人类细胞色素P450 (CYP450) 酶中的CYP2D6主要在肝脏中表达,含量虽比其他CYP450亚家族低,但参与了市场上20%～25% 临床药物的代谢,包括精神安定药、抗心律失常药、镇痛药、抗抑郁药、止吐药以及一些抗癌药等^[1]。虽然CYP2D6代谢的底物性质各不相同,但他们几乎都在距氧化位点0.57 nm有一个氮原子^[2]。对CYP2D6酶活性的影响,比如遗传因素、年龄、身体状况、饮食习惯、联合用药等,可导致该酶活性的降低或增高,从而影响其底物药物的代谢而发生药物相互作用。

冰片是传统中药,具有开窍醒神、清热止痛的功效,广泛用于临床,尤其是心脑血管疾病。2010年版的中国药典中收录含有冰片的成药有20余种,如安宫牛黄丸、复方丹参滴丸、牛黄降压丸等。近年来有许多文献报道冰片不仅能明显松弛细胞间紧密连接,抑制细胞膜P-糖蛋白 (P-gp) 功能,影响双分子层脂质膜的渗透性^[3,4,5],还可促进其他药物进入各种生物脂质膜,如皮肤^[6]、血脑屏障^[7,8]、角膜^[9]、肠道上皮膜^[10,11]等。随着冰片联合用药应用越来越广泛,其可能带来的药物相互作用风险也随之增大。目前关于冰片对肝脏CYP450酶活性的影响鲜有报道。本文以Wistar雄性大鼠为实验动物,研究了冰片连续灌胃给药一周对大鼠肝脏CYP2D表达与活性的影响,研究结果为冰片的临床合理用药提供了有益参考。

SPF级6周龄Wistar雄性大鼠,体重200～250 g,湖北省实验动物研究中心提供,许可证号: SCXK (鄂) 2008-0005。

合成冰片 (中国Alfa Aesar公司,含量≥ 98%); 右美沙芬 (英国LKT Laboratories公司); 去甲右美沙芬 (加拿大Toronto Research Chemicals公司); 硝西泮 (中国食品药品检定研究院); 质谱纯甲醇、乙腈 (德国Merck KGaA公司); TRIZOL (美国Ambion公司); 琼脂糖 (美国Gibco^TM Invitrogen Corporation公司); 分析纯焦碳酸二乙酯 (DEPC)、Tween 20和质谱纯甲酸 (美国SIGMA公司); RIPA裂解液、显影液、定影液和6x SDS上样缓冲液 (中国碧云天公司); 脱脂奶粉 (中国内蒙古伊利集团股份有限公司); 逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒 (中国东洋纺上海生物科技有限公司); PCR引物 (中国上海桑尼生物科技有限公司); 小鼠抗β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology Inc.公司); 兔抗大鼠CYP2D1抗体 (英国Abcam公司); 山羊抗兔荧光标记抗体 (美国KPL公司); PVDF膜(美国Merck Millipore公司)。

LCMS-8040三重四极杆液相色谱质谱联用仪,包括LC-20A泵,SIL-20A_HT自动进样器,CTO-20A柱温箱,DGU-20A_3R脱气机和Lab Solustion数据处理系统 (日本SHIMADZU公司)。BIO-RAD iMARKTM酶标仪、CFX Connect^TM实时荧光定量PCR仪 (美国BIO-RAD公司); Alpha Imager 2000凝胶成像分析仪及软件 (美国Alpha Innotech公司); DYY-6C型电泳仪、DYC-40A型垂直电泳槽和DYC-40A电转仪 (中国北京市六一仪器厂)。

雄性Wistar大鼠随机分为低、中、高剂量 (33、100和300 mg·kg^-1·d^-1) 冰片 (混悬溶于0.5% CMC-Na溶液中) 给药组和对照组 (灌胃等体积0.5% CMC-Na溶液),每组6只。大鼠给药剂量参考中国药典规定的人口服冰片剂量 (0.15～0.3 g/60 kg体重),根据人和大鼠体表面积比例换算得到。给药前大鼠禁食12 h,每日于同一时间点灌胃给药 (灌胃体积小于2.0 mL),连续给药7天。末次给药后1 h处死大鼠,取出肝脏组织,用预冷的生理盐水冲洗后擦干,-80 ℃保存备用。

雄性Wistar大鼠随机分成冰片预给药组和对照组,每组6只。预给药组连续灌胃高剂量冰片7天后,静脉注射等体积右美沙芬 (8mg·kg^-1) 一次; 对照组灌胃等体积0.5% CMC-Na溶液7天后,静脉注射等体积右美沙芬 (8mg·kg^-1) 一次。给药后于10、30、60、120、180、300、480、600和720 min眼眶取血约0.4 mL,置肝素钠处理过的离心管中,4 ℃、3 500 r·min^-1离心10 min取血浆,-80 ℃保存备用。

采用CaCl₂沉淀法制备每只大鼠肝微粒体^[12]。以大鼠肝微粒体温孵体系中CYP2D探针底物右美沙芬的代谢产物 去甲右美沙芬的生成量表示CYP2D活性。温孵反应体系包括大鼠肝微粒体蛋白0.25 mg·mL^-1、MgCl₂ 5 mmol·L^-1、PBS 0.1 mol·L^-1、右美沙芬2.5 µmol·L^-1,总反应体积0.5 mL。37 ℃预温孵3 min后,加入 1 mmol·L^-1 NADPH启动反应,25 min后加入乙酸乙酯0.8 mL终止反应,并于10 000×g离心10 min取上清液。上清液经真空冷冻挥干,残余物用流动相600 µL复溶后进LC-MS检测^[13]。色谱条件: Shim-pack Column Holder保护柱 (2 mm × 5 mm,4.6 µm); SHIMADZU VP-ODS柱 (2.0 mm × 150 mm,4.6 µm); 以含0.1% 甲酸的水溶液 (A相) 和甲醇 (B相) 为流动相进行线性梯度洗脱,梯度洗脱程序为: 0～5 min,35% → 75% B; 5～6 min,75% B; 6～12 min,35% B; 流速0.2 mL·min^-1; 柱温40 ℃; 进样量10 µL。质谱条件: 雾化器3 L·min^-1; 干燥气15.0 L·min^-1; 离子喷雾电压4.5 kV; 碰撞气压力230 kPa; DL管温度和加热模块温度分别为250 ℃和400 ℃。扫描方式为多反应检测 (MRM),去甲基右美沙芬定量分析的离子对为m/z 258→157,Q1预杆电压 -17.0 V,碰撞能量 -39.0 V,Q3预杆电压 -29.0 V。

每只大鼠称取肝组织100 mg,按Trizol试剂盒说明书提取各组总RNA。用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,用核酸蛋白测定仪检测RNA的纯度。取100 µg总RNA按照东洋纺逆转录试剂盒说明稀释后逆转录成cDNA,-20 ℃保存备用。

从基因库中获取大鼠GAPDH与CYP2D1基因 序列,并用Primer 5.0分析软件设计引物序列如下: GAPDH (GenBank No.: NC_005103.4): Forward AGG GCTGCCTTCTCTTGTGAC,Reverse TGGGTAGAAT CATACTGGAACATGTAG; CYP2D1 (GenBank No.: NC_005106.4): Forward ACGCATCACGAGTTGTAC ATT,Reverse AGACGGTCTCATCCTTCAGCAC。定量PCR实验条件为: 94 ℃变性15 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 ℃,38个循环,反应体系为20 µL。基因表达水平的比较采用2^-ΔΔCt法计算^[14]。

将肝组织加入裂解液中冰浴匀浆,离心取上清液检测样品蛋白含量。 蛋白 (70 μg) 经10% 分离和4.5% 浓缩SDS- PAGE后转移到PVDF膜上,用5% 的脱脂牛奶封闭1.5 h后与一抗 (小鼠抗β-actin单克隆抗体,1∶1 000稀释; 兔抗大鼠CYP2D1抗体,1∶1 000稀释) 温孵过夜。洗涤后与二抗 (山羊抗兔荧光标记抗体,1∶5 000稀释) 温孵1.5 h。使用ECL化学发光液显影定影后,根据扫描条带大小与强度分析蛋白表达情况。

每只大鼠每个时间点取血浆100 µL,加入内标溶液硝西泮 (1 mmol·L^-1) 10 µL和乙酸乙酯200 µL,漩涡混合3 min,12 000 r·min^-1离心 10 min取上清液100 µL,经真空冷冻挥干后用流动相500 µL复溶,进LC-MS检测右美沙芬含量。右美沙芬定量离子对为m/z 272→171,Q1预杆为 -19.0 V,碰撞能量为 -39.0 V,Q3预杆为 -17.0 V。内标硝西泮定量离子对为m/z 282→236,Q1预杆为 -17.0 V,碰撞能量为 -39 V,Q3预杆为 -19 V。其他同上述去甲基右美沙芬检测条件。绘制血浆中右美沙芬平均药时曲线,利用DAS 3.0软件 (中国药理学会数学药理专业委员会) 采用非房室模型分析右美沙芬的药动学参数。

根据考察结果,本方法对血浆中右美沙芬、大鼠肝微粒体中去甲基右美沙芬的检测线性关系良好,日内和日间相对回收率在98%～110% 之间,标准偏差RSD值均在±10% 以内。

大鼠灌胃给药后按钙沉淀低速离心法制备肝微粒体,以大鼠肝微粒体温孵体系中CYP2D探针底物右美沙芬的代谢产物去甲基右美沙芬的生成量表示CYP2D活性,结果见表 1。

表 1(Table 1)

Table 1 Effect of borneol on CYP2D activity in RLM in vivo (n = 6,x± s). P < 0.05,**P < 0.01 vs control Item Control Borneol (33 mg·kg-1·d-1) Borneol (100 mg·kg-1·d-1) Borneol (300 mg·kg-1·d-1) Activity/pmol·mg-1·min-1 100 ± 24.5 171.1 ± 32.4 197.1 ± 29.2** 289.3 ± 66.7**

Table 1 Effect of borneol on CYP2D activity in RLM in vivo (n = 6,x± s). P < 0.05,**P < 0.01 vs control

大鼠灌胃给药后按大鼠血浆处理方法制备样品,检测右美沙芬的浓度,以时间 (t) 为横坐标,血药浓度 (C) 为纵坐标,绘制平均药时曲线见图 1。采用非房室模型经DAS3.0软件分析,右美沙芬的主要药动学参数见表 2。

Figure 1 Mean dextromethorphan concentration-time curves of rat plasma after intravenous administration of dextromethorphan (8 mg·kg-1) to control (△) and borneol-pretreatment rats (■). n = 6,x± s

表 2(Table 2)

Table 2 Pharmacokinetic parameters of dextromethorphan in control and borneol-pretreatment rats after intravenous administration of dextromethorphan (8 mg·kg-1). n = 6,x± s. **P < 0.01 vs control Variable Control Borneol (300 mg·kg-1) Cmax /mg·L-1 217.7 ± 16.3 194.9 ± 39.4 t1/2 /h 2.1 ± 1.2 1.8 ± 0.3 AUC0-t /ng·h·mL-1 425.5 ± 29.7 308.4 ± 67.2** AUC0-∞ /ng·h·mL-1 427.1 ± 29.8 310.8 ± 67.5** Vz/F /L·kg-1 55.3 ± 31.64 68.1 ± 20.6 CL/F /L·h-1·kg-1 18.8 ± 1.3 26.5 ± 4.6** MRT0-t /h 1.9 ± 0.3 1.8 ± 0.1 MRT0-∞ /h 1.9 ± 0.3 1.9 ± 0.1

Table 2 Pharmacokinetic parameters of dextromethorphan in control and borneol-pretreatment rats after intravenous administration of dextromethorphan (8 mg·kg-1). n = 6,x± s. **P < 0.01 vs control

与对照组相比,冰片预给药组右美沙芬的达峰浓度C_max (mg·L^-1) 和曲线下面积AUC_0-∞ (ng·h·mL^-1) 分别减少了10.6% (P > 0.05) 和27.5% (P < 0.01),清除率CL/F (L·h^-1·kg^-1) 和表观分布容积V_z/F (L·kg^-1) 增大了41.1% (P < 0.01) 和23.1% (P > 0.05)。结果表明冰片预给药对右美沙芬大鼠体内药动学有明显影响,且主要发生在消除相,即冰片预给药能增加CYP2D探针底物右美沙芬的体内清除。

给大鼠灌胃低、中、高剂量冰片7天后,荧光定量PCR检测大鼠肝脏CYP2D1 mRNA的表达量 (图 2)。结果表明,给药后CYP2D1 mRNA的表达量较空白组上调作用不明显 (P > 0.05),且无剂量依赖性。

Figure 2 Effect of borneol on CYP2D1 mRNA expression after oral administration of borneol (33,100 and 300 mg·kg-1·d-1) for seven consecutive days (n = 6,x± s)

给大鼠灌胃低、中、高剂量冰片7天后,Western blotting检测大鼠肝脏CYP2D1的蛋白表达量 (图 3)。结果表明,冰片对大鼠肝脏CYP2D1蛋白的表达没有明显影响。

Figure 3 Effect of borneol on CYP2D1 protein expression after oral administration of borneol (33,100 and 300 mg·kg-1·d-1) for seven consecutive days

冰片连续灌胃给药7天对大鼠肝脏CYP2D1 mRNA和蛋白的表达没有明显影响,但对CYP2D活性有明显诱导作用。体内药动学研究表明,冰片预给药一周能显著加速CYP2D探针底物右美沙芬的体 内清除,表明冰片预给药可以诱导大鼠肝脏CYP2D活性。

大鼠CYP2D1主要存在于肝脏、小肠和脑组织中^[15,16],是大鼠与人CYP2D6同源性最高的一种酶^[17]。人脑中CYP2D6的表达模式^[18]不同于龋齿类动物^[19]。吸烟者脑部CYP2D6的表达与活性均高于不吸烟者,且尼古丁能诱导猴大脑中CYP2D的表达与活性,但对大鼠和猴肝脏中CYP2D的表达与活性却无明显影响,可能尼古丁对CYP2D的调控源于转录后修饰,亦有可能尼古丁对肝外CYP2D的调控方式不同于肝内^[20]。虽然人肝CYP2D6很难被其他CYP450亚型酶诱导剂 (如苯巴比妥) 诱导^[21,22],但缬草和银杏提取物可以诱导人原代肝细胞CYP2D6活性^[23]。研究表明CYP2D的转录可能被核激素受体 (NHR) 表达、NHR配体活性改变或表观遗传调控^[24,25]。CYP2D mRNA表达水平的降低与几种NHR (如RARa、RXRa、HNF1和HNF3b) mRNA的水平一致,但与通常调控CYP450酶的NHR (如PXR、CAR和HNF4a) 的mRNA水平不一致^[26]。

本实验发现冰片诱导了大鼠肝脏CYP2D活性,但对其mRNA和蛋白表达水平却没有显著影响,这可能是因为CYP2D是肝药酶中最具有遗传多态性 的代谢酶^[27],冰片对大鼠肝脏中不同CYP2D亚型酶 (如CYP2D1和2D2等) 的影响不同所致; 也可能是由于本文检测的表达是CYP2D1,而活性检测的是CYP2D所致。同时,实验结果也提示冰片对大鼠肝脏CYP2D的调控可能主要在转录后水平^[19]。由于人肝脏CYP2D6参与了市场上20%～25% 药物的代谢,冰片对大鼠肝脏CYP2D活性的诱导作用,提示当冰片与CYP2D底物药物共用时,可能存在发生代谢性相互作用的风险。但人和大鼠存在种属差异,本研究结果并不能代表冰片对人肝脏CYP2D6活性的影响,还需利用人源性原代肝细胞等进一步研究冰片对人肝脏CYP2D6表达与活性的影响,才能更加准确预测冰片与CYP2D底物药物联合应用的临床安全性。