入0.1 mL NADPH发生系统。混匀并继 续温孵5 min,1 mL乙腈终止反应。无NADPH发生系统组: 操作同上,用0.1 mL Tris-HCl缓冲液代替NADPH发生系统。对照组: 使用失活肝微粒体,其他操作同加入NADPH发生系统组。测定孵育液中NB P浓度,并计算其代谢速率。

呋拉茶碱、磺基苯吡啶、噻氯吡啶、奎尼丁、戒酒硫和酮康唑是目前公认的CYP1A2、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4的选择性抑制剂。CYP2C9、2C19、2D6和3A4选择性抑制剂的影响: 取正常大鼠或人 肝微粒体蛋白1.0 mg,分别加入适当浓度工作液,使得1 mL孵育体系中各化合物的终浓度分别为: NBP 25 μmol·L^-1 (大鼠) 或NBP 10 μmol·L^-1 (人); 磺基 苯吡啶10 μmol·L^-1、噻氯吡啶10 μmol·L^-1、奎尼丁10 μmol·L^-1、酮康唑20 μmol·L^-1。混匀后以Tris-HCl缓冲液补充至0.9 mL,37 ℃水浴中预温孵2 min,加入NADPH发生系统0.1 mL继续温孵5 min (大鼠) 或15 min (人) 后,1 mL乙腈终止反应。

CYP1A2和2E1选择性抑制剂的影响: 取正常大鼠或人肝微粒体蛋白1.0 mg,分别加入适当浓度工作液,使得1 mL体系中各化合物的终浓度为: 呋拉茶碱10 μmol·L^-1、戒酒硫50 μmol·L^-1。混匀后以Tris-HCl缓冲液补充至0.9 mL,37 ℃水浴中预温孵2 min,加入NADPH发生系统0.1 mL继续温孵15 min,加入NBP工作液,使得其浓度为25 μmol·L^-1 (大鼠) 或10 μmol·L^-1 (人),37 ℃水浴中继续温孵5 min (大鼠) 或15 min (人),1 mL乙腈终止反应。测定孵育液中NBP浓度,并与不加入抑制剂的对照组 (加入相同体积溶剂) 进行比较,计算代谢速率抑制百分比。

取正常或CYP2E1和CYP3A1/2高表达大鼠肝微粒体蛋白0.5 mg,加入适当浓度工作液,使得1 mL体系中NBP终浓度为25 μmol·L^-1,其他温孵和浓度测定操作同“加入NADPH发生系统组”所述,比较NBP在正常和高表达组大鼠肝微粒体中的代谢速率,进一步确定参与NBP代谢的同工酶种类。

体外探针法是广泛采用的同工酶活性检测方法,非那西丁、双氯芬酸、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和氨苯砜是目前常用的CYP1A2、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4探针底物。CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6活性测定: 取正常大鼠或人肝微粒体蛋白1.0 mg,加入适当浓度NBP及探针药物工作液,使其终浓度分别为: NBP 1、10、50、200 μmol·L^-1 (大鼠) 或1、5、15 μmol·L^-1 (人); 探针药物浓度接近文献报道的K_m值,双氯芬酸4 μmol·L^-1、奥美拉唑10 μmol·L^-1、右美沙芬4 μmol·L^-1。混匀并以Tris-HCl缓冲液补充至0.9 mL,37 ℃水浴中预温 孵2 min后加入NADPH发生系统0.1 mL,继续温孵5 min,1 mL乙腈终止反应。

CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4/5活性测定: 采用Cocktail法进行上述3种探针药物的体外孵育。 探针药物浓度为: 非那西丁6 μmol·L^-1、氯唑沙宗6 μmol·L^-1、氨苯砜10 μmol·L^-1。反应时间为20 min^[12]。测定孵育液中各探针药物浓度,计算代谢速率,并与对照组 (不加入NBP工作液,只加入同体积溶剂) 比较各组代谢速率差异。

取NBP多次口服和多次静脉注射给药组、溶剂对照组大鼠肝微粒体蛋白1.0 mg,按照“加入NADPH发生系统组”所述方法进行温孵,测定孵育液中各探针药物的浓度,比较NBP给药组与溶剂对照组大鼠肝微粒体中探针药物代谢速率的差别,从而评价NBP体内对大鼠CYP450同工酶活性的影响。

法 色谱条件: 选用Waters公司Symmetry^® C₁₈色谱柱 (2.1 mm × 50 mm,5 µm),流动相由乙腈和0.1% 乙酸组成 (7∶3),流速0.2 mL·min^-1。质谱条件: 选用ESI离子源,在正离子电离模式下采用多反应监测 (MRM) 的质谱扫描方式检测,采用内标法定量NBP的浓度^[13]。

色谱条件: 选用Waters公司Atlantis^® C₁₈色谱柱 (4.6 mm × 100 mm,5 µm),流动相由45% 乙腈和55% 10 mmol·L^-1乙酸铵 (0.1% 甲酸) 组成,流速为1 mL·min& lt; sup>-1,分流比为1∶5 (v/v),进样量10 μL。质谱条件: ESI离子源,正负离子切换的电离模式,0～2.9 min进行正离子扫描、2.9～3.8 min进行负离子扫描、3.8～6.8 min进行正离子扫描、6.8～8.6 min进行负离子扫描。利用MRM质谱 扫 描 方式检测,内标法定量测定6种探针药物的浓度^[14]。

使用大鼠和人失活肝微粒体与NBP共同孵育,未见NBP代谢; 在无NADPH存在时,正常大鼠和人肝微粒体与NBP共同孵育后未见NBP代谢; 提示NBP代谢是依赖NADPH的酶促过程。

当大鼠和人肝微粒体反应体系中存在噻氯吡啶 (CYP2C19抑制剂)、戒酒硫 (CYP2E1抑制剂) 和酮康唑 (CYP3A4抑制剂) 时,NBP代谢明显受到抑制,其代谢速率分别下降了38.8%、86.2%、78.4% 和51.0%、92.0%、58.9%; 其余抑制剂对NBP代谢的 抑制作用较弱,抑制率均小于30%。故推测大鼠CYP2E1、3A1/2、2C11和人CYP2E1、3A4/5、2C19是主要参与NBP代谢的同工酶。各个抑制剂对NBP体外代谢的影响见表 1。

表 1(Table 1)

Table 1 Effect of CYP450s inhibitors on NBP metabolism in rats and human liver microsomes. Rat liver microsomes (n = 5); #Human liver microsomes (mixed with 10 individuals). NA: Not applicable; **P < 0.01 vs control group Metabolic rate/nmol·min-1·mg-1 (protein) Inhibition percentage of metabolic rate/% Rat Human# Rat Human# Control 1.16 ± 0.01 0.36 ± 0.02 NA NA CYP1A2 0.99 ± 0.02 0.29 ± 0.02 14.8 ± 2.1 20.0 ± 2.35 CYP2C9 1.13 ± 0.01 0.33 ± 0.06 2.5 ± 1.0 8.3 ± 2.07 CYP2C19 0. 71 ± 0.07** 0.18 ± 0.01 38.8 ± 5.8 51.0 ± 2.07 CYP2D6 1.10 ± 0.01 0.35 ± 0.02 4.6 ± 0.3 2.8 ± 0.61 CYP2E1 0.16 ± 0.04** 0.03 ± 0.01 86.2 ± 3.1 92.0 ± 7.50 CYP3A4/5 0.25 ± 0.05** 0.15 ± 0.01 78.4 ± 4.3 58.9 ± 0.98

Table 1 Effect of CYP450s inhibitors on NBP metabolism in rats and human liver microsomes. Rat liver microsomes (n = 5); #Human liver microsomes (mixed with 10 individuals). NA: Not applicable; **P < 0.01 vs control group

为进一步确认CYP450同工酶对NBP代谢的参与程度,本研究在测定CYP450同工酶选择性抑制剂对NBP代谢影响的基础上,又观察了NBP在高诱导大鼠微粒体中代谢速率的变化,进一步鉴定了参与NBP代谢的同工酶类型。实验结果表明,CYP450同工酶经典诱导剂乙醇和地塞米松可明显诱导大鼠肝微粒体CYP2E1和3A1/2的活性,分别为正常对照组的2.46倍和3.36倍 (P < 0.001,n = 5),与文献基本相符,提示高诱导体系制备成功。CYP2E1和3A1/2诱导大鼠肝微粒体中NBP的代谢速率分别为正常大鼠肝微粒体的1.26倍和1.69倍,P值分别< 0.01和< 0.001 (n = 5),进一步确证了CYP2E1和3A1/2参与NBP的代谢转化,具体结果见图 1。

图 1(Figure 1)

Figure 1 Metabolic rate of NBP in ethanol and dexamethasone induced rat liver microsomes (n = 5). **P < 0.01,***P < 0.001 vs control group

不同浓度NBP (大鼠: 1、10、50、200 μmol·L^-1; 人: 1、5、15 μmol·L^-1) 对大鼠和人肝微粒体CYP450主要同工酶的体外抑制作用结果见图 2。

图 2(Figure 2)

Figure 2 Effect of NBP on the activities of CYP450 isoenzymes in rats and human liver microsomes in vitro. A: Rat liver microsomes (n = 5); B: Human liver microsomes (mixed with 10 individuals). P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001 vs control group

与溶剂对照组比较,每日1次灌胃给予NBP 160 mg·kg^-1 (连续5日) 对大鼠肝微粒体CYP1A2和3A1/2无明显影响 (P > 0.05,n = 5),对CYP2C6、2C11、2D2和2E1具有轻微的诱导作用,代谢速率分别是对照组的1.40倍 (P < 0.01,n = 5)、1.13倍 (P < 0.01,n = 5)、1.14倍 (P < 0.05,n = 5) 和1.25倍(P < 0.01,n = 5)。每日1次尾静脉注射NBP 20 mg·kg^-1 (连续4日),虽然NBP对大鼠肝微粒体6个主要同工酶均未显示出明显影响 (P > 0.05,n = 5),但是对CYP2C11表现出轻微的抑制趋势,与体外抑制实验结果一致 (图 3)。

图 3(Figure 3)

Figure 3 Metabolic rate of probe drugs in liver microsomes of rats treated with NBP. A: ig 160 mg·kg-1 NBP; B: iv 20 mg·kg-1 NBP. n = 5,x± s. P < 0.05,**P < 0.01 vs control group

研究参与药物代谢的同工酶类型不但有助于深入了解药物的代谢稳定性、首过效应、确定遗传因素在药物代谢中的作用,还可以预测代谢产物类型、生物转化途径和可能发生的药物代谢性相互作用。由本研究可见,参与NBP代谢的大鼠和人肝CYP450同工酶类型相似,均由多个同工酶参与,与文献^[7]报道人CYP450重组酶的研究结果基本一致。上述结果提示,NBP发生基于CYP酶的药物相互作用的风险较低。

CYP450酶的重要特性之一就是可被诱导和抑 制,酶抑制作用约占全部药物相互作用的70%^[15]。本文在可预知的大鼠和人NBP血药浓度范围内,研究了该药对肝微粒体主要同工酶的抑制作用 (大鼠单剂灌胃给予高剂量160 mg·kg^-1和静脉注射给予高剂量20 mg·kg^-1 NBP后,血浆NBP峰浓度分别为40.5和183.2 μmol·L^-1)。从体外抑制实验的结果推测,大鼠口服NBP对肝脏CYP450同工酶没有明显抑制作用。当静脉给予高剂量NBP时,由于体内NBP浓度较高,对同工酶CYP1A、2C和2D可能存在一定抑制作用。大鼠体内实验结果与此推测吻合。健康受试者多次口服200 mg丁苯酞软胶囊和静脉滴注50 mg丁苯酞氯化钠注射液后,血浆NBP峰浓度分别为4.4和14.2 μmol·L^-1左右,基于体外抑制实验结果推测NBP连续口服给药时对各同工酶没有明显抑制作用,但当连续静脉给予较大剂量时,对CYP2C19可能存在一定抑制作用。另外,临床如将大剂量NBP与经CYP2C19代谢的其他药物合并使用时,可能发生的代谢性相互作用应值得医生关注。

本研究考察了NBP两种途径给药对大鼠肝微 粒体CYP450同工酶活性的影响。目前,国际上对如何评判药物对药酶具有诱导作用尚无限定的标准,一般情况下,如果实验药物的诱导能力为阳性对照药物的40%～50% 以上时,可认为对药酶具有诱导作用。从本文实验结果可以发现,每日1次灌胃给予NBP 160 mg·kg^-1 (连续5日) 条件下,NBP对大鼠肝微粒体CYP2E1的诱导程度轻微,远不及经典诱导剂。由于目前尚缺乏对同工酶CYP2C9、2C19和2D6特异性较好的诱导剂,因此,没能将相关数据与阳性药物进行比对,但根据类似实验的一般经验,如果实验药物对代谢速率诱导的程度提高0.5～1倍时,才认为有值得进一步关注的诱导作用,需要进行更深入的研究。因此,NBP& lt; span style='font-family:宋体; color:black'>对CYP2C6、CYP2C11和CYP2D2诱导作用的临床意义不大。

综上所述,本研究对丁苯酞与大鼠和人肝5种 主要CYP450同工酶的相互作用进行了评价。结果 提示,NBP在大鼠和人体内的代谢均由多个CYP450同工酶共同参与,大鼠NBP灌胃给药160 mg·kg^-1 (连续5日) 和静脉给药20 mg·kg^-1 (连续4日) 对大鼠肝微粒体主要同工酶不存在具有临床意义的诱导和抑制效应。当NBP人体外浓度达到15 μmol·L^-1时对CYP2C19存在抑制作用,在临床合并用药时由上述原因引发的药物代谢性相互作用应引起关注。