表皮生长因子受体家族 (epidermal growth factor receptor family,ErbB family) 在细胞生长、发育及分化过程中起着重要作用,其过量表达会导致细胞正常功能紊乱,常与肿瘤的发生发展密切相关,其中家族成员人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2,Her2/ErbB2) 的过表达与许多上皮细胞癌症的恶性化程度关系密切,Her2高表达肿瘤表现出极强的迁移性和浸润性、化疗药物敏感性差、愈后差、易复发等特点。近年来抗体药物以其高特异性、有效性和安全性等优势,在肿瘤、自身免疫病等重大疾病的治疗中取得突破,已成为全球医药产业中发展速度最快、潜力最大的领域之一。20世纪80年代Drebin等^{[1, 2]}发现Her2单克隆抗体对Her2过表 达肿瘤细胞有明显抑制作用,揭示了抗体在肿瘤治疗方面的潜力并大大推动了其研究进展。经过30余年的发展,目前已上市及临床在研的Her2抗体有20余株,包括单克隆抗体、双特异抗体及抗体偶联药物等。本文就Her2的结构功能及其抗体研究进展进行概述。

Her2属于人表皮生长因子受体家族,该家族由4个成员组成: EGFR、Her2、Her3和Her4^[3]。这些受体均位于细胞膜表面,具有相似的结构: 一个与配体结合的胞外区、一个单跨膜α螺旋跨膜区和一个由胞内近膜区、酪氨酸激酶催化结构域及富含酪氨酸起调节作用的C端尾部区域组成胞内区。其中胞外区又可以分为4个亚结构域I、II、III和IV区^[4],亮氨酸富含结构域I区和III区参与配体结合,半胱氨酸富含结构域II区和IV区则参与受体的二聚活化。其他成员受体的活化过程涉及: 配体诱导的受体胞外区变构、胞外区二聚化、跨膜区、胞内近膜区、酪氨酸激酶区变构、C端磷酸化等一系列受体结构变化及磷酸化过程。而Her2由于结构上采取一种不同于其他成员的开放式构象,因此一直处于活化状态且不具有可溶性特异配体。在正常细胞中Her2表达水平极低,但在胚胎发育期表达量很高,可以自发形成同二聚受体或配体诱导形成异二聚受体,触发信号转导网络^{[5, 6]},对细胞的增殖、分化、发育、黏附及迁移起重要的调节作用。在10%～34% 的乳腺癌、卵巢癌、胃肠道癌症和肺癌等多种癌症中都存在Her2基因扩增或过表达的现象,特别是在乳腺癌中,Her2已是公认的预测因子和治疗靶点。Her2另一个不同于其他成员之处在于内化性差。其他家族受体在细胞中存在配体依赖的内吞循环过程,并且维持平衡状态^{[7, 8]}。大量研究表明,ErbB受体家族可通过多种途径发生内吞,如泛素依赖、泛素非依赖、网格蛋白依赖的途径,这对于其介导的信号通路起着重要的调控作用。而由于结构上的特殊性,Her2具有不尽相同的内吞特征。研究表明,Her2主要定位于细胞表面,受体活化并不能导致其有效内吞,而这种内吞受损的性质决定于受体C端的胞内区结构域,也有可能是由于内吞的Her2无法有效地进入多泡体,从而循环回膜上,但具体机制目前仍不清楚。

靶向配体或细胞因子的抗体多通过阻断其与受体的结合来发挥作用,而靶向表面受体或蛋白的抗体作用机制较为多样,除阻断受体-配体相互作用外,还包括阻断受体活化所需的受体间或与共受体间的相互作用、结合肿瘤特异性抗原介导抗体依赖细胞 介导的细胞毒性作用 (ADCC) 和补体依赖细胞毒性 (CDC) 等效应杀伤肿瘤细胞,后者需要靶向抗原,具有较高的肿瘤特异性且不易发生内吞或从表面脱落。Her2兼具这两个特点,因此非常适于作为抗体 治疗的靶点。由于Her2不存在特异配体,因此其抗体主要通过阻断受体二聚活化和介导免疫系统杀伤效应来抑制肿瘤细胞。大量研究表明,抗体识别表位直接决定了其对Her2二聚化形式的影响^[9]。结合于一些表位的抗体起到类似配体的作用,促进Her2的同二聚活化; 结合于另一些表位的抗体会导致Her2内吞; 而结合于II区和IV区二聚化关键位点的抗体对其二聚活化具有明显抑制作用。目前已上市的Her2治疗性抗体曲妥珠单抗Trastuzumab和帕妥珠单抗Pertuzumab就属于最后一类。

1998年美国FDA批准了第一个用于Her2阳性转移性乳腺癌 (metastatic breast cancer,MBC) 临床治疗的单克隆抗体药物曲妥珠单抗 (Herceptin^®) 上市,该抗体是由识别Her2胞外区IV区近膜端表位的鼠抗4D5经人源化及亲 和力改造获得的人源化抗体,其抗原亲和常数可达0.1 nmol·L^-1。曲妥珠单抗作为乳腺癌治疗一线药物,尤其在Her2过表达转移性乳腺癌治疗中疗效显著,并可与多种化疗药物联用,抗体单用有效率为11%～36%,与铂类、多西他赛和长春瑞滨有协同作用,与阿霉素、紫杉醇和环磷酰胺有加和作用。但对于Her2低表达乳腺癌患者的疗效不佳,并且有相当一部分最初抗体治疗有效的患者会在使用1年内产生耐药性^[10],这可能与肿瘤细胞某些基因表达的改变导致抗体表位遮蔽或受体信号通路异常活化相关。此外,由于Her2表达于多种组织和器官,因此曲妥珠单抗的副作用也引起了人们的关注,常见的副反应如发热、恶心、腹泻、皮疹和头痛等,最重要的是其心脏毒性,单药治疗心功能及病理异常发生率为3%左右,而与蒽环类药物联用时发生率上升为26%～28% (显著高于单用蒽环类药物者的6.0%～9.6%)。2012年上市的帕妥珠单抗 (Perjeta^®) 是另一个经同样方式改造获得的人源化Her2抗体 (其鼠源抗体为2C4),与曲妥珠单抗共用同一可变区框架,识别Her2胞外区II区二聚化关键位点,是一种Her2二聚化抑制剂。对于晚期前列腺癌、非小细胞癌症、卵巢癌及乳腺癌等多项II期临床试验结果表明,帕妥珠单抗对多个适应症均有一定效果^[11],但其疗效仍与Her2表达水平相关,其安全性表现优于曲妥珠单抗,与非蒽环类等其他 药物联用不会增加其心脏毒性。

尽管这两个抗体均识别Her2二聚化相关的结构域,然而其作用机制却不尽相同。除具有ADCC等间接效应外,曲妥珠单抗倾向于抑制不依赖于配体的Her2同二聚化作用,对于其异二聚化基本没有影响,而且其肿瘤抑制活性依赖于抗体二价性,表明其肿瘤抑制作用并不是通过直接抑制Her2二聚化而实现的。而帕妥珠单抗则可直接抑制配体依赖的异二聚化作用,尤其是对于Her2/Her3异二聚活化有明显抑制作用,且这种作用不依赖于抗体二价性。此外,曲妥珠单抗可能的作用机制还包括: 诱导受体内吞、抑制DNA修复、阻断PI3K通路、活化p27^kip1诱导G1期停滞、促进肿瘤细胞凋亡和抑制受体胞外区脱落形成组成型活化胞内区p95等^[12]。

晶体学研究从分子水平揭示了两者作用机制上的差别。曲妥珠单抗识别位于IV区C末端由3个loop区 (557～561、570～573和593～603) 构成的空间表位^[13],由于受体二聚过程中该表位与二聚化受体接近或发生直接相互作用,曲妥珠单抗的结合可能通过空间位阻作用干扰Her2二聚化过程,此外抗体结合保护了易受蛋白酶攻击的位点,阻断了其对胞外区的切割。帕妥珠单抗识别表位位于II亚区中心的245～311区段,关键残基为H245、V286、S288、L295、H296和K311。其中L295、H296是介导Her2和Her3异二聚的关键位点,L295A/H296A双突变可完全阻断Her2/Her3的异二聚化^[14]。因此,帕妥珠单抗可以有效阻抑Her2/Her3异二聚体的形成,而对于EGFR/Her2异二聚体的抑制作用不太明显,这是由于其表位残基均暴露于EGFR/Her2异二聚体表面,且抗体垂直结合于异二聚体一侧,以致其不具有阻断或位阻效应^[15]。

最近研究表明,联合使用靶向不同表位的Her2抗体可以增强其肿瘤抑制作用,获得更好的协同效果。一项MBC III期临床研究中^[16],曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合治疗可延长无进展生存期6.1个月,且对于曲妥珠单抗无效或耐受的患者也表现出良好的临床效果,日前进行的欧洲肿瘤协会年会上罗氏公司公布的结果显示,帕妥珠单抗联合曲妥珠单抗和多西他赛将晚期乳腺癌患者的中位生存期从40.8个月延长至56.5个月,创造了晚期癌症生存期延长的纪录。两者的协同互补作用得益于其对Her2信号更全面的抑制,曲妥珠单抗对Her2同二聚具有抑制作用并可抑制其胞外区剪切形成组成型活化p95蛋白,结合帕妥珠单抗的Her2异二聚抑制作用,完全阻断了Her2介导的信号转导。此外有研究^[17]表明,两者单独使用时,对于细胞表面Her2的内吞、下调作用均不明显,而两者联用可以提高其内吞活性。与其他Her2抗体的联用也能够明显促进Her2的内吞,推测可能机制是由于抗体二价性可以诱导同二聚受体的形成,而多抗体同时处理易于在细胞表面形成更大的抗体受体复合物,复合物内吞效率与其大小成正比, 因此形成的复合物越大其内吞就越快,这为抗体抗肿瘤治疗提供了新的策略。

双特异抗体是将靶向两种不同抗原的抗体或抗体片段通过化学交联或基因工程技术偶联构成的新型抗体,可以同时识别两种抗原分子。由于第二抗原选择的灵活性、多样性,因而双特异抗体在单抗基础上极大扩展了其作用机制,是工程化抗体改造的重要方向。Her2靶向的双特异抗体可根据第二抗原分子的性质大致分为两类: 靶向免疫细胞表面特异抗原和靶向ErbB受体。

早期研究主要针对于同时靶向免疫细胞表面特异抗原的双特异抗体,如MDX-H210 (Her2×CD64)、ertumaxomab (Her2×CD3) 等^{[18, 19]},这些抗体可以同时结合Her2高表达肿瘤细胞和免疫效应细胞,促进了抗体介导免疫细胞的招募作用,增强了对肿瘤细胞的杀伤效应。近年报道的双特异抗体多针对ErbB家族受体,这类抗体同时靶向不同的E rbB受体或ErbB受体的不同表位,与联合使用多种ErbB抗体 效果相似,对ErbB受体二聚活化进行更全面的抑制。McDonagh等^[20]将识别Her2和Her3的单链抗体与人血清白蛋白进行融合,生成的MM-111可与Her2及Her3形成三聚体复合物,有效抑制H er3信号通路,展示出明显的抗肿瘤活性,但其活性依赖于Her2的过表达。该抗体与其他Her2抗体或小分子抑制剂联用可进一步提高抑制活性,且人血白蛋白成分可延长其体内半衰期,因此具有良好的成药前景。郭亚军研究组^[21]通过轻链置换及“knob into hole”技术对曲妥珠单抗和帕妥珠单抗进行改造,将两者结合构建成双特异抗体 (TPL),该抗体保留了原始抗体的抗原结合活性,药代动力学等性质也与传统抗体相当,但其阻断Her2二聚化的能力优于两种抗体的联用,尤其是对于曲妥珠单抗产生耐药性的乳腺癌细胞株,TPL的生长抑制活性明显优于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联用,推测其可能是通过空间位阻作用广泛阻抑Her2形成各种形式的二聚体,进而完全阻断以其为核心的ErbB受体信号网络。

尽管双特异抗体在功能上具有明显的优势,但其生产工艺及产物纯化过程远比单抗复杂,放大工艺还有待研究。Bostrom等^[22]开发出一种新型双特异抗体,不需将两种不同抗体进行结合,而是将一种抗体改造为可特异识别两种不同抗原分子的“二合一”抗体,从而解决了工艺复杂的问题。自然存在的抗体很多可以结合另一种抗原,只是这种结合并不稳定,研究人员利用这一点通过突变获得了可同时识别Her2和血管内皮生长因子 (VEGF) 的单抗bH1,经亲和力改造后其Her2和VEGF的亲和力分别达到0.2和3 nmol·L^-1。研究者以曲妥珠单抗为基础,针对轻链构建了随机突变库,从中筛选出能够同时识别Her2和VEGF的抗体,该抗体保留了曲妥珠单抗的活性,同时还可阻断VEGF与其受体的结合。进一步研究发现,该抗体的重链和轻链分别主导了与Her2和VEGF的结合,亲和力改造后的抗体在体内体外对于Her2介导和VEGF介导的肿瘤细胞增殖均有明显的抑制活性。该抗体具有多机制协同效应,为曲妥珠单抗耐药性的克服提供了一种新的策略。此外,该抗体适用于Her2阳性及阴性肿瘤的治疗,拥有更广的临床适用范围。“二合一”抗体的开发对抗体只能特异识别一种抗原的传统观点提出了挑战,为工程化抗体开拓了新的领域。

早在100多年前,德国免疫学家保罗欧立希就提出了单克隆抗体的“黄金子弹”学说,即利用单克隆抗体对抗原的特异性结合实现小分子药物对癌细胞的靶向给药,也就是抗体偶联药物的雏形,然而由于接头和小分子药物的局限,使该类药物发展较为缓慢。随着近年在以上两方面技术的快速发展,抗体偶联药物 (antibody-drug conjugate,ADC) 概念真正为人们所认识。迄今为止,FDA前后共批准了3个ADC药物,第1个是2000年上市的靶向CD33,用于治疗急性髓系白血病的Mylotarg,然而由于其接头技术仍不成熟,导致该药物脱靶率较高,产生的副作用较强,因此于2010年退市。另外两个药物分别是靶向CD30的Adcetris和Her2的Kadcyla^[23],这两个药物真正解决了接头技术,并获得了临床上的巨大成功,应答率和疗效显著高于传统抗体单药及联合用药的治疗方案,并且表现出更好的安全性,这两个药物真正开启了抗体药物的ADC时代。

ADC药物是一类利用接头 (linker) 将单克隆抗体和效应分子连接为整体的药物。当单克隆抗体与肿瘤靶点结合后,ADC药物进入肿瘤细胞,在细胞内裂解 (方式依接头性质而不同) 释放效应分子并引起肿瘤细胞凋亡。ADC药物高效肿瘤杀伤效应直接依赖于其是否能够特异、有效地进入肿瘤细胞及随后的小分子药物有效释放,目前的接头技术已经有效解决了小分子药物的释放问题,因此前者就成为制约ADC药效的最关键环节。ADC的特异性和内吞效率与其识别肿瘤抗原的性质和抗体自身的性质直接相关,例如Adcetris由作用于CD30的Brentuximab和微管蛋白抑制剂vedotin偶联而成,Adcetris结合肿瘤特异表达的CD30后迅速内吞进入细胞,其使用的可降解接头在胞内酶的作用下被切断,从而实现效应分子与抗体的分离。基于这种作用机制,进一步发展了XDC (X-drug conjugates) 概念,即具有靶向肿瘤特异抗原或特异受体、且能被有效内吞入肿瘤细胞的分子均可以作为小分子药物的靶向转运载体,如基于TRAIL构建的TRAIL-MMAE^[24]。

然而Kadcyla与Adcetris的机制似乎不同。首先,Her2是一种不易发生内吞的表面抗原。尽管有些抗体能够促进Her2的内吞,然而实验表明曲妥珠单抗不能有效促进Her2内吞或内吞后又快速循环到细胞膜表面,这预示着曲妥珠单抗可能不是针对Her2阳性肿瘤最有效的药物转运载体。其次,Kadcyla使用的接头不同于Adcetris的自消接头,而是一种稳定的共价偶联,这就要求ADC药物有效地被选入溶酶体进行充分降解才能有效地释放活性小分子药物,这无形中增大了药物起效的难度,这可能是该接头技术在很多抗体均未获得成功的原因。Kadcyla的成功可能部分由于曲妥珠单抗识别位点极其靠近细胞膜表面,同时又不易发生内吞,这将小分子药物稳定靶向于肿瘤细胞膜附近,通过一种类似EDC (extracellular drug conjugate,一种不需要内化、协同作用于细胞表面的抗体偶联药物) 的机制产生肿瘤细胞破坏作用。Junttila等^[25]发现Kadcyla保持了较高的ADCC活性,而同样采用IgG1型抗体偶联Adcetris的ADCC效应则很弱,这也从侧面反映了Adcetris的内吞效率高,位于细胞表面的抗体数量少,而Kadcyla内吞效率低导致其在细胞表面的聚集。

对ADC药物作用机制的分析可以看出,内吞性抗体单独使用时由于较高的内吞效率,致使其ADCC和CDC的效应相应受到影响,但却适合作为ADC载体进行使用。刘兢研究组^[17]报道了一株嵌合抗体A21,在体内和体外能够有效地抑制Her2阳性肿瘤的生长,且与化疗药物具有较好的协同性。细胞实验结果表明,该抗体具有极强的内吞活性 (比曲妥珠单抗高2倍以上)。复合物晶体研究表明,该抗体的识别表位不同于帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的识别表位,位于二聚界面反向的I/II区交界位置,并不影响Her2的二聚体形成和活化,推测可能是通过促进其内吞降解,调节细胞表面受体水平、抑制肿瘤生长,目前基于该抗体的ADC药物研究正在进行。

近年来,基于抗体的肿瘤靶向治疗获得了长足的进步,患者生存率及中位生存期显著提高,以曲妥珠单抗为代表的Her2抗体成为最成功的实体瘤治疗典范。目前以Her2为代表的ErbB受体仍是非常重要的肿瘤治疗靶点,尽管随着抗体技术的发展,针对这些受体的特异抗体及治疗策略不断推陈出新,然而由于抗体的细胞、组织渗透性差等自身性质及肿瘤细胞微环境的影响,抗体对于实体瘤的治疗效果仍差强人意,该领域的突破有待于未来更多新靶点的发现、新技术的创造和新思路的开拓。